Name: Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a criar discos de hidrogel de alginato bicamada para estudar interações entre populações celulares em co-cultura 3D. Esta técnica econômica e reprodutível facilita pesquisas em engenharia de tecidos e fisiologia de tecidos de carga.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Preparação para a Formação de alginato de Discos <ol><li> Prepara-se uma 4% (w / v) em solução de alginato de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco sem cloreto de cálcio adicionado ou cloreto de magnésio e colocar num banho de água a 37 ° C. As concentrações da solução de alginato pode variar, mas 1-4% (w / v) de soluções de alginato são recomendados. </li><li> Misturar a solução de alginato a uma razão de 1: 1 com a base de meios de cultura de célula quente (por exemplo, Modified Eagle Médium da Dulbecco.) Para o tipo de célula desejado. A concentração de alginato é agora metade da concentração original, isto é., 2% (w / v). Esterilizar solução de alginato / mídia usando filtros de seringa de nylon de 0,2 um estéreis. </li><li> Preparar um banho de cloreto de cálcio di-hidratado 102 mM estéril em água estéril com solução suficiente para submergir moldes (~ 200 - 300 ml). </li><li> Recolher o estéril &quot;molde de formação de gel&quot; (diâmetro x 3 mm poços cilíndricos de altura de 6 mm em um 3 in x 3 em chapa de alumínio, consulte <strong&gt; Figura 1) e placas terminais (inferior: um 3 em x 3 em chapa de alumínio, Top: um 1,5 em x 3 em chapa de alumínio) e preparar moldes da seguinte forma: <ol><li> Cortar papel grosso filtro (filtro de papel mata-borrão) ea membrana microsieve celular (10 de tamanho de poro) para os tamanhos de parte superior e placas terminais inferiores e colocá-los no banho de cloreto de cálcio até à saturação, a cerca de 1 min. Se desejado, esterilizar o papel de filtro grosso e a membrana microsieve através de autoclave ou luz ultravioleta durante 30 min antes da utilização. </li><li> Defina-se a metade (metade inferior) da construção de moldes. <ol><li> Colocar os seguintes itens cima da outra na seguinte ordem e suavizar usando uma espátula estéril: grande placa terminal (3 em x 3 pol), papel de filtro de espessura, e, em seguida, a membrana microsieve. </li><li> Invertido e pressionar o molde para uma pilha de toalhas de papel para assegurar a perda de excesso de solução de cloreto de cálcio. </li><li> Coloque a &quot;gel de molde de formação&quot;, com os poços cilíndricos no topo do cell membrana microsieve e suavemente aperte o molde juntos em dois lados usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo. Certifique-se de deixar espaço suficiente para a parte superior da placa terminal (1,5 in x 3 in) para cobrir os poços completamente mais tarde. </li></ol></li><li> Defina-se a segunda metade (metade superior) da construção de moldes. <ol><li> Coloque os seguintes itens em cima de um ao outro na seguinte ordem e suavizar: pequena placa terminal, papel de filtro grosso, membrana microsieve. </li><li> Invertido e pressiona esta metade do molde sobre uma pilha de toalhas de papel para assegurar a perda de excesso de solução de cloreto de cálcio. Não fixe nesta parte do molde utilizando grampos da pasta no momento. </li></ol></li></ol></li><li> células de cultura, tal como recomendado por instruções do fabricante. Colheita das células desejadas para incorporar nos hidrogéis de alginato em camadas. A densidade celular recomendada é de 1 - 2 x 10 6 células / ml, mas isto pode ser variado dependendo experiências desejadas. Nota: Ao usar este métodopara fazer camadas com diferentes tipos de células, certifique-se de cultura dois tipos de células em paralelo para mergulhar. As células estaminais mesenquimais (MSCs) semeadas a uma densidade celular de 1 x 10 6 células / ml será utilizado como um exemplo para o seguinte protocolo. O número de células e o número de disco pode ser dimensionado para as experiências conforme necessário. <ol><li> Uma a duas semanas antes da incorporação, as células estaminais mesenquimais semente a uma densidade celular de 3000 - 5000 células / cm2 em 10 mL de meio de crescimento basal (Dulbecco Modified Eagle Médium, 10% de Soro Fetal Bovino, 2% de L-Glutamina, 1 % Aminoácidos não essenciais, 1% de penicilina / estreptomicina) em frascos T-75. </li><li> Remova a mídia passou a cada 2 - 3 dias, e substituir com 10 ml de meio de crescimento basal até que as células são 80 - 90% confluentes. </li><li> Para colher as células, remova meio gasto e pipeta de 3 ml de 1x Dulbecco salina de tampão fosfato sem cloreto de cálcio adicionado ou cloreto de magnésio para lavar as células. Remover esta solução, pipeta 3 ml de 0,25% Trypsin-EDTA sobre as células que crescem em frascos T-75, e incubar durante 5 min a 37 ° C. Após as células têm levantado da superfície aderente, adicionar 6 - 9 ml de meio de crescimento basais. </li><li> MSCs centrifugue-as a 600 xg durante 5 min à temperatura ambiente, aspirar o sobrenadante e re-suspensão em 1-5 ml de meio de crescimento basais. Contar as células usando um hemocitômetro utilizando as instruções do dispositivo. </li><li> Retirar 1 x 10 6 células da resuspensão de células totais, de centrifugação utilizando as mesmas condições, e aspirar o sobrenadante. </li></ol></li></ol> 2. Formação de celulares Seeded alginato Discs <ol><li> Re-suspender o sedimento de células com 1 ml de solução de alginato / meios estéreis para atingir uma densidade celular de 1 x 10 6 células / ml. A mistura de células-alginato será homogeneamente um aspecto turvo, quando as células são misturadas de forma adequada. </li><li> Pipete 130 pi da mistura de células-alginato em poços seis altos 6 mm de diâmetro x 3 mm na metade inferior do moldeconstruir gota a gota, de modo a não criar quaisquer bolhas. Um ligeiro menisco convexo deve ser visível acima do bordo de cada poço. </li><li> Cuidadosamente suavizar a metade superior da construção do molde usando uma espátula estéril e entregá-lo, de modo que a membrana da célula é microsieve na parte superior dos poços. Coloque o molde na construção de topo dos poços, tendo o cuidado de cobrir os poços que contêm células e a mistura de alginato completamente. </li><li> Levante a construção do molde carregado e, enquanto pressiona firmemente no centro, Mola os restantes dois lados (superior e inferior) para prender as metades superior e inferior da construção do molde. As soluções de células-alginato deve ser firmemente situado nos poços neste momento. </li><li> Mergulha-se o construto de molde fixada no banho de cloreto de cálcio 102 mM, certificando-se que toda a construção é submerso. Incubar na capa de cultura de células à temperatura ambiente durante 90 min. </li><li> No final dos 90 minutos, remover a construção do molde a partir do cloreto de cálcio 102 mMbanho e coloque em uma pilha de toalhas de papel na capa de cultura de células. Remove todos os quatro grampos da pasta e separar as duas metades do molde de construção. Hidrogéis formados nos poços não deve ter quaisquer bolhas e deve encher os poços completamente. </li><li> Com uma espátula, rastrear cuidadosamente o bordo dos poços contendo os hidrogéis para soltar cuidadosamente e cunha os hidrogeles. Depois de retirar os hidrogeles a partir da construção de moldes, soltar os hidrogéis directamente para um banho de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, com o cloreto de cálcio e cloreto de magnésio. Cobrir os geles completamente para lavar o excesso de solução de cloreto de cálcio para 1-5 min. </li><li> Transferir os hidrogeles em solução basal meio de crescimento em prato desejado (por ex., Placas de 6 cavidades) que cobre completamente os hidrogeles. Incuba-se durante pelo menos 1 hora na incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO 2 antes de continuar para o passo de estratificação. Nota: Os hidrogeles que contêm as células podem ser mantidas ema incubadora de cultura de células indefinidamente neste momento até camadas de géis com uma outra população celular é desejada, desde que mudanças de suporte são concluídos a cada 2 - 3 dias. </li></ol> 3. Camadas de alginato de Discos <ol><li> Durante a última meia hora da incubação de 1 hora, recolher e preparar moldes e solução estéril para o recozimento os géis. <ol><li> Prepara-se o &quot;molde de corte&quot; pela fixação de um molde que tem cavidades de metade da altura do &quot;molde de formação de gel&quot; (6 mm de diâmetro x 1,5 mm de poços altos em um 3 em x 3 na placa de alumínio) a uma placa terminal (3 em x 3 em chapa de alumínio) usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo. </li><li> Preparar o &quot;molde de recozimento&quot;, fixando um molde que é de 3 mm de diâmetro maior do que o &quot;molde de formação de gel&quot; (9 mm de diâmetro x 3 mm poços altos em um 3 in x 3 em chapa de alumínio) a uma placa terminal (3 in x 3 em chapa de alumínio) usando grampos da pasta nos lados direito e esquerdo. </li><li> Prepara-se uma solução decitrato de sódio 100 mM / EDTA 30 mM (di-hidrato de citrato de sódio, di-hidrato de sal tetrassódico etilenodiaminotetra-acético ácido) em água estéril. </li></ol></li><li> Remover géis de populações de células desejadas (neste exemplo, dois discos com hMSCs) dos meios de comunicação no prato e colocar nos poços &quot;corte do molde&quot;. Cada gel deve caber confortavelmente nas cavidades com metade do gel salientes acima do molde. </li><li> Utilizando um bisturi, cortar o gel ao longo da superfície do molde (isto reduzirá o hidrogel em meio). Virar a metade superior do gel e colocá-lo em um poço de molde aberto. A metade do gel também deve caber dentro do molde bem, mas agora ambos os géis metade deve ser a altura do molde, com a superfície interior cortado visível. Repita com o segundo gel. Nota: Atenção: Só as superfícies de corte interiores irá formar discos em camadas. Usando as superfícies exteriores resultará na separação metades. Suspeita-se que a textura da membrana microsieve transferida para a superfície do gel de evitarO sucesso do processo de recozimento. </li><li> Coloque um pedaço de membrana celular microsieve seco no topo das cavidades, certificando-se que a membrana microsieve está em contacto com todas as metades de gel a ser recozido e cobrindo-as totalmente. Coloque papel de filtro grossa no topo da membrana microsieve, certificando-se de cobrir completamente os géis. </li><li> Pipetar uma solução de citrato de sódio 100 mM / EDTA 30 mM (di-hidrato de citrato de sódio, di-hidrato de sal tetrassódico etilenodiaminotetraacético ácido) para o papel de filtro de espessura até que seja saturado. Cerca de 750 ul é suficiente para quatro poços. </li><li> Incubar os géis durante 1 min à temperatura ambiente. Em seguida, retire a membrana microsieve celular e papel de filtro grosso e descartá-las. Remova os grampos da pasta e abrir o molde. </li><li> Para cada gel recozido, transferir um citrato de sódio half / tratado com EDTA do hidrogel ao preparado &quot;molde de recozimento&quot;, com superfície de corte virada para cima. Isto será um meio de const recozidoruct. </li><li> Usando uma espátula, levantar e colocar a / half-gel tratado com EDTA citrato de segunda sódio (pode conter um tipo de célula diferente) sobre o gel já no &quot;molde de recozimento&quot;, lançando nesta segunda meia-gel para que a superfície de corte está em contacto com a superfície do corte do gel já no &quot;molde de recozimento&quot;. </li><li> Pressione com cuidado os dois géis usando uma espátula para remover quaisquer bolhas de entre os dois géis. Além disso, reposicionar os géis, conforme necessário para garantir que eles estão directamente em cima uns dos outros. </li><li> Levante cuidadosamente o &quot;molde de recozimento&quot; e submergi-lo no banho de cloreto de cálcio 102 mM durante 30 minutos. Não cubra os poços com uma placa terminal. </li><li> Após a incubação de 30 minutos, retire o &quot;molde de recozimento&quot; e colocá-lo para toalhas de papel. Remova os grampos da pasta e separar o molde da placa terminal. </li><li> Com uma espátula, recolher os géis recozidos e colocá-los em uma de 1x Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, com o cloreto de cálcio e mbanho de cloreto de agnesium para lavar os géis. Subsequentemente, transferir hidrogéis recozidos a meios de cultura de células em um prato desejado (por ex., Placa de 6 poços) durante a cultura. </li></ol>

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<li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a formação de discos de hidrogel de alginato em camadas para estudar a co-culturas de várias populações de células, tais como aqueles em tecidos fisiologicamente em camadas, por exemplo, cartilagem. estruturas em camadas, tal como a plataforma de cultura descrito, pode ser usado para examinar a interacção entre as duas populações de células distintas sujeitos ao mesmo ambiente de cultura ou sob carga. O alginato é um polissacarídeo linear anió...

tecidos que suportam cargas de compressão, tais como a cartilagem articular ou discos intervertebrais consistem em regiões de tecidos heterogéneos que são críticas para a função tanto biomecânico e mecano-transdução adequada no tecido. Não só é a organização celular e a função distinta em diferentes regiões, mas as matrizes extracelulares (ECM) são também variou em composição e organização. Por exemplo, a cartilagem articular é constituído por três zonas primárias com morfologia, variando de células, função mecânica, e ECM. As diferenças na sua vantagem ECM para diferencial responsabilidades suporte de carga; a camada superficial está envolvida principalmente em resposta à tração para carregar, enquanto as zonas média e profunda são principalmente responsáveis ​​pela resposta à compressão 1. Da mesma forma, no disco intervertebral, um núcleo pulposo do tipo gel é rodeado por um anel fibrose lamelar e as células dentro dessas duas áreas distintas experimentar diferentes tipos de estímulos biofísicos2. Nestes tipos de tecidos, células e as matrizes extracelulares no interior das camadas de tecido interagir uns com os outros como o tecido sofre e responde a forças mecânicas. Recapitulação de tais estruturas de tecidos heterogêneos continua a ser um desafio em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, e nossa compreensão de seu significado biológico é limitado. Existe uma necessidade para a cultura de plataformas para analisar tecidos estratificados, bem como co-culturas de diferentes populações de células dentro de uma construção. Na engenharia de tecidos de cartilagem articular, construções de andaime-menos camadas foram construídos através do aproveitamento da capacidade dos condrócitos zonal para depositar ECM variou para imitar as diferentes camadas desse tecido 3,4. No entanto, as construções de hidrogel em camadas proporcionam uma oportunidade para estudar a interacção de diversos tipos de populações de células que não possuem a capacidade para formar um tecido robusto independentemente. Por exemplo, pop diferenteulations de células estaminais mesenquimais podem ser co-cultivadas dentro de construções em camadas. Tais andaimes em camadas têm sido utilizados com ambas condrócitos e diferenciação de células-tronco mesenquimais para melhorar a engenharia de tecidos 5. Não só pode ser co-cultivadas em populações de células diferentes camadas de hidrogel semelhantes, mas um único tipo de células também podem ser cultivadas dentro de camadas que foram manipuladas para ter diferentes rigidez ou conteúdo bioquímico para desencadear respostas diferentes a partir de células de 6,7. Muitos hidrogeles biomaterial diferentes têm sido utilizados para a camada de populações de células para engenharia de tecidos de cartilagem, tais como aqueles utilizando polietileno-glicol ou álcool polivinílico bases 7-9. No entanto, os hidrogéis de alginato são um dos biomateriais mais simples do que para criar andaimes em camadas para o estudo de populações de células heterogéneas em co-cultura. Embora os hidrogéis de agarose são também facilmente formado, hidrogéis de alginato tem a vantagem adicional de permitir fácil éolation de células a partir da construção 3-D para a análise de células individuais como foi anteriormente descrito 10. Em estudos anteriores, os hidrogéis de alginato bi-camadas foram formadas em folhas finas e a partir destas folhas, secções foram cortados (por exemplo., Utilizando um punção de biópsia) para aplicações particulares, tais como por análise de conteúdo bioquímica ou propriedades de cisalhamento interfacial 11,12. Outro método para a formação de folhas finas de alginato tem sido descrita com o potencial para a estratificação em camadas múltiplas, mas mesmo assim iria requerer uma alteração ao hidrogel para utilização em testes mecânicos 13. Aqui, apresentamos um método para criar reproducibly discos de hidrogel de alginato bi-camadas para uso em co-cultura de diferentes populações de células. Esta plataforma disco de alginato possui várias vantagens. Em primeiro lugar, a forma reprodutível e tamanho pequeno é propício para a estimulação mecânica das células incorporados sem a necessidade de uma biópsia PUNCH ​​ou outra alteração física para o hidrogel para muitas aplicações. Além disso, a viabilidade das células permanece elevada durante o processo de separação e, após formação de gel uma clara separação das duas populações de células dentro do gel é visível sem região de sobreposição inicial.

<table><tbody><tr><td>Sal de sódio de ácido algínico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solução feita em wt% usando DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11965</td><td>Exemplo. Use</td></tr><tr><td>filtros de seringa do tipo meio desejado (0,02 &#956; m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Prepare a solução em água estéril</td></tr><tr><td>Papel de filtro Criterion Blotter</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Corte no tamanho das placas terminais para formação de mofo</td></tr><tr><td>Membrana de micropeneira celular (10 &#956; m tamanho dos poros)</td> <td>Biodesign Inc de Nova York</td><td>N10R</td><td>Corte ao tamanho das placas finais para formação de mofo</td></tr><tr><td>Citrato de sódio di-hidratado</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético sal tetrassódico di-hidratado (EDTA)</td> <td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino&nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>26140</td><td>Usado em exemplo meio de crescimento basal de células-tronco mesenquimais</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>15140</td><td>Usado no exemplo de meio de crescimento basal de células-tronco mesenquimais</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>25030081</td><td>Usado em exemplo meio de crescimento basal de células-tronco mesenquimais</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Usado em meios de crescimento basal de células-tronco mesenquimais de exemplo</td></tr></tbody></table>

em camadas de alginato constrói: uma plataforma para co-cultura de populações de células heterogéneas

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Muitos tecidos de suporte de carga possuem regiões estrutural e funcionalmente distintas, tipicamente acompanhadas por diferentes fenótipos celulares com características de mecanosenização diferencial. A engenharia e a análise desses tipos de tecidos continuam sendo um desafio. As construções de hidrogel em camadas fornecem uma oportunidade para investigar as interações entre várias populações de células dentro de construções únicas. Os hidrogéis de alginato são biocompatíveis e permitem fácil isolamento de células após experimentação. Aqui, descrevemos um método para o desenvolvimento de discos de hidrogel de alginato de camada dupla de pequeno porte. Este processo mantém a alta viabilidade celular das células-tronco mesenquimais humanas durante o processo de formação e esses discos em camadas podem suportar compressão cíclica não confinada, comumente usada para estimulação de hMSCs submetidas à condrogênese. Essas construções em camadas podem ser dimensionadas para incluir níveis adicionais e também ser usadas para segregar populações de células inicialmente após a estratificação. Esta plataforma de cultura de hidrogel de alginato de camada dupla pode ser usada para muitas aplicações diferentes, incluindo engenharia e análise de células de tecidos de suporte de carga e co-culturas de outros tipos de células.

A Figura 1 descreve a formação e estratificação dos hidrogéis de alginato. Completado géis bi-camadas exibem uma separação inicial completa de populações de células, como mostrado na Figura 2. A viabilidade celular das células estaminais mesenquimais humanas) incorporado dentro desses hidrogeles e camadas continua a ser elevada e comparável com os hidrogeles a granel, como mostrado na Figura 3. A viabilidade foi avaliada após o recozimen...

Engenharia e análise de tecidos de suporte de carga com populações de células heterogêneas ainda são um desafio. Aqui, descrevemos um método para criar discos de hidrogel de alginato em duas camadas como uma plataforma para co-cultura de diversas populações de células dentro de uma construção.

Em camadas de alginato Constrói: Uma Plataforma para Co-cultura de populações de células heterogéneas

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

O objetivo geral deste procedimento é criar de forma reprodutível discos de hidrogel de alginato com duas camadas para investigar as relações entre diferentes populações celulares durante o co-cultivo tridimensional. Este método facilita o estudo das interações entre múltiplas populações celulares em culturas tridimensionais espacialmente heterogêneas, o que pode ajudar a responder questões fundamentais na engenharia de tecidos e na fisiologia de tecidos sujeitos a cargas mecânicas. A principal vantagem desta técnica é que ela oferece uma maneira simples, econômica e reprodutível de construir hidrogéis de alginato com múltiplas camadas contendo células, cuja estrutura é favorável à estimulação mecânica.Demonstrará este procedimento Poonam Sharma, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para formar os discos de alginato, empilhe primeiro um pedaço de papel filtro grosso sobre uma placa terminal de três por três polegadas, seguido por uma membrana de micropeneira celular. Utilize uma espátula estéril para aplainar a membrana e o papel filtro.Em seguida, inverta a pilha sobre um monte de papel-toalha e comprima os materiais para remover a solução excedente de cloreto de cálcio. Depois, coloque um molde de formação de gel com poços cilíndricos sobre a membrana de micropeneira e use clipes de papel para prender suavemente o molde à placa terminal nos lados esquerdo e direito. Agora, empilhe um pedaço de papel-filtro grosso sobre uma pequena placa terminal, seguido por um pedaço de membrana de micropeneira, e inverta a pilha para remover qualquer excesso de cloreto de cálcio, conforme demonstrado anteriormente.Quando ambas as metades do molde estiverem prontas, re-suspenda um vezes 10 à sexta potência de células de interesse por mililitro de meio estéril de alginato. A mistura apresentará uma aparência turva homogênea quando as células estiverem adequadamente dispersas. Em seguida, transfira 130 microlitros de células gota a gota para poços individuais de seis milímetros de diâmetro por três milímetros de altura na metade inferior do molde.Um menisco convexo ligeiro deve ser visível acima da borda de cada poço. Quando todas as células tiverem sido semeadas, use uma espátula estéril para alisar cuidadosamente a metade superior do conjunto do molde. Em seguida, vire o molde de modo que a membrana de micropeneira fique voltada para cima dos poços e posicione o molde sobre os poços, tomando cuidado para cobrir completamente os poços contendo as misturas de células e alginato.Quando o molde estiver no lugar, levante o conjunto do molde carregado e, pressionando firmemente o centro, coloque grampos de papel nos outros dois lados do conjunto para fixar as metades superior e inferior do molde. As soluções de alginato com células devem estar firmemente acomodadas nos poços. Em seguida, mergulhe todo o conjunto do molde em um banho de cloreto de cálcio 102 milimolar em uma cabine de cultura celular à temperatura ambiente por 90 minutos.No final da incubação, transfira o conjunto para uma pilha de toalhas de papel e remova os dois clipes que prendem a placa superior ao molde. Separe as duas metades do conjunto. Os hidrogéis formados nos poços não devem apresentar bolhas e devem preencher completamente os poços.Remova os dois clipes restantes e separe o molde contendo o hidrogel da placa final remanescente. Usando uma espátula, siga cuidadosamente a borda dos poços que contêm os hidrogéis para soltar suavemente os géis. Em seguida, transfira os hidrogéis diretamente para um banho de DPBS com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio.Após um a cinco minutos, transfira os hidrogéis para poços individuais de uma placa de seis poços contendo solução suficiente de meio de crescimento de manjericão para imergir completamente os géis por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius e 5 por cento de CO2. Durante os últimos 30 minutos da incubação, use clipes de papel para prender o molde com poços com metade da altura do molde de formação de géis à placa de extremidade de alumínio de três por três polegadas ou três por 1,5 polegadas nos lados esquerdo e direito, a fim de criar um molde de corte. Em seguida, crie o modo de recozimento prendendo com clipes o molde com poços maiores em três milímetros de diâmetro do que o molde de formação de géis às placas de extremidade de alumínio de três por três polegadas nos lados esquerdo e direito.Agora, transfira os hidrogéis para os poços da matriz de corte. Cada gel deve encaixar-se firmemente no poço, com metade do gel projetando-se acima da matriz. Em seguida, use um bisturi para cortar ao longo da superfície da matriz e dividir o hidrogel ao meio.Gire a metade superior do gel e coloque-a em um poço aberto do molde. O pedaço de gel deve encaixar-se firmemente no poço, mas agora ambas as metades devem ter a altura do molde, com a superfície interna cortada visível. Em seguida, coloque um pedaço de membrana seca de microfiltro para células sobre os poços, certificando-se de que a membrana entre em contato com todas as metades do gel a serem fundidas, e cubra a membrana com um pedaço de papel filtro grosso.Quando os géis estiverem completamente cobertos, sature o papel filtro com citrato de sódio suplementado com EDTA e incube os géis à temperatura ambiente. Após um minuto, descarte a membrana micropeneira celular e o papel filtro grosso e remova as grampos de ligação. Em seguida, abra o molde e transfira metade de um gel para um molde de anelamento preparado, com a superfície cortada voltada para cima.Usando uma espátula, transfira a segunda metade do gel tratado para cima do primeiro gel, de modo que a superfície cortada entre em contato com a superfície cortada do primeiro gel. Quando todos os géis tiverem sido posicionados, use uma espátula para pressionar suavemente os géis e remover quaisquer bolhas, e submerja cuidadosamente o molde de anelamento na banho de cloreto de cálcio. Após 30 minutos, transfira o molde de anelamento para uma pilha de toalhas de papel e remova os clipes de fixação.Em seguida, separe o molde da placa final e transfira os géis brevemente para um banho de DPBS, seguido pela imersão em meio de cultura celular apropriado. Os géis bilaminares concluídos exibem uma separação inicial completa das populações celulares, conforme observado nesta imagem de células 293 FT marcadas com corantes verdes ou vermelhos para rastreamento celular. A viabilidade de células-tronco mesenquimais humanas incorporadas após o recozimento é alta dentro dos hidrogéis em camadas, semelhante à viabilidade celular observada em hidrogéis maciços.Após isolar a tensão máxima de cada ciclo durante uma compressão cíclica não confinada de quatro horas, os hidrogéis estratificados livres de células exibem uma resposta de tensão à compressão cíclica significativamente menor em magnitude em comparação com hidrogéis maciços não estratificados livres de células, mesmo que ambos os tipos de hidrogel permaneçam intactos após sete dias em cultura. Uma vez dominada, esta técnica, incluindo a preparação de todos os materiais, pode ser concluída em menos de quatro horas e meia se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar com cuidado e lentamente para evitar erros e facilitar o acompanhamento das diferentes amostras.Após este procedimento, outros métodos como estimulação mecânica e imunomarcação podem ser realizados para responder questões adicionais sobre as interações entre as diferentes populações celulares nas matrizes extracelulares que podem se formar. Esta técnica permitirá aos pesquisadores da área de mecanobiologia e engenharia de tecidos investigar mais facilmente a relação entre diferentes populações celulares, como células-tronco mesenquimais, condrocitos e células do núcleo pulposo. Não se esqueça de que o trabalho com materiais cortantes, materiais biológicos e, especialmente, células humanas, pode ser extremamente perigoso, e que precauções, como o uso de vestimentas de proteção pessoal apropriadas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de uma matriz microactuator de posts verticalmente deslocadas em que a tecnologia é baseada, e como essa tecnologia base pode ser modificado para conduzir alto rendimento de cultura de células mecanicamente dinâmica em ambos cultura bidimensional e tridimensional paradigmas.

Plataformas microfabricated para cultura de células mecanicamente dinâmico

Cultura de células normais em seu contexto tridimensional representa um método alternativo para estudar os eventos iniciais necessárias para a transformação celular e tumorigênese. Este método é usado para crescer ovariano normal e células oviductal para estudar os eventos iniciais na formação de câncer de ovário.

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Nas seções seguintes, que definirá procedimentos para a preparação de microesferas de alginato para uso em aplicações biomédicas. Nós especificamente ilustram uma técnica para a criação de várias camadas de alginato microesferas para a dupla finalidade de célula e de encapsulamento proteína como um tratamento potencial para a diabetes tipo 1.

Geração de alginato Microesferas para aplicações biomédicas

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Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

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Microambientes sanduíche-como aproveitarar Telemóveis / interações materiais

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Modelo de co-cultura usando dois tipos de linhagens celulares aderentes

Aprenda a criar discos de hidrogel de alginato bicamada para estudar interações entre populações celulares em co-cultura 3D. Esta técnica econômica e reprodutível facilita pesquisas em engenharia de tecidos e fisiologia de tecidos de carga.

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