Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

O objetivo geral deste procedimento é criar de forma reprodutível discos de hidrogel de alginato com duas camadas para investigar as relações entre diferentes populações celulares durante o co-cultivo tridimensional. Este método facilita o estudo das interações entre múltiplas populações celulares em culturas tridimensionais espacialmente heterogêneas, o que pode ajudar a responder questões fundamentais na engenharia de tecidos e na fisiologia de tecidos sujeitos a cargas mecânicas. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece uma maneira simples, econômica e reprodutível de construir hidrogéis de alginato com múltiplas camadas contendo células, cuja estrutura é favorável à estimulação mecânica.

Demonstrará este procedimento Poonam Sharma, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para formar os discos de alginato, empilhe primeiro um pedaço de papel filtro grosso sobre uma placa terminal de três por três polegadas, seguido por uma membrana de micropeneira celular. Utilize uma espátula estéril para aplainar a membrana e o papel filtro.

Em seguida, inverta a pilha sobre um monte de papel-toalha e comprima os materiais para remover a solução excedente de cloreto de cálcio. Depois, coloque um molde de formação de gel com poços cilíndricos sobre a membrana de micropeneira e use clipes de papel para prender suavemente o molde à placa terminal nos lados esquerdo e direito. Agora, empilhe um pedaço de papel-filtro grosso sobre uma pequena placa terminal, seguido por um pedaço de membrana de micropeneira, e inverta a pilha para remover qualquer excesso de cloreto de cálcio, conforme demonstrado anteriormente.

Quando ambas as metades do molde estiverem prontas, re-suspenda um vezes 10 à sexta potência de células de interesse por mililitro de meio estéril de alginato. A mistura apresentará uma aparência turva homogênea quando as células estiverem adequadamente dispersas. Em seguida, transfira 130 microlitros de células gota a gota para poços individuais de seis milímetros de diâmetro por três milímetros de altura na metade inferior do molde.

Um menisco convexo ligeiro deve ser visível acima da borda de cada poço. Quando todas as células tiverem sido semeadas, use uma espátula estéril para alisar cuidadosamente a metade superior do conjunto do molde. Em seguida, vire o molde de modo que a membrana de micropeneira fique voltada para cima dos poços e posicione o molde sobre os poços, tomando cuidado para cobrir completamente os poços contendo as misturas de células e alginato.

Quando o molde estiver no lugar, levante o conjunto do molde carregado e, pressionando firmemente o centro, coloque grampos de papel nos outros dois lados do conjunto para fixar as metades superior e inferior do molde. As soluções de alginato com células devem estar firmemente acomodadas nos poços. Em seguida, mergulhe todo o conjunto do molde em um banho de cloreto de cálcio 102 milimolar em uma cabine de cultura celular à temperatura ambiente por 90 minutos.

No final da incubação, transfira o conjunto para uma pilha de toalhas de papel e remova os dois clipes que prendem a placa superior ao molde. Separe as duas metades do conjunto. Os hidrogéis formados nos poços não devem apresentar bolhas e devem preencher completamente os poços.

Remova os dois clipes restantes e separe o molde contendo o hidrogel da placa final remanescente. Usando uma espátula, siga cuidadosamente a borda dos poços que contêm os hidrogéis para soltar suavemente os géis. Em seguida, transfira os hidrogéis diretamente para um banho de DPBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.

Após um a cinco minutos, transfira os hidrogéis para poços individuais de uma placa de seis poços contendo solução suficiente de meio de crescimento de manjericão para imergir completamente os géis por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius e 5 por cento de CO2. Durante os últimos 30 minutos da incubação, use clipes de papel para prender o molde com poços com metade da altura do molde de formação de géis à placa de extremidade de alumínio de três por três polegadas ou três por 1,5 polegadas nos lados esquerdo e direito, a fim de criar um molde de corte. Em seguida, crie o modo de recozimento prendendo com clipes o molde com poços maiores em três milímetros de diâmetro do que o molde de formação de géis às placas de extremidade de alumínio de três por três polegadas nos lados esquerdo e direito.

Agora, transfira os hidrogéis para os poços da matriz de corte. Cada gel deve encaixar-se firmemente no poço, com metade do gel projetando-se acima da matriz. Em seguida, use um bisturi para cortar ao longo da superfície da matriz e dividir o hidrogel ao meio.

Gire a metade superior do gel e coloque-a em um poço aberto do molde. O pedaço de gel deve encaixar-se firmemente no poço, mas agora ambas as metades devem ter a altura do molde, com a superfície interna cortada visível. Em seguida, coloque um pedaço de membrana seca de microfiltro para células sobre os poços, certificando-se de que a membrana entre em contato com todas as metades do gel a serem fundidas, e cubra a membrana com um pedaço de papel filtro grosso.

Quando os géis estiverem completamente cobertos, sature o papel filtro com citrato de sódio suplementado com EDTA e incube os géis à temperatura ambiente. Após um minuto, descarte a membrana micropeneira celular e o papel filtro grosso e remova as grampos de ligação. Em seguida, abra o molde e transfira metade de um gel para um molde de anelamento preparado, com a superfície cortada voltada para cima.

Usando uma espátula, transfira a segunda metade do gel tratado para cima do primeiro gel, de modo que a superfície cortada entre em contato com a superfície cortada do primeiro gel. Quando todos os géis tiverem sido posicionados, use uma espátula para pressionar suavemente os géis e remover quaisquer bolhas, e submerja cuidadosamente o molde de anelamento na banho de cloreto de cálcio. Após 30 minutos, transfira o molde de anelamento para uma pilha de toalhas de papel e remova os clipes de fixação.

Em seguida, separe o molde da placa final e transfira os géis brevemente para um banho de DPBS, seguido pela imersão em meio de cultura celular apropriado. Os géis bilaminares concluídos exibem uma separação inicial completa das populações celulares, conforme observado nesta imagem de células 293 FT marcadas com corantes verdes ou vermelhos para rastreamento celular. A viabilidade de células-tronco mesenquimais humanas incorporadas após o recozimento é alta dentro dos hidrogéis em camadas, semelhante à viabilidade celular observada em hidrogéis maciços.

Após isolar a tensão máxima de cada ciclo durante uma compressão cíclica não confinada de quatro horas, os hidrogéis estratificados livres de células exibem uma resposta de tensão à compressão cíclica significativamente menor em magnitude em comparação com hidrogéis maciços não estratificados livres de células, mesmo que ambos os tipos de hidrogel permaneçam intactos após sete dias em cultura. Uma vez dominada, esta técnica, incluindo a preparação de todos os materiais, pode ser concluída em menos de quatro horas e meia se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar com cuidado e lentamente para evitar erros e facilitar o acompanhamento das diferentes amostras.

Após este procedimento, outros métodos como estimulação mecânica e imunomarcação podem ser realizados para responder questões adicionais sobre as interações entre as diferentes populações celulares nas matrizes extracelulares que podem se formar. Esta técnica permitirá aos pesquisadores da área de mecanobiologia e engenharia de tecidos investigar mais facilmente a relação entre diferentes populações celulares, como células-tronco mesenquimais, condrocitos e células do núcleo pulposo. Não se esqueça de que o trabalho com materiais cortantes, materiais biológicos e, especialmente, células humanas, pode ser extremamente perigoso, e que precauções, como o uso de vestimentas de proteção pessoal apropriadas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.