Name: Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprenda a isolar células imunes renais de forma confiável e econômica para citometria de fluxo multicolorida. Este método extrai suspensões celulares viáveis em quantidades adequadas para análise imunobiológica.

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Este trabalho é apoiado por uma bolsa de pesquisa da Dialysis Clinics Inc. e da University of Missouri Research Board Grant.

Todos os passos de protocolo realizados foram revistos e aprovados pela Universidade de Missouri Animal Care e do Comitê Use (ACUC). Para este protocolo, foram utilizados ratos machos C57BL / 6 machos com idade de 15 semanas, embora teoricamente qualquer roedor em qualquer idade pode ser utilizado para experiências. Uma vez que, esta é uma cirurgia não sobrevivência, a eutanásia é conseguido por exsanguinação e pneumotórax bilateral. 1. Perfusão dos Rins Nota: A perfusão de órgãos tais como coração, fígado e rim remove o sangue que possam interferir com a interpretação dos dados. Assim, se possível, sempre perfundir os órgãos. <ol><li> Posicione o mouse em uma isoflurano (3 ml / min) câmara de indução até que seja imóvel. Em seguida, remova o mouse para fora da câmara, colocá-lo dorsal na mesa de dissecação e coloque o cone isoflurano no nariz mouse e empurrar isoflurano a uma taxa de 1,5 ml / min através do regulador. </li><li> Confira os respons toe pitadae com uma pinça para avaliar se o animal ter atingido um plano cirúrgico de anestesia. Limpe o abdômen ventral com solução salina e cortar abrir o abdômen com uma tesoura e empurre os órgãos abdominais (fora do campo cirúrgico) para o lado esquerdo do mouse. </li><li> Recolha de sangue a partir da veia cava inferior, com uma agulha de calibre 25-fixo a uma seringa de 1 cc e adicioná-lo para um tubo de microcentrífuga de 1.5 ml contendo 10 ul de 0,5 M de EDTA. Nota: A coleta de sangue é opcional. O plasma pode ser utilizado para medições bioquímicas. Os leucócitos podem ser utilizadas para ensaios de citometria de fluxo. </li><li> Com uma tesoura, faça um pequeno corte nos átrios direito para deixar sair a mistura de sangue e PBS a partir da próxima etapa. </li><li> Dê uma seringa de 50 cc e encher com PBS gelado (20-30 cc). Em seguida, anexar uma agulha G 21-25 à seringa, perfurar o ventrículo esquerdo em seu ápice (enquanto segura o coração delicadamente entre fórceps) e, lentamente, perfundir do ventrículo esquerdo com tampão fosfato pH 7,4 solução salina (PBS) durante o cursode 1-2 minutos. Nota: O coração blanches imediatamente após os primeiros mililitros de perfusão. Observar o fígado para o branqueamento, como isso indica que a drenagem está a perfusão de sangue para fora do fígado através de retorno venoso através da veia cava. Além disso, certifique-se de que os pulmões não estão se expandindo durante a infusão, pois isso indica punção do ventrículo direito. Se os pulmões foram para expandir, retirar a agulha ligeiramente para trás para o ventrículo esquerdo e continuar a perfusão. O tempo levado desde a primeira incisão até que a eutanásia é conseguido é inferior a 2 min </li></ol> 2. Dissecção da Rins <ol><li> Após a perfusão for concluída, usar tesouras e pinças para dissecar o rim direito aos seus anexos (vasos sanguíneos, gordura e glândulas supra-renais) e sobre o consumo. </li><li> Remova cuidadosamente a cápsula que cobre o rim através do corte e dissecando com uma pinça. Pesa-se o rim. Nota: Pesando o rim é opcional. No entanto, algumas experiênciaspode resultar na alteração do tamanho / peso, que pode ser usada para normalizar rendimento das células por grama de tecido renal. </li><li> Depois de pesar o rim, colocá-lo em 1 ml de meio RPMI-1640 contendo FBS a 0,5% ou citometria de fluxo solução tampão de coloração (50 ml de rosca cónica de tubo de tampa) e colocar o tubo em gelo até à sua utilização. Nota: Para facilidade de descrição, vamos descrever o resto do isolamento das células do sistema imunológico na citometria de fluxo solução tampão de coloração. Além disso, iremos descrever o isolamento de células do sistema imunológico de um único rim, embora ambos os rins ou 1 + 1/3 Rd dos rins podem ser usados ​​dependendo das experiências a jusante (opcionais). 1/3 do rim poderia ser congelada para experiências de proteína / ARN e 1/3 podem ser colocados nos buffers para microscopia de imuno-histoquímica ou de transmissão de electrões. </li></ol> 3. A homogeneização dos Rins <ol><li> Rotular um 5-80 ml saco de capacidade de homogeneização com a amostra de dados de identificação,remover o filtro para dentro (STR) e descartá-lo. Encher o saco com 5 ml de solução gelada de Citometria de Fluxo A coloração Tampão e transferir para o buffer de rim. Repita esse processo para uma segunda amostra ou mais amostras que precisam de processamento. </li><li> Dobrar o saco de homogeneização no meio, de tal modo que uma metade tem o rim submerso na solução de tampão de citometria de fluxo de coloração e a outra metade é simplesmente dobrada sobre ela. </li><li> Ligue o homogeneizador de tecidos e configurá-lo para rápida (configuração) rpm. Coloque o saco de homogeneização dobrado com o rim de frente para a parede, perto da borda inferior, mas certifique-se a extremidade inferior dos sacos não estão deslizando abaixo da borda inferior das pás. <ol><li> Processar a segunda amostra, simultaneamente, como há 2 pás. Selecione o tempo como 120 segundos. Observe as pás se mover para trás e para homogeneizar os rins. Nota: Entretanto, este tempo de inactividade pode ser usado para preparar mais duas renal (ou outro tecido) amostras enquanto os dois primeiros são o processamento. </li></ol&gt; </li><li> Depois de completar com o primeiro conjunto de homogeneização, transferir os sacos de gelo e recarregar o homogeneizador de tecido com o próximo conjunto de amostras e assim por diante. Visualmente garantir que os rins são adequadamente homogeneizada e há pedaços grandes são visíveis. Nota: Em geral, durante 2 min com o homogeneizador de tecidos em rápida rpm é adequada para o rim. </li><li> Coloque um filtro de células de 100 um para o tubo de 50 ml em gelo. Em seguida, pipeta-se o homogeneizado completamente para o filtro de células. Situado numa centrífuga andar a 50 xg durante 1 min a 4 ° C e carregar as amostras para a centrífuga. Nota: A centrifugação vai assegurar que todos os homogenatos (contendo células) ter passado através do filtro de células. </li><li> Retire os tubos da centrífuga e colocá-los novamente em gelo. Elimine os filtros de células e manter o homogeneizado. Adicionar um volume igual (~ 6 ml) de tampão de lise 1x RBC para a pelete de células / sobrenadante e pipeta cima e para baixo várias vezes para fazer uma suspensão de células uniforme. Visually, observar alguma da cor vermelha na diminuição suspensão imediatamente. Deixe os tubos em gelo durante 5 min para atingir o máximo de lise RBC. Nota: o passo de lise RBC pode ser ignorado se o investigador está confiante da perfusão renal e menos manipulação de células é desejada. Temos observado um aumento significativo no rendimento de células de rim, não sujeitando a suspensão de células a lise de glóbulos vermelhos. </li><li> Girar os tubos na centrífuga que tenha sido definido a 500 xg, a 4 ° C durante 5 minutos para formar um sedimento celular. Nota: Durante as etapas 3.6 e 3.7, se preparar para sílica coloidal (Percoll) com base gradiente de densidade de centrifugação. <ol><li> Tome 10 ml redondas tubos de polipropileno de fundo e rotulá-los com números de amostragem correspondentes e colocá-los num suporte de tubos. Nota: O seguinte descreve como fazer reagentes gradiente de densidade suficiente para 4 amostras de rim. </li><li> Tome 7 ml de solução de Citometria de Fluxo A coloração de buffer e pipeta-lo em um tubo de 15 ml. Adicionar 1 ml de sacarose a 2 Mpreparar a 0,25 M de sacarose. </li><li> Em seguida, tomar 7,2 ml de reagente de gradiente de densidade e pipeta-lo em outro tubo de 15 ml. Adicionar 1,55 ml de solução tampão de citometria de fluxo de Coloração e 1,25 ml de 2 M de sacarose para preparar a 72% de reagente de gradiente de densidade e 0,25 M de sacarose. </li><li> Pipeta de 1 ml de 72% de reagente de gradiente de densidade em uma única rodada tubo de polipropileno de fundo para cada amostra. </li></ol></li></ol> 4. Centrifugação Gradiente <ol><li> Após o passo 3.7, tirar os tubos de fora e suavemente decantar o sobrenadante em um movimento suave e também decantar a próxima gota de líquido que se forma quando o tubo é realizada de cabeça para baixo. Nota: Este passo é importante, uma vez deixando para trás o excesso de líquido pode mudar o gradiente de densidade suficiente para criar variação nos rendimentos. Quando o tubo é um retrocesso na posição vertical, ~ 200-300 mL de líquido permanece com o pellet celular. </li><li> Pipeta de 1 ml de 0,25 M de sacarose para o pellet celular e suavemente, mas vigorosamente pipeta cima e para baixo para bring para as células de uma suspensão uniforme. Em seguida, adicionar a suspensão de células a 1 ml de 72% de reagente de gradiente de densidade (3.7.4) e mais uma vez pipetar vigorosamente para misturar as células para formar um reagente de gradiente de densidade de 36%. </li><li> Tomar 1 ml do reagente de gradiente de densidade de 72% para um polipropileno Pasteur (transferência) da pipeta. Com uma pressão uniforme sobre o bolbo (mantém a coluna de líquido na ponta e impede a formação de bolhas), inserir a pipeta de Pasteur para a parte inferior da suspensão de células (36% de reagente de gradiente de densidade) suavemente e descarregar o reagente de gradiente de densidade de 72% para formar uma camada mais pesada distinta. </li><li> Escolher os tubos de amostra suavemente e colocar no centrifugador, o qual está à temperatura ambiente para este passo. Rotação durante 20-30 min a 500 x g. </li><li> Enquanto isso, prepare mais dois conjuntos de polipropileno rodada tubos de centrífuga de fundo com os identificadores de amostragem correspondentes. </li><li> Após o passo 4.4 estiver concluída, remova a amostra contendo tubos de polipropileno suavemente, com agitação mínima e configurá-lo para baixono suporte de tubos. </li><li> Pegar o primeiro tubo de amostra e seu tubo vazio correspondente. Com uma pipeta de polipropileno Pasteur, suave mas completamente com sucção medida, retire o &quot;camada de lixo&quot; superior ou &quot;materiais pegajosos&quot; e colocá-lo dentro do tubo inferior centrífuga rodada vazio. <ol><li> Continuar a remoção da parte superior do gradiente até o &quot;buffy coat&quot; é atingido (pode aparecer esbranquiçado com um tom avermelhado [glóbulos vermelhos]). Pare de aspiração, se uma altura de ~ 3 mm é alcançado a partir do &quot;buffy coat&quot;. Nota: Certifique-se de que este material é completamente desaparecido da parte superior do gradiente antes de continuar a sucção. </li></ol></li><li> Tome uma pipeta Pasteur fresco e um tubo inferior centrífuga nova rodada e retire cuidadosamente o creme leucocitário. Continue a sucção 3 - 5 mm abaixo da buffy coat, para garantir que a maioria das células são recolhidos e adicionados ao tubo de fundo redondo de 2 nd novo com o identificador de amostra apropriada. </li><li> Adicionar 1-2 ml osolução f Citometria de Fluxo Coloração Buffer para o tubo 2 nd e misture bem por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Girar as células a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. A etapa de lavagem 2º com uma solução de Citometria de Fluxo A coloração de buffer é opcional. Ressuspender em 500 ml de solução de Citometria de Fluxo A coloração de buffer e proceder à contagem de células usando um hemocitômetro. </li></ol> 5. Opcional (Labeling celular) <ol><li> Aliqout cada amostra para o mesmo número de células. Adicionar o anticorpo bloqueador a uma diluição de 0,5 ug por 10 6 células (CD16 anti-/ CD32 FcR) e incubar em gelo durante 15 min. </li><li> Adicionar o cocktail desejado de anticorpos primários (conjugados com os fluoróforos adequados) que são determinados a trabalhar bem uns com os outros pelo investigador, antes das experiências reais. Incubar em gelo durante 30 min. Lavam-se as células com PBS. Nota: Para a demonstração de rotulagem de células imunes rim para este manuscrito, foi utilizado um T-lymphocyte e / painel da célula dendrítica macrófagos. O painel de linfócitos T consistia em fixável Viabilidade Stain FVS510, anti-CD45 (clone: ​​30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Clone: ​​FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Clone: ​​A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (clone: ​​IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (clone RM4-5) de APC-Cy7, anti-CD8 (clone 53-6,7) BV785. O painel de macrófagos consistiu em fixável Viabilidade Stain FVS510, anti-CD45 (clone: ​​30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clone: ​​1A8) FITC, anti-CD11b (Clone: ​​M1 / ​​70) PerCP-Cy5.5, Anti- APC, Anti-CD11c (Clone: ​​N418): / 80 (BM8 Clone) F4 BV785. </li><li> Adicione o fixável Viabilidade Stain e deixar no banco-top por 5 min. Lavam-se as células com solução de coloração de citometria de fluxo tampão para remover o excesso do fixável Viabilidade mancha. </li><li> Adicionar Fixation reagente / permeabilização e incubar durante a noite a 4 ºC. Lave em solução de permeabilização. </li><li> Para mancha intracelular, bloquear novamente com anti CD16-/ 32 FcR por 10min. Adicionar as manchas intracelulares e incubar por 20-30 min. Lavar 2x em epsolução rmeabilization. </li><li> Ressuspender em amostras de solução e execução Citometria de Fluxo A coloração de buffer através de FACS máquina de 3,9. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Nós apresentamos aqui uma metodologia para obter células imunes de rim de forma confiável e eficiente. A modificação principal para a etapa de digestão de colagenase amplamente utilizado (disrupção mecânica do tecido) economiza cerca de 30 min e o isolamento de um grande número de células viáveis ​​imunes demora menos de duas horas para 4 amostras de rim. Além disso, dependendo da nossa questão de pesquisa, que agora só usar um único rim (o outro rim pode ser utilizado para a análise de proteínas por manchas de Western,...

A activação do sistema imunitário ocorre em várias doenças renais e processos patofisiológicos 6,10,11,13. As áreas potenciais de investigação activa abranger os vários disparadores para a activação do sistema imunológico, vários tipos de células envolvidos, o padrão de citocinas / quimiocina num ambiente doença em particular, a modulação de todos os processos acima mencionados por um determinado medicamento, etc. Para exemplificar, na isquemia-reperfusão lesão (um modelo de lesão renal aguda), há um aumento em células imunitárias ou de medula óssea derivada de células hematopoiéticas ou CD45 + células dentro de algumas horas, que é sustentado ao longo do período de conservação ou fibrose (6 semanas mais tarde) 5, 12. Estas células imunitárias segregam ambas as citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias e quimiocinas para orquestrar o processo de reparação 5,12. Actualmente, a capacidade para utilizar vários fluoróforos simultaneamente para rotular populações de células numa suspensão de células individuais aumentou com o anúncioventilação de fluxo moderno citometria de máquinas com quatro a cinco lasers. Isto tem substancialmente adicionada à capacidade para discriminar as populações de células com base no seu estado funcional 3,7. Por exemplo, ao etiquetar com precisão um macrófago como F4 / 80 Baixo Alto Alto CD206 Ly6b CD11b baixa, pelo menos mais 3 fluoróforos seria necessário no mesmo volume de amostra a porta para as células vivas, CD45 + (leucócitos) e Ly6G- (neutrófilos) e isso é muito possível com o novo fluxo Citómetros 3. No entanto, os ensaios a jusante para a secreção de citoquina, proliferação celular, a citotoxicidade, a activação de macrófagos e a quantificação dos números de vários subconjuntos de linfócitos e monócitos não só precisa de boa qualidade (células vivas, singuletos) mas um número adequado de células. O sistema imunológico no rim, é constituído por dois componentes de adaptação e inatas e vários tipos de células 1,7,13. Por exemplo, em ratinhos a dois miúdo+ células Neys juntos são relatados para conter 2-17% (28,000-266,000) CD45 das células do sistema imune de rim total isolado (1,4 x 10 6 células) e cerca de 5-15% (1,400-4,200) destes são células CD4 + 1 , 5,12. Uma pequena percentagem (5-15%, 70-630) destas células CD4 + são FoxP3 + células (Figura 1) 1. Devido a estas etapa reduções sábios em percentagens de células, por vezes, a população de células de interesse (neste caso CD45 + CD4 + Foxp3 + células) é representado por um simples ~ 100 células. O pequeno número de CD45 + CD4 + células FoxP3 + torna imperativo que um grande número de células totais são isoladas e as células são de boa qualidade para estudos a jusante, tais como ensaios de secreção de citocinas. Além disso, pode ser necessário combinar rins 2-3 murganhos uma vez que as subpopulações não são representados em número suficiente altos para realizar ensaios quantificáveis. Por isso, o isolamento fiável e eficaz de populações de células mononucleares do rim é desejável, a fim de estuy o espectro imunológicas associadas com doenças renais. Tradicionalmente, para o isolamento de células mononucleares de rim, os investigadores têm usado uma variedade de digestões enzimáticas, tais como a colagenase 1A ou II, incluindo ADNase 1 1,5,12. É bem sabido que as colagenases têm actividade enzimática que varia de acordo com os números de lote e pela empresa de fabrico, necessitando de titulação para a concentração óptima e a duração da incubação 4,14,15. Além disso, a digestão com colagenase adiciona tempo para picagem do rim em pedaços pequenos, requer a incubação dos pedaços de rim em A (37 ° C), banho de aquecimento e um tempo adicional para a incubação em EDTA para parar a reacção. Além disso, a menos que a esterilidade pode ser conseguido por alguns processos a jusante que necessitam de cultura de células. Mais importante ainda, dependendo do investigador e todas as variáveis ​​envolvidas, que conduz a variabilidade dos dados e interpretação entre laboratórios. Recentemente, com adesenvolvimento de tecido mecânicos / disruptores homogeneizadores 16, a etapa de digestão de colagenase é completamente evitados e substituídos por uma ruptura mecânica simples dos rins 2. Aqui, nós demonstramos um método simples mas eficaz para o isolamento de células do sistema imunológico nos rins para extrações de células imunes diárias. Mais importante, esta técnica pode ser adaptado para outros tecidos moles e não fibrosos, tais como o fígado e o cérebro 16.

<table><tbody><tr><td>Sistema de laboratório Stomacher 80 Biomaster</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Bolsas clássicas</td><td>Seward</td><td>BA6040/STR</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XFR Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63514-11</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo analítico</td><td>BD LSR-X20 Fortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato 1x (DPBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno, sem tampa</td><td>Becton Dickinson</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de Viabilidade Fixável</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>FVS510,&nbsp; 564406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 (Clone: 93)</td><td>EBioscience</td><td>14-0161</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45 (clone: 30-F11)&nbsp; BV421&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>103133/4</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC</td><td>EBioscience</td><td>17-5773</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135013/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>103031/2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>100413/4</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785</td><td>Biolegend</td><td>100749/50</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC</td><td>Biolegend</td><td>127605/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101227/8</td><td></td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC</td><td>Biolegend</td><td>123115/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Clone: N418) BV785</td><td>Biolegend</td><td>117335/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>145705/6</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE</td><td>Biolegend</td><td>137803/4</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; Filtro M&nbsp;</td><td>Tubos Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 50 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos Fisherbrand 15 ml</td><td>Fisher</td><td></td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Sucarose</td><td>Fisher chemical</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência ponta fina</td><td>Samco Scientific</td><td>232</td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução Tampão para Coloração por Citometria de Fluxo</td><td>EBioscience</td><td>00-4222-26</td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Tampão de Lise RBC</td><td>EBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Ou equipamento equivalente&nbsp;</td></tr></tbody></table>

extração eficiência confiável e alta de rim células imunes



Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

A ativação do sistema imunológico ocorre em múltiplas doenças renais e processos fisiopatológicos. O sistema imunológico consiste em componentes adaptativos e inatos e vários tipos de células. Às vezes, o tipo de célula de interesse está presente em números muito baixos entre o grande número de células totais isoladas do rim. Portanto, o isolamento confiável e eficiente de populações de células mononucleares renais é importante para estudar os problemas imunológicos associados às doenças renais. Tradicionalmente, o isolamento tecidual de células mononucleares renais tem sido realizado por meio de digestão enzimática usando diferentes variedades e forças de colagenases / DNAses, produzindo números variados de células imunes viáveis. Recentemente, com o desenvolvimento dos disruptores mecânicos teciduais para isolamento de célula única, a etapa de digestão da colagenase é evitada e substituída por uma simples ruptura mecânica dos rins após a extração do camundongo. Aqui, demonstramos um método simples, mas eficiente, para o isolamento de células mononucleares renais para extrações diárias de células imunológicas. Além disso, demonstramos um exemplo de análise de subconjunto de células imunes no rim. É importante ressaltar que essa técnica pode ser adaptada a outros tecidos moles e não fibrosos, como fígado e cérebro.

O número de painéis que podem ser executados depende do número de células imunes que podem ser extraídos de forma fiável dos rins. Aqui, nós demonstramos a capacidade de executar 2 painéis, um para linfócitos T e outra para macrófagos células / dendríticas. No painel de linfócitos T, primeiro olhar para a dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral padrão (SSC) e delinear a população de interesse, como mostrado na Figura 1 (gráfico de pontos superior esquerdo). Em ...

Técnicas confiáveis e eficientes para o isolamento de células imunes renais são necessárias para aplicações a jusante. Isso requer a marcação de anticorpos de superfície de um pequeno número de células imunes renais. Aqui, descrevemos um método conciso para isolamento de células imunes renais que aparentemente atinge esse objetivo.

Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

O objetivo geral deste protocolo de isolamento de células imunes renais é extrair suspensões de células únicas viáveis dessas células em números adequados para análises posteriores utilizando citometria de fluxo multicolorida. A principal vantagem desta técnica, em comparação com a digestão por colagenase, é a capacidade de isolar de forma confiável e econômica um grande número de células imunes renais para análises experimentais subsequentes. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunobiologia renal.Por exemplo, qual subconjunto de células imunes renais regula a secreção de citocinas ou quimiocinas em uma doença renal específica. Este método é demonstrado para o isolamento de células imunes do rim. No entanto, pode ser facilmente adaptado para isolar células de outros sistemas, como fígado ou cérebro.Hoje, demonstraremos um procedimento para coletar células imunes renais. E o procedimento será demonstrado por Alex Meuth, um especialista em pesquisa do meu laboratório. Após confirmar a ausência de resposta ao aperto no dedo do pé, use etanol 70% para limpar o abdômen ventral de um camundongo anestesiado.Em seguida, use uma tesoura para abrir a cavidade abdominal e desloque os órgãos abdominais para o lado esquerdo do animal. Usando uma seringa de 1 cm³ equipada com uma agulha curvada de 25 graus, colete o sangue da veia cava inferior em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 10 microlitros de EDTA de potássio. A seguir, faça um pequeno corte no átrio direito e use um par de pinças para segurar suavemente o coração.Em seguida, insira uma agulha de 21 a 25 gauge acoplada a uma seringa de 50 cc contendo 20 a 30 mililitros de PBS gelado no ventrículo esquerdo, no seu ápice, e realize lentamente a perfusão do ventrículo por um a dois minutos. O coração ficará pálido após os primeiros mililitros de PBS. O embranquecimento do fígado indica que o sangue está sendo eliminado através do fígado pela retorno venoso pela veia cava.Quando a perfusão estiver completa, use tesoura e pinça para dissecar o rim direito dos vasos sanguíneos, gordura e glândulas adrenais anexos. Em seguida, remova cuidadosamente a cápsula renal com pinça e pese o rim conforme apropriado para o experimento. A seguir, transfira o rim para um tubo cônico de 50 mililitros contendo um mililitro de tampão para citometria de fluxo sobre gelo.Rotule um saco de homogeneização com capacidade de cinco a 80 mililitros com as informações apropriadas de identificação da amostra e descarte o filtro interno. Encha o saco com cinco mililitros de tampão de marcação para citometria de fluxo gelado e coloque o rim dentro do saco. Dobre o saco de homogeneização ao meio, de modo que uma metade tenha o rim submerso no tampão e a outra metade esteja dobrada sobre ele.Coloque a bolsa de homogeneização dobrada com o rim voltado para a pá próxima à borda inferior, tomando cuidado para que a extremidade inferior da bolsa não deslize abaixo da borda inferior das pás. Em seguida, confirme visualmente que os rins foram adequadamente homogeneizados e que não há pedaços grandes visíveis. Se os rins não forem suficientemente triturados pelo instrumento, aproxime as pás da parede do homogeneizador.Em seguida, coloque um filtro celular de 100 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros individual por amostra sobre gelo e filtre completamente os homogenatos através dos filtros. Quando todas as amostras tiverem sido dissociadas, centrifugue os tubos com os filtros para garantir que todos os tecidos sejam completamente filtrados e coloque os tubos novamente sobre gelo. A seguir, adicione um volume igual de tampão de lise de hemácias a cada amostra e pipete para cima e para baixo várias vezes para obter suspensões celulares uniformes.Após cinco minutos, pelotize as células por centrifugação e descarte cuidadosamente o sobrenadante de cada tubo em um único movimento suave, derramando a última gota de líquido que se forma enquanto cada tubo ainda está de cabeça para baixo. Para isolar as células imunes renais, adicione um mililitro de reagente de gradiente de densidade 72% em um tubo de fundo redondo de polipropileno para cada amostra. Em seguida, triture suave, mas vigorosamente, um mililitro de sacarose 0,25 molar em cada pellet para obter suspensões de células individuais e adicione as células às soluções de gradiente de densidade.Em seguida, sobreponha cuidadosamente um mililitro do reagente de gradiente de densidade 72% sob cada suspensão celular para formar camadas pesadas distintas. Confirme que as células renais estão uniformemente suspensas no gradiente de percoll 36% em cada tubo. Em seguida, sobreponha cuidadosamente o percoll 72% sob o percoll 36% para formar camadas distintas de 36 e 72.Coloque cuidadosamente os tubos na centrífuga para separação em gradiente de densidade. Em seguida, utilize uma pipeta Pasteur de polipropileno para transferir suave, mas completamente, todo o conteúdo, exceto cerca dos últimos três milímetros das camadas superiores de resíduos, para tubos cónicos redondos vazios individuais. Agora, utilize uma pipeta Pasteur nova para transferir suavemente as camadas de buffy coat para novos tubos cónicos redondos, até que três a cinco milímetros abaixo do buffy coat tenham sido removidos, garantindo que a maior parte das células de cada amostra tenha sido coletada.Em seguida, misture um a dois mililitros de tampão de marcação para citometria de fluxo nos buffy coats e centrifugue as células. Re-suspenda os pellets em 500 microlitros de tampão de marcação para citometria de fluxo para contagem, e divida uniformemente as amostras em uma placa de 96 poços, fundo redondo, escura. Incube as amostras com anticorpo bloqueador por 15 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, prepare um coquetel de anticorpos para cada tipo de célula imune a ser testado. Por exemplo, linfócitos, macrófagos e células dendríticas, e incube as células no coquetel de anticorpos apropriado por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após selecionar a população de interesse por dispersão direta e dispersão lateral, exclua as células não viáveis.De dois a 18% das células imunes totais do rim normalmente expressam CD45. Para isolar as células T efetoras e citotóxicas, por exemplo, essas células hematopoiéticas derivadas da medula óssea podem então ser selecionadas com base na expressão de CD4 e CD8, respectivamente. A caracterização adicional das células positivas para CD4 revela uma população de aproximadamente oito a 14% de células T reguladoras positivas para FoxP3, que podem ser subdivididas em populações que expressam CD44 e CD127.Para avaliar o painel de células mieloides, as células positivas para CD45 podem ser selecionadas com base na expressão de Ly6G para excluir inicialmente os neutrófilos. Em seguida, CD11b e F4/80 podem ser utilizados para subdividir ainda mais as células positivas para Ly6C em populações de macrófagos infiltrantes e células dendríticas. Após dominada, esta técnica pode ser concluída em uma a duas horas.Após este procedimento, experimentos subsequentes, como o isolamento de células positivas para CD11b ou CD4, podem ser realizados para responder perguntas sobre a secreção de citocinas por este subconjunto específico de células. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como perfundir os rins, gerar uma suspensão viável de células renais, isolar células imunes renais por centrifugação em gradiente de densidade e marcar as células renais para análise por citometria de fluxo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, descrevemos o procedimento de extração renal do espaço retroperitoneal do camundongo. O rim extraído pode ainda ser microdissecado para obter um rim intacto sem cápsula renal e a camada de gordura circundante.

Extração de rim intacto de camundongo: uma técnica para obter rim sem cápsula renal de modelos murinos

DNabT células são raras entre as células T periféricas; no entanto, eles são abundantes em certos tecidos não linfóides. Dificuldade de isolar as células T DN a partir de tecidos não-linfóides dificulta a sua análise funcional, apesar do aumento reconhecida importância fisiopatológica. Descreve-se um novo protocolo para o isolamento de células altamente purificadas DN T de rim murino.

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

Este protocolo descreve a descelularização de rins de ratos Sprague Dawley por perfusão anterógrada de detergentes através da vasculatura, produzindo matrizes extracelulares renais acelulares que servem como modelos para repovoamento com células epiteliais renais humanas. A recelularização e o uso do ensaio de perfusão de resazurina para monitorar o crescimento são realizados em biorreatores de perfusão especialmente projetados.

Repovoamento celular epitelial e Preparação de Rodent Matriz Extracelular Andaimes para o desenvolvimento do tecido renal

Aqui nós apresentamos um método de isolamento e cultura de romance grau clínico para rim perivasculares células do estroma (kPSCs) com base na perfusão de órgão inteiro com enzimas digestivas e enriquecimento de NG2-célula. Com este método, é possível adquirir o número suficiente de células para terapia celular.

Um método de isolamento do romance grau clínico para rim humano Perivascular de células do estroma

O foco principal do presente protocolo é eficientemente isolar culturas viáveis glomérulos primário com contaminantes mínimas para uso em uma variedade de aplicações a jusante. Os glomérulos isolados mantém relações estruturais entre tipos de células do componente e podem ser cultivadas ex vivo por um curto período de tempo.

Um método eficiente de crivagem para isolar intactos glomérulos do rim de rato adulto

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

microRNAs estão envolvidos na patogênese da nefropatia por IgA. Desenvolvemos um método confiável para detectar os níveis de expressão de microRNA nos rins de um modelo de nefropatia por IgA em camundongos (camundongos HIGA). Este novo método facilitará a verificação do envolvimento de miRNAs na nefropatia por IgA.

Detecção da Expressão de MicroRNA nos Rins de Camundongos Nefropáticos com Imunoglobulina A

Após a infecção viral, o rim abriga um número relativamente grande de células CD8+ T e oferece uma oportunidade de estudar células TRM não mucosas. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar linfócitos renais de camundongos para análise de citometria de fluxo.

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados que melhoram a representação de tipos de células renais medulares e evitam os artefatos de expressão gênica da dissociação do tecido enzimático.

Isolamento de Núcleos do Rim de Rato Adulto para Sequenciamento de RNA de Núcleo Único

Um protocolo é relatado aqui para a ablação seletiva de macrófagos renais para estudar sua regeneração usando a ferramenta de ablação de células CD59/intermedilisina humana. Este método também é aplicável para estudar a função e regeneração de outras populações de células no rim, fígado e tecido adiposo.

Depleção rápida de macrófagos renais usando a ferramenta de ablação de células CD59/Intermedilisina humana

Este estudo desenvolveu um protocolo otimizado para o isolamento de células mesangiais murinas (MCs) e sua cultura de células ex vivo . Essas células podem ser passadas várias vezes, congeladas, revividas e cultivadas sem comprometer o crescimento celular ou a expressão de proteínas.

Otimizando o isolamento e a purificação de células mesangiais glomerulares murinas

Aprenda a isolar células imunes renais de forma confiável e econômica para citometria de fluxo multicolorida. Este método extrai suspensões celulares viáveis em quantidades adequadas para análise imunobiológica.

Extração Eficiência confiável e alta de rim células imunes

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