Name: Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de linfócitos infiltrantes de melanoma humano. Este método avança a imunoterapia oncológica e permite produzir células T específicas de tumor.

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Agradecemos à Sra. Deborah Postiff e à Sra. Jackline Barikdar no Núcleo de Aquisição de Tecidos e à Dra. Cindy DeLong no Laboratório do Núcleo de Células-Tronco Pluripotentes da Universidade de Michigan por sua assistência técnica. Este estudo foi apoiado pelo financiamento inicial da Universidade de Michigan e doações da Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance e NIH / NCI (1K08CA197966-01) para F. Ito.

NOTA: Os pacientes devem dar consentimento informado para participar do Conselho de Revisão Institucional e pluripotentes estaminais humanas Comissão celular estudo aprovado. 1. Isolamento e Cultura de TIL <ol><li> Obter material de tumor que não é necessária para o diagnóstico histopatológico do núcleo aquisição de serviços de patologia / tecido. Coloque 20-100 g de espécimes de tumores em um tubo de 50 ml com 30 ml de meio recolha do tumor (Tabela 1). </li><li> Dissecar sólida, firme, tecido normal da amostra de tumor de áreas necróticas frágeis e / ou com sangue usando uma tesoura. Depois de remover o tecido necrótico, utilizar a tesoura para picar a amostra tão pequena quanto possível. </li><li> Dissociar o espécime picada em uma suspensão de uma única célula, utilizando um kit de dissociação Dissociator e tumor (humano) de acordo com as instruções do fabricante. Filtrar a suspensão com um filtro de células 70 mm que é definida em um tubo de 50 ml e lavar o filtro 2 vezes com2 ml de meio RPMI 1640. </li><li> Centrifugar a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de meio de células T (Tabela 1). </li><li> Prepara-se uma solução de gradiente de dois passos tal como Ficoll (solução gradiente) num tubo de 50 ml, com um passo inferior de 10 ml de solução de gradiente de 100% e um passo de meio de 30 ml de solução de gradiente de 75% diluída com fosfato de Dulbecco solução salina tamponada, sem cálcio, nenhum magnésio (D-PBS (-)). </li><li> Camada de suspensão de células (do Passo 1.4) na solução de gradiente (do Passo 1.5). Centrifuga-se a 400 xg a 20 ° C durante 45 min. </li><li> Recolher a fase que contém os TILs enriquecidas na interface entre a solução de gradiente de 100% e a solução de gradiente de 75% em um tubo de 50 ml. Dilui-se a camada da solução com as TILs enriquecidos por adição de 20-30 ml de D-PBS (-). </li><li> Centrifugar a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o TIL fracção enriquecida em 10 mlde meios de células T. </li><li> Cultura a fracção (a partir do Passo 1.8) com 2 ml de meio de células T e 6000 UI / ml de recombinante humana (rh) IL-2 em uma placa de 6 poços, a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Alterar a metade da media no dia 5 após o início da cultura e cada 2-3 dias depois. </li><li> Dividir as células numa proporção de 1: 2, sem tripsinização após suavemente a suspensão, a duplicação do número de poços quando se atinge 80-90% de confluência. Adicionar um volume de metade (1 ml) de meio de células T fresco e rhIL-2 a 6,000 UI / ml. </li></ol> 2. Preparação de-tratadas com mitomicina-C SNL alimentador de placa da pilha <ol><li> Culturas SNL células alimentadoras em 10 ml de meio celular SNL alimentador (Quadro 1) sobre um 0,1% de gelatina revestidos por placa de 10 cm, até 80-90% de confluência (3-4 x 10 6 células) é alcançado. </li><li> Adicionar 310 ul de solução C 0,4 mg / ml de mitomicina directamente na placa de cultura de células de alimentação SNL e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 2 h e 15 min. Aspirar a mídia aND lavar as células duas vezes com 5 ml de D-PBS (-). </li><li> Adicionar 0,5 ml de 0,25% de tripsina / EDTA a 1 mM e incuba-se à temperatura ambiente durante 1 min para dissociar as células. Adicionar 4,5 ml de meio de células de alimentação SNL para neutralizar e re-suspender as células em uma única suspensão. </li><li> Transferir as células num tubo de 15 ml e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar os meios de comunicação e contagem das células com um hemocitómetro, após re-suspensão em 10 ml de meio de células de alimentação SNL. </li><li> Placa de 1,5 x 10 6 culas por po de células alimentadoras SNL em uma placa de 10 cm e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO 2. Usar as células alimentadoras SNL dentro de 3 dias. </li></ol> 3. Geração de iPSCs utilizando o vírus Sendai (vários) Vector <ol><li> Recolher as TILs (do Passo 1,11) e activar a 5 x 10 5 células de TIL com rato ligado à placa anti-CD3 humano (1 jig / ml) e de rato solúvel de CD28 anti-humano (5 ug / ml), com rhIL-2 (6000 UI / ml) em 2 ml de meio de células T em uma placa de 6 poços a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 dias. </li><li> Recolher as TILs (do Passo 3,1) num tubo de 15 ml usando uma pipeta e contar o número de células com um hemocitómetro. </li><li> Reactivar 1 x 10 5 células de TIL com rato ligado à placa anti-CD3 humano (1 jig / ml) e de rato solúvel anti-humano CD28 (5 ug / ml), com rhIL-2 (60 UI / mL) em 500 uL meios de reprogramação (Tabela 1) por poço numa placa de 24 poços a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas. Prepare 3 poços para a infecção SeV: OCT3 / 4, SOX2, KLF4, e c-Myc (1 cavidade); infecção SeV (GFP: proteína fluorescente verde) (1 poço); e contagem de células (1 cavidade). </li><li> Depois de 24 h (a partir do Passo 3.3), contar o número de células com um hemocitómetro e determinar o volume de cada vírus por vários (3-20) multiplicidades de infecção (MOI). Remover um conjunto de Sendai tubos vírus vetor da -80 ° C armazenamento. Descongelar os vectores SeV rapidamente num banho de água (37 ° C) e colocá-los em gelo. Volume de vírus (ul)= MOI (CIU / célula) x número de células / título do vírus (CIU / ml) × 10-3 (ul / ml) </li><li> Adicionar os volumes calculados de cada um dos quatro tubos de Sendai virus vector que individualmente transportados OCT3 / 4, SOX2, KLF4, e c-myc por adição de uma mistura de vectores SeV a 10-20 MOI para os meios de comunicação, incluindo TILs activadas. </li><li> Para determinar a eficiência de transdução, adicionar os volumes calculados de SEV-GFP em um poço de TILs activados. </li><li> Colocar a cápsula (a partir do Passo 3.5 Passo 3.6 e) na incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas. Após 24 h, estimar a eficiência de infecção usando TIL infectadas com SEV-GFP sob microscopia de fluorescência. </li><li> Recolher as células (do passo 3.5) em um tubo de 15 ml. Centrifugar a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 0,5 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas com Primata ES meio de células e factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF, 4 ng / ml). </li><li> Transferir a suspensão para um prato de 10 centímetros que Contains mitomicina-C-tratados células alimentadoras SNL em 10 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas. Troque a mídia CTEh a cada dois dias até que as colónias são cultivadas. </li><li> Por volta do dia 18 a 21, remover as células alimentadoras SNL em torno das colónias sob um microscópio utilizando uma ponta de 10 ul na bancada limpa. </li><li> Raspar as colónias usando uma ponta de 10 ul e transferi-las utilizando uma ponta de 200 uL em 100 uL de meios iPSCs por poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Pipetar cima e para baixo em 2-3 vezes para quebrar as colónias em pequenos aglomerados com um tamanho médio de 50-100 um. </li><li> Transferir os pequenos aglomerados em 6-se placas de cultura de tecidos com células alimentadoras SNL tratadas com mitomicina-C (a partir do Passo 2) em 2 ml por poço de meio de iPSCs com factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF, 4 ng / ml). Mudança de mídia iPSCs todos os dias. </li><li> Transferir os iPSCs a 6-se placas de cultura de tecidos com células alimentadoras SNL tratadas com mitomicina-C frescas com 1 mg / ml de colagenase IV a cada 5-6 dias. Prepare 2 poços por placas de cada clone para immunostaining. </li><li> Determinar a reprogramação completa de cada clone por coloração imuno-histoquímica de marcadores de pluripotência (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81 e OCT3 / 4) 1. NOTA: Para uma avaliação mais aprofundada do potencial pluripotência, confirme que as linhas de IPSC totalmente reprogramadas podem se diferenciar em três camadas germinativas por uma formação do corpo embryoid e ensaio de diferenciação ou um ensaio de formação de teratomas 16. </li><li> Confirme que as linhas de IPSC totalmente reprogramadas demonstrar uma cariótipo normal por análise citogenética. </li><li> Para a formação de teratoma, injectar um indiferenciada iPSC TIL derivados (1 x 10 6) suspensão em 100 ul de DMEM contendo FCS a 10% para dentro do tecido subcutâneo de ratos NOD / SCID fêmeas de 6-8 semanas de idade. seções teratoma mancha com hematoxilina e eosina. </li></ol> 4. Imunofluorescência Coloração de iPSCs para SSEA3, SSEA4, TRA1-60 e TRA1-81 <ol><li> Wash iPSCs com 1 ml de PBS e corrigir as iPSCs com 1 ml de 4% aaraformaldehyde solução durante 10 min. Remover a solução de paraformaldeído a 4% e lavar as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes. NOTA: Tenha cuidado ao usar paraformaldeído porque é tóxico. </li><li> Pretreat as iPSCs com tampão (Tabela 1) de bloqueio, durante 30 min. Entretanto, dilui-se os anticorpos primários (rato anti-humano SSEA3, de ratinho anti-humano SSEA4, de ratinho anti-humano TRA1-60, e TRA1-81 rato anti-humano de cabra) solução de soro 1:50 em 1,5% diluído com PBS e TritonX -100 (volume total: 1 mL). </li><li> Remover o tampão de bloqueamento (Tabela 1). Adicionar a solução de anticorpo primário diluído e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Entretanto, dilui-se o anticorpo secundário (anti-IgG de ratinho e IgM ou anti-IgM de rato) 1:50 em 1,5% de solução de soro de cabra. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário diluído e lava-se as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes, cada uma durante 5 minutos. Adicionar a solução de anticorpo secundário diluído e incuba-se durante 45 minutos à temperatura ambiente num quarto escuro. </li&gt; <li> Remover a solução de anticorpo secundário diluído e lava-se as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes, cada uma durante 5 minutos. Observe as iPSCs com microscopia de imunofluorescência. </li></ol> 5. Imunofluorescência Coloração de iPSCs para OCT3 / 4 <ol><li> Lavar iPSCs com 1 ml de PBS e fixar as iPSCs com 1 ml de solução de paraformaldeído a 4% durante 10 min. Remover a solução de paraformaldeído a 4% e lavar as iPSCs com PBS 3 vezes. </li><li> Adicionar tampão de permeabilização (Tabela 1) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Remover o tampão de permeabilização e adicionar um tampão de bloqueio (Tabela 1). </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 30 min. Entretanto, dilui-se o anticorpo primário (murganho anti-humano OCT3 / 4) a 1:50 em tampão de bloqueio. </li><li> Adicionar a solução de anticorpo primário diluído e incuba-se a 4 ° C durante a noite. </li><li> Remover a solução de anticorpo primário diluído e lava-se as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes, cada uma durante 5 minutos. Enquanto isso, dilute o anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-rato IgG / IgM) 1: 100 em tampão de bloqueio. </li><li> Adicionar a solução de anticorpo secundário diluído e incuba-se à temperatura ambiente num quarto escuro durante 45 min. </li><li> Remover a solução diluída secundário e lava-se as iPSCs com 1 ml de PBS 3 vezes, cada uma durante 5 minutos. Observe as iPSCs sob microscopia de imunofluorescência. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li>
<li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8%28%2B%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li>
<li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8%28%2B%29+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li>
<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11(2016).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052(2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, demonstramos um protocolo para a reprogramação TIL de melanoma de iPSCs por transdução mediada por SeV dos quatro factores de transcrição OCT3 / 4, SOX2, KLF4, e c-myc. Esta abordagem, utilizando um sistema de SeV para reprogramar células T, oferece a vantagem de um método não-integrando 7. Um estudo anterior mostrou que um sistema de reprogramação SeV foi altamente eficiente e confiável para reprogramar fibroblastos não só, mas também as células T do sangue periférico ...

Tecnologia de reprogramação celular que permite a geração de células estaminais pluripotentes induzidas (IPSCs) através de sobre-expressão de um conjunto definido de factores de transcrição é uma grande promessa no domínio das terapias à base de células 1,2. Estes iPSCs exibem características de transcrição e epigenéticos e ter a capacidade de auto-renovação e pluripotência, semelhante às células estaminais embrionárias (CES) 3-5. Progressos notáveis em tecnologia de reprogramação durante a última década nos permitiu gerar iPSCs humanos, mesmo a partir de células terminalmente diferenciadas, como células T 6-8. IPSCs derivadas de células T (TiPSCs) reter a mesma configuração rearranjados de genes das cadeias do receptor de célula T (TCR), como as células T originais, o que permite a regeneração de células T específicas para o antigénio de TiPSCs 9-11. Cerca de 80% de linfócitos infiltrantes de melanoma (TIL) obtidos a partir de tumor de um paciente reconhecem especificamente antígenos associados a tumores umnd manter a citotoxicidade contra as células cancerosas originais 12. Notavelmente, a expressão de morte celular programada proteína-1 (DP-1) em TILs foi encontrada para identificar o repertório de tumor autólogo-reactivo, incluindo CD8 específicas do neo-antigénio mutado linfócitos + 13. A transferência adoptiva de ex-vivo TILs autólogos expandidos em combinação com regimes lymphodepleting preparativa e a administração sistémica de interleucina-2 (IL-2) pode causar regressão substancial de melanoma metastático em subconjuntos de pacientes 14. Apesar resultados encorajadores em modelos pré-clínicos e em pacientes, pobre sobrevivência de células T infundidos e a existência de vias imunossupressores parecem comprometer todo o potencial da terapia celular adoptiva t. Protocolos clínicos em curso exige uma extensiva manipulação ex vivo de células T autólogas, a fim de obter um grande número. Isto resulta na geração de células T terminalmente diferenciadas que têm baixa sobrevivência reduzida, Prolcapacidade iferative, e altos níveis de PD-1 15. Esta limitação da terapia celular adotiva T pode ser, teoricamente, superado usando iPSCs que podem fornecer uma fonte ilimitada de células T autólogas para imunoterapia. Recentemente, relatou a reprogramação de melanoma TIL expressando altos níveis de PD-1 por vírus Sendai (vários) transdução mediada por um dos quatro fatores de transcrição, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 e C-MYC 16. Enquanto vetores retrovirais requerem integração cromossomas do hospedeiro para expressar genes de reprogramação, vetores SEV são não-integração e, eventualmente, são eliminados do citoplasma. A reprogramação da eficiência é muito maior com um sistema de SeV comparação com lentivírus de retrovírus ou vectores 6-8. Além disso, SeV pode reprogramar especificamente células T em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), enquanto alguns clones IPSC gerados por lentivírus ou vectores retrovirais pode ser a partir de linhagens não linfóides 6-8. Aqui, nós detalheos procedimentos realizados para o isolamento e a activação de TIL de melanoma humano e para a geração de iPSCs TIL derivadas utilizando um sistema de reprogramação SeV.

<table><tbody><tr><td>Tubos MACS C suaves</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Dissociador MACS suave</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação de Tumor, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos BD Falcon 50ml</td><td></td> BD <td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Tecnologias de vida</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>soro AB humano</td><td>Tecnologias de vida</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200mM)</td> <td>Tecnologias de vida</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol (1000x, 55mM)</td> <td>Tecnologias de vida</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camundongo NA / LE Purificado Anti-Humano CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Purificado NA/LE Mouse Anti-Humano CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetilcisteína</td><td>Cumberland Produtos Farmacêuticos Inc.</td>Placas de cultura de tecidos <td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon (6 poços)</td> Placas de cultura de tecidos <td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon (24 poços)</td> <td>Células</td><td></td> alimentadoras de DNAVEC SNL do vetor do vírus Corning 353047 <td></td></tr><tr><td>Sendai</td><td></td> Cell Biolabs, Inc CBA-316 mitomicina C SIGMA M4287 solúvel em água (0,5 mg / ml)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gelatina</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

A transferência adoptiva de expandidas ex vivo linfócitos infiltrantes tumorais autólogas (TIL) podem mediar respostas duráveis e completas em subconjuntos significativos de pacientes com melanoma metastático. Os principais obstáculos desta abordagem são a viabilidade reduzida das células T transferidas, causada pelo encurtamento dos telómeros, e o número limitado de TILs obtidos a partir de pacientes. As células T menos diferenciadas com longos telómeros seria um subconjunto de células T ideal para terapia adoptiva de células T, no entanto, a geração de grandes números de células T estas menos diferenciadas é problemática. Esta limitação da terapia celular adotiva T pode ser, teoricamente, superado usando células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) que se auto-renovar, manter os telômeros pluripotência, foram alongadas, e fornecer uma fonte ilimitada de células T autólogas para imunoterapia. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar iPSCs usando vetores de vírus Sendai para a transdução de fatores de reprogramação em TIL. Este protocolo gerars clones totalmente reprogramadas, livre do vector. Estes iPSCs TIL derivados podem ser capazes de gerar células T específicos do paciente e de tumor menos diferenciadas para terapia adoptiva de células T.

A Figura 1 mostra a vista geral do procedimento que envolve a expansão inicial de melanoma TILs com rhIL-2, o qual é seguido pela activação com anti-CD3 / CD28 e a transferência de genes de OCT3 / 4, KLF4, SOX2, e c-myc para TILs para a geração de iPSCs. Normalmente, TIL em cultura com rhIL-2 início para formar esferas 21-28 dias após o início da cultura. Neste ponto, TILs está pronto para ser activadas com anti-CD3 / CD28. A Figura 2A mostra TIL, em cul...

O objetivo deste protocolo é mostrar o protocolo de reprogramação de linfócitos infiltrantes de tumor de melanoma em células-tronco pluripotentes induzidas.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

O objetivo geral deste experimento é gerar células-tronco pluripotentes induzidas ou iPSCs a partir de linfócitos infiltrantes de melanoma. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia tumoral, especialmente para a imunoterapia contra o câncer. A principal vantagem desta técnica é que a capacidade de gerar células iPS humanas a partir de linfócitos infiltrantes de tumor pode fornecer números ilimitados de linfócitos T específicos para o tumor, com menor grau de diferenciação, para terapia imunológica.Essa técnica pode ter aplicações no tratamento do melanoma metastático, pois atualmente a baixa sobrevida dos linfócitos T em ambiente clínico tem sido a principal limitação da terapia adaptativa com linfócitos T. Este método também pode ser útil na investigação do repertório de receptores de células T no microambiente tumoral. O procedimento será demonstrado pela Dra. Kumiko Iwabuchi, pesquisadora pós-doutoranda do meu laboratório.Após obter o material tumoral, selecione cinco a vinte gramas de espécimes tumorais e use tesoura para dissecar o tecido normal, sólido e firme das áreas frágeis e/ou necróticas sanguinolentas das amostras tumorais. Pique os espécimes dissecados o mais finamente possível, depois use um dissociador e um kit de dissociação de tumor humano para dispersar os fragmentos tumorais em uma suspensão de células únicas, conforme as instruções do fabricante. Ao final da dissociação, filtre as células através de uma peneira de 70 microns para um tubo de 50 mililitros e lave a peneira duas vezes com dois mililitros de RPMI 1640.Em seguida, pelletize as células por centrifugação e re-suspenda-as em 10 mililitros de meio fresco para linfócitos T. Para separar as células por gradiente de densidade, coloque primeiro 30 mililitros de solução gradiente a 75%, seguidos por 10 mililitros de solução gradiente a 100% em DPBS sem cálcio ou magnésio, em um novo tubo de 50 mililitros. Em seguida, sobreponha cuidadosamente as células à solução gradiente, tomando cuidado para não perturbar as camadas, e centrifugue a amostra.No final da separação, transfira os linfócitos infiltrantes tumorais enriquecidos ou LITs na interface entre as soluções de gradiente para um novo tubo cônico de 50 mililitros e lave as células com 20 a 30 mililitros de DPBS fresco. Re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio fresco para linfócitos T, depois adicione dois mililitros de LITs por poço a cinco poços de uma placa de seis poços e suplemente as culturas de LITs com IL-2 Humano Recombinante por cinco dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No quinto dia, troque metade do meio em cada poço e a cada dois a três dias subsequentes.Quando as culturas atingirem 80 a 90% de confluência, use uma pipeta para suspender suavemente as células em cada poço e divida as culturas na proporção de um para dois em um mililitro de meio fresco para linfócitos T, suplementado com IL-2 recombinante humano. Para preparar placas de células alimentadoras SNL tratadas com mitomicina C, cultive primeiro as células alimentadoras SNL em 10 mililitros de meio para células alimentadoras SNL em uma placa de 10 centímetros revestida com gelatina a 0,1%. Quando as células estiverem de 80 a 90% confluentes, trate as células alimentadoras com mitomicina C por duas horas e 15 minutos a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.Após o término da incubação, lave as células duas vezes com cinco mililitros de DPBS. Em seguida, desprenda os alimentadores com tripsina-EDTA à temperatura ambiente. Após um minuto, neutralize a reação de dissociação com 4,5 mililitros de meio fresco para alimentadores SNL e transfira a suspensão de células individuais para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação.Re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio fresco para células alimentadoras SNL para contagem. Em seguida, plaque 1,5 × 10⁶ células alimentadoras SNL por poço em placas de 10 centímetros e incube as culturas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por até três dias. Para gerar as iPSCs com vírus Sendai, transfira 5 × 10⁵ LITs por poço para uma nova placa de seis poços revestida com anticorpo anti-humano CD3 de camundongo, em dois mililitros de meio fresco para linfócitos T suplementado com IL-2 humana recombinante e anticorpo anti-humano CD28 de camundongo solúvel.Ative os LITs no incubador de cultura celular por cinco dias. Em seguida, use uma pipeta para reunir as culturas em um tubo cônico de 15 mililitros para contagem. Em seguida, transfira um vezes 10 à quinta LITs por poço para uma placa de 24 poços revestida com anti-humano CD3 em 500 microlitros de meio de reprogramação suplementado com anti-humano CD28 murino solúvel em IL-2 Humana Recombinante.Após 24 horas no incubador de cultura celular, enumere as células em cada poço e prepare diversos volumes de vírus nas multiplicidades de infecção apropriadas. Em seguida, adicione uma mistura de vetores do vírus Sendai em 10 a 20 MOI ao volume apropriado de meio e acrescente o meio contendo o vírus a cada poço de LITs. Para determinação da eficiência de transdução, adicione o volume calculado do vírus Sendai GFP a um poço de LITs ativados e retorne as culturas ao incubador por 24 horas.No dia seguinte, visualize as células infectadas com o vírus Sendai GFP por microscopia de fluorescência para estimar a eficiência da transdução. Reúna as células infectadas viralmente de cada poço em um tubo de 15 mililitros para centrifugação e re-suspenda o pellet em 0,5 mililitros de meio de células-tronco embrionárias humanas suplementado com meio de células-tronco embrionárias de primata e fator de crescimento de fibroblastos básico. Em seguida, adicione 9,5 mililitros de meio fresco de células-tronco embrionárias humanas às células e transfira a suspensão para uma placa de células alimentadoras SNL tratada com mitomicina C.Nesta imagem, são mostrados linfócitos infiltrantes tumorais (TILs) no dia 21 de cultivo com IL-2 humana recombinante, prontos para serem ativados com anti-CD3 e CD28. Os TILs podem ser transfectados com o vírus Sendai em uma multiplicidade de infecção de 20. Aqui, é mostrado um clone pluripotente típico em células alimentadoras SNL, entre 18 e 21 dias após a infecção pelo vírus Sendai.Como observado neste cariógrama representativo, as iPSCs derivadas de LIT exibem um cariótipo normal. A coloração por imunofluorescência para confirmar a expressão de marcadores de pluripotência em iPSCs derivadas de LIT demonstra que essas células exibem os níveis esperados de expressão dos marcadores típicos de pluripotência. Além disso, iPSCs derivadas de LITs de melanoma são capazes de formar teratomas que contêm uma variedade de células provenientes das três camadas germinativas.Além disso, as iPSCs derivadas de TIL mantiveram seus rearranjos do receptor de células T, conforme avaliado por eletroforese capilar. Nosso primeiro avanço, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de oncologia explorarem imunoterapias contra o câncer mais eficazes para pacientes com melanoma metastático. Ao tentar este procedimento, é importante verificar a proliferação e viabilidade das células T antes da infecção pelo vírus Sendai e avaliar a eficiência da infecção pela expressão contornada de GFP.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar células TIL humanas a partir de TILs de melanoma.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando...

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno tumoral (iPSC) derivadas de células-tronco pluripotentes (iPSC) derivadas de células T CD8αβ+. As iPSCs específicas do antígeno tumoral são cultivadas em uma monocamada de células estromais e diferenciadas em células progenitoras hematopoiéticas (HPCs). Os HPCs são diferenciados em células T CD4 + CD8 + duplamente positivas usando um meio de diferenciação. Essas células são então estimuladas a gerar...

Geração de células T CD8 positivas únicas a partir de células-tronco pluripotentes induzidas

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Cultura de Células e Isolamento paciente Derivado de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Células-tronco de câncer putativos Melanoma

Este manuscrito fornece um procedimento passo a passo para a derivação e manutenção de queratinócitos humanos a partir de cabelos arrancados e subsequente geração de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de integração (hiPSCs) por vetores epissómicos.

Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

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Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

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Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

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Revelando oportunidades terapêuticas com modelos organoides derivados de pacientes com melanoma

Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas a partir de linfócitos infiltrantes de melanoma humano. Este método avança a imunoterapia oncológica e permite produzir células T específicas de tumor.

Geração de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de melanoma humano linfócitos tumor infiltrantes

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