Name: Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a isolar complexos de ARN-proteína em células eucarióticas usando eluição direcionada por oligonucleotídeos. Este método revela a composição de proteínas de ligação ao ARN em transcritos retrovirais, incluindo a helicase DHX9/RHA.

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Os autores agradecem o apoio pelo NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tampão composições </td></tr><tr><td> Tampão de Lavagem: </td></tr><tr><td> mM de Tris-HCl a 50, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mM de NaCl </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> Tampão de baixo teor de sal: </td></tr><tr><td> mM de Tris-HCl a 20, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 10 mM de NaCl </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> 2 mM de DTT </td></tr><tr><td> 1x cocktail inibidor de protease livre EDTA- </td></tr><tr><td> RNase Out 5 ul / ml (inibidor de RNase) </td></tr><tr><td> Citoplasmático de tampão de lise: </td></tr><tr><td> 0,2 M de sacarose </td></tr><tr><td> 1,2% de Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETN-150 Tampão de Lavagem: </td></tr><tr><td> mM de Tris-HCl a 20, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mMNaCl </td></tr><tr><td> 0,5% de NP-40 </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> 10% de Glicerol </td></tr><tr><td> Tampão de Ligação: </td></tr><tr><td> HEPES 10 mM, pH 7,6 </td></tr><tr><td> KCl 40 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> 2 mM de DTT </td></tr><tr><td> 5% de glicerol </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Composições de memória intermédia. 1. Preparação de células e com a matriz de afinidade <ol><li> A cultura de uma linha celular de interesse à sub-confluência (80%) numa placa de 10 cm. Utilizar placas de 10 cm para imunoprecipi independentes (IP) de uma proteína de revestimento de MS2-NLS marcado com FLAG. Execute o IP utilizando anti-soros para a marca de epitopo-FLAG. Ao expressar o MS2 plasmídeo proteína de revestimento marcado com FLAG, as células transfectar 24-48 h antes da colheita 20. NOTA: A RNP particular pode ser enriquecida a partir nuclear ou citoplasmaOs lisados ​​de IC ou uma preparação bioquimicamente fraccionadas, tais como fracções de gradiente de sacarose. Recomenda-se a colheita do ligado de células não transfectadas em paralelo para instituir um controlo negativo adicional. </li><li> Transferir 60 uL por IP de proteína G suspensão esférulas magnéticas para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. </li><li> Colocar o tubo em uma cremalheira íman para tubos de microcentrífuga para separar os grânulos a partir da solução de armazenamento. </li><li> Retirar a solução de armazenamento, chamando-o cuidadosamente com uma micropipeta. </li><li> Retire o tubo do rack ímã. </li><li> Lavagem e equilibrar as contas com 600 ul (10 vezes o volume utilizado de esferas) de 1x tampão de lavagem (Tris-HCl a 20, pH 7,4; MgCl2 3 mM, e NaCl 150 mM) e-sobre-extremidade final da rotação durante 3 min à temperatura ambiente. </li><li> Colocar o tubo na cremalheira ímã e remova o tampão de lavagem. </li><li> Adicionar 10 volumes (600 ul) de tampão de lavagem 1x e anticorpo FLAG imunoprecipitar ao pr equilibradaotein G esferas magnéticas (de acordo com a quantidade recomendada pelo fabricante para uma imunoprecipitação) e rodar para a sobre-extremidade final à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min para conjugar o anticorpo imunoprecipitação. Utilizar a IgG de isotipo correspondente como um controlo negativo de anticorpo adequado. </li><li> Colocar o tubo na cremalheira íman para recolher as esferas e para remover o sobrenadante. </li><li> Remover o tubo a partir da cremalheira íman e lavar as esferas de anticorpo conjugado com 10 volumes (600 L) de tampão de lavagem 1x e rotação durante 3 min, à temperatura ambiente. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Colocar o tubo na cremalheira ímã e remova o tampão de lavagem. </li></ol> 2. A colheita da RNP Nota: Preparar a RNP durante o tempo de incubação após o passo 1.8. <ol><li> Remover o meio de cultura das células por aspiração e lavar as células duas vezes com 1-5 ml de gelo-frio 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Use um raspador de células para desalojar molhado,células aderentes antes da colheita por centrifugação a 226 xg durante 4 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 375 ul de gelado, tampão de baixo teor salino (Tris-HCl a 20, pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 10 mM de NaCl; 2 mM de DTT; 1x cocktail inibidor de protease, isento de EDTA; e 5 ul / ml Inibidor de RNase) para o sedimento celular e permitir inchaço, colocando-o em gelo durante 5 min. NOTA: Tailor o volume de tampão de baixo teor salino de acordo com o tamanho do agregado de células. Para 1,2 x 10 6 células de uma placa de 10 cm, 375 ul de tampão é suficiente. </li><li> Para recolher o lisado celular citoplasmática, adicionar 125 ul de tampão de lise arrefecido com gelo (sacarose 0,2 M / 1,2% de Triton X-100), e, em seguida, executar 10 pancadas com um homogeneizador de Dounce que foi pré-arrefecido num balde de gelo. NOTA: Para recolher o extracto celular total, tampão de lise RIPA padrão é recomendada para solubilizar o nucleoplasma / cromatina. </li><li> Rotação numa microcentrífuga a velocidade máxima (16000 xg) durante 1 min; isso vai limpar o sobrenadante de detritos de umanúcleos nd. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,7 mL que foi em gelo. Determinar a concentração de proteína total através de uma norma, o método preferido em laboratório, tais como o Ensaio de Bradford 23. Reserva-se uma alíquota de pelo menos 10% para uma análise de transferência de Western, para ser usado como um controle de entrada. Use o ligado de células colhidas imediatamente para imunoprecipitação ou armazená-lo a -80 ° C para análise futura. NOTA: Em nossa experiência, estas amostras podem ser armazenados e utilizados vários meses mais tarde para análise de imunoprecipitação, sem um compromisso de integridade. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol><li> Adicionar o volume desejado do lisado de células colhida, com base na concentração de proteína foi determinada na etapa 2.5, com as esferas de anticorpo conjugado alvo. Usando 1X tampão de lavagem, levar o volume total até 600 uL e girar extremidade-sobre-extremidade durante 90 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Este período de tempo é suficiente para gerarum isolamento sólido de complexos de RNP de afinidade elevada, minimizando a ligação não específica. Diluir RNP fontes alternativas, tais como as fracções de gradiente de sacarose, de pelo menos 1: 1 com tampão de lavagem 1x e, em seguida, incuba-los com complexos de anticorpo-grânulo previamente preparados, como mencionado acima. </li><li> Após 90 minutos de incubação, colocar o tubo IP na prateleira ímã para recolher as contas. Reservar o sobrenadante como por escoamento. NOTA: Este primeiro flow-through é uma amostra de controlo importante para medir a eficiência IP. Um ensaio de imunotransferência irá fornecer uma indicação da eficiência de IP, bem como a especificidade das interacções investigados. Recomenda-se manter este sobrenadante para análise a jusante. </li><li> Lavar as, esferas de anticorpo conjugado ligado a RNP com 10 volumes (600 L) de NETN-150 tampão de lavagem arrefecido com gelo (Tris-HCl a 20, pH 7,4; NaCl 150 mM; MgCl2 3 mM; NP40 a 0,5%; e glicerol a 10%), sob rotação durante 3 min, à temperatura ambiente. Repita o passo 3 vezes. NOTA: Este tampão difere do tampão de lise e reduz eficazmente associações fracas ou não-específicas. </li><li> Após a lavagem final, ressuspender os complexos RNP imobilizada em 60 ul de tampão gelado 1x de ligação (HEPES 10 mM, pH 7,6; KCl 40 mM; MgCl2 3 mM; glicerol a 5%, e 2 mM de DTT) e de reserva de 10% dos grânulos complexos imobilizados por Western blot e 20% para o isolamento de ARN. </li></ol> 4. eluição <ol><li> Ajustar o volume remanescente para 100 ul com tampão de ligação arrefecido com gelo 1x e aquecer o tubo a 70 ° C durante 3 min. </li><li> Para isolar complexos de ARN-proteína cognatos, adicionar um oligonucleótido de ADN de ~ 30 nt que é complementar ao contorno da sequência 3 &#39;do ARN de interesse e incuba-se durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave (100 nM de oligonucleótido é suficiente). NOTA: O oligonucleótido é anti-sentido para os resíduos de nucleótidos adjacentes, para o início da tradução do local da construção PCE usados ​​como um example neste protocolo. complementaridade sequência apropriada é fornecido pelo teor de GC ~ 40%. Desenhar o oligonucleótido anti-sentido para a hibridação eficaz para a região mínima complementar do RNA alvo. </li><li> Adicionar 5-10 unidades de ARNase H para o tubo e incubar à temperatura ambiente durante 1 h para clivar o ARN do ARN: ADN híbrido. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrifugação esterilizado de 1,7 mL; Este exemplo contém os complexos RNP capturados de interesse. NOTA: Dependendo da acessibilidade do ARN cognato, dois ou mais ciclos de tratamento com RNase H podem ser úteis para aumentar a abundância da amostra para as análises a jusante. </li><li> Usar 20% do eluato de uma transferência de Western de proteínas associadas conhecidas e 20% do eluído para isolamento do ARN seguida por RT qPCR. Os restantes 60% pode ser usado para a espectrometria de massa para identificar ou componentes proteicos. </li><li> Em paralelo, submeter-se uma alíquota do lisado celular reservada para isolamento de ARN e a análise de RT-PCR. este assessment fornece uma indicação do enriquecimento de ARN dentro de um complexo de RNP. NOTA: Utilize a preparação proteína isolada em um western blot controle para verificar que a clivagem RNase H foi eficaz na liberação da RNP do complexo immunuoprecipitated. </li></ol> 5. Proteína Análise Eletroforese e Western Blot <ol><li> Objecto de aproximadamente 10-20% do total da amostra de SDS-PAGE e análise de imunotransf erência de acordo com protocolo padrão de laboratório. NOTA: Este passo serve para validar a eficiência e especificidade de IP antes da análise do RNA a jusante. Ele também pode ser usado para avaliar a composição de proteína do complexo RNP isolado. </li></ol> 6. Coleta do RNA imunoprecipitadas NOTA: O isolamento de RNA pode ser feito pelo método de Trizol ou seguindo o protocolo descrito. <ol><li> Ressuspender metade do total da amostra em 750 ul de reagente de ácido tiocianato de guanidina e incubar a sala temperatura durante 5 minutos antes da extracção do ARN a partir dos complexos de RNP PCE-capturados. </li><li> Adicionar 200 ul de clorofórmio a de o tubo, agitar vigorosamente durante 10 segundos, e incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Após centrifugação a 16000 xg durante 15 min a 4 ° C, recolher a fase aquosa para um tubo novo e adicionar um volume igual de isopropanol. Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min. Adicionar 1 ml de azul-glicol para a amostra e armazená-lo a -20 ° C no congelador por precipitação ou de processamento eficiente em uma data futura. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante, de modo a não perturbar o sedimento de ARN; a utilização de uma ponta de micropipeta P-200 é recomendado para facilitar este processo. </li><li> Adicionar 500 ul de etanol a 75% a cada tubo, vórtice, e centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante como no passo 6.4. Ar-secar o sedimento durante 2-3 min e ressuspender em 100 mL de água isenta de RNase. NOTA: Não prolongar o tempo o ar-pelota seca, a fim de evitar um problema com a ressuspensão. </li><li> Adicionar 100 ul de amostra de ARN a uma coluna de ARN de limpeza. Processá-lo usando o protocolo do fabricante. Eluir o RNA em 30 mL de água livre de RNase e armazenar a -80 ° C por até 3 meses. NOTA: Este RNA isolado é adequado para análise de jusante por RT-PCR em tempo real (qPCR), microarray, e seqüenciamento RNA. Dependendo da abundância do RNP e a eficiência com a qual a RNP de interesse é isolado, o mesmo lisado pode ser submetido a dois ou mais ciclos de IP para gerar ARN suficiente aplicável para as análises a jusante. </li></ol> A transcrição reversa de ARN e 7. A amplificação do ADNc por PCR <ol><li> Submeter o ARN isolado a transcrição reversa por um iniciador aleatório com uma transcriptase reversa de alta qualidade (RT), de acordo com a manufainstruções do cturer. </li><li> Para amplificar o ARN de interesse, conceber um iniciador anti-sentido específico para o gene dentro da sequência de clivagem com ribonuclease H. Use quantidades semelhantes de o oligonucleótido anti-sentido, um iniciador aleatório, ou um iniciador oligo-dT (Ver Tabela Materiais). NOTA: O iniciador oligo-dT e o ARNm poli-adenilada proporcionar reacções de controlo positivo para as reacções de RT-PCR. </li><li> Reserva 5% da reacção de RT (1 ul) para um qPCR preparativa feito em conjunto com o controlo negativo lisado-IP e amostras de DNA de controlo positivo para definir o ponto de corte e produzir uma curva padrão. Se o valor CT do qPCR preparativa está além do alcance da curva padrão, diluir a reacção RT no consecutivos 1: diluições 5 e repita o passo 7.2. NOTA: Para um seqüenciamento RNA e técnica de espectrometria de massa, consulte o arquivo método complementar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">Por favor clique aqui t</a>o ver este arquivo método complementar. (Botão direito do mouse para baixar). </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

O isolamento RNP e estratégia de identificação RNA cognate aqui descrito é um meio seletivo de investigar a interacção RNA-proteína específica e de descobrir proteínas candidatas co-regulação de um RNP específica em células. A vantagem de utilizar clivagem com ribonuclease H dirigida por oligonucleótidos para isolar RNP é a capacidade para capturar e analisar especificamente o elemento que actua em cis de ARN RNP sobre RNP heterogéneos ligados a jusante do elemento de ARN actuam em cis de in...

a expressão do gene pós-transcrição é regulada com precisão, começando com a transcrição do DNA no núcleo. Controlada pela ligação RNA proteínas (RBPs), mRNA biogênese e metabolismo ocorrem em partículas de ribonucleoproteínas altamente dinâmicos (RNPs), que se associam e dissociam com um mRNA precursor do substrato durante a progressão da RNA metabolismo 1-3. mudanças dinâmicas em componentes RNP afetar o destino pós-transcricional de um mRNA e fornecer garantia de qualidade durante o processamento de transcritos primários, seu tráfico nuclear e localização, a sua actividade como modelos de mRNA para a tradução, ea eventual volume de negócios de mRNAs maduros. Numerosas proteínas são designadas como RBPs em virtude dos seus domínios de aminoácidos conservados, incluindo o motivo de reconhecimento de ARN (RRM), a cadeia dupla de ARN domínio de ligação (RBD), e trechos de resíduos básicos (por exemplo, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs são rotineiramenteisolado por estratégias de imunoprecipitação e são selecionados para identificar os RNAs cognatos. Alguns RBPs co-regular pré-ARNm que estão relacionadas funcionalmente-, designados como regulons ARN 5-8. Estes RBPs, seus mRNAs cognatos, e às vezes RNA não-codificante, formar RNPs catalíticos que variam em composição; a sua singularidade se deve a várias combinações de factores associados, bem como a sequência temporal, localização, e a duração das suas interacções 9. Imunoprecipitação ARN (RIP) é uma técnica poderosa para isolar RNP de células e para identificar transcritos associados utilizando análise da sequência 10-13. Mover-se de candidato a genoma-wide rastreio é viável através de RIP combinada com uma análise de microarray 14 ou sequenciamento de alto rendimento (RNA-Seq) 15. Do mesmo modo, as proteínas co-precipitação pode ser identificado por espectrometria de massa, se eles são suficientemente abundante e separável a partir do anticorpo de co-precipitante 16,17. Aqui, nos dirigimos a metodologia para o isolamento de componentes de RNP de um ARN cognato específico a partir de células humanas de cultura, embora a abordagem é alterável para lisados ​​solúveis das células vegetais, fungos, vírus e bactérias. Análises a jusante do material incluem a identificação de candidatos e validação por imunotransferência, espectrometria de massa, ensaio enzimático bioquímica, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, conforme resumido na Figura 1. Dado o papel fundamental da RNP para controlar a expressão do gene ao nível pós-transcricional, alterações na expressão de RBPs componentes ou a sua acessibilidade às cognato RNAs pode ser prejudicial para a célula e está associada com vários tipos de afecções, incluindo a doença neurológica 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) é necessário para a tradução de mRNAs selecionados de origens celulares e retrovirais 6. Estes RNAs cognatos exibem elementos de actuação cis-estruturalmente relacionados dentro do seuUTR 5 &#39;, que é designado como o elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 19. Actividade RHA-PCE é necessário para a tradução eficiente dependente da tampa de diversos retrovirus, incluindo o HIV-1, e de genes reguladores do crescimento, incluindo Jund 6,20,21. Codificada por um gene essencial (dhx9), RHA é essencial para a proliferação celular e a sua infra-regulação elimina a viabilidade das células 22. A análise molecular de RHA-PCE RNP é um passo essencial para entender por que a atividade RHA-PCE é necessário controlar a proliferação celular. A caracterização precisa dos componentes RNP RHA-PCE no estado estacionário, ou mediante perturbação fisiológica da célula requer o enriquecimento selectivo e captura das RNPs RHA-PCE em abundância suficiente para a análise a jusante. Aqui, o RNA retroviral PCEgag foi etiquetado com 6 cópias do local de ligação de ARN de actuação cis para a proteína de revestimento de MS2 (CP) dentro do enquadramento de leitura aberto. A proteína de revestimento de MS2 foi exogenously co-expressa com PCEgag ARN por transfecção do plasmídeo para facilitar a montagem RNP em células em crescimento. RNP contendo a proteína de revestimento de MS2 ARN com PCEgag cognato MS2-tagged foram imunoprecipitadas a partir do extracto celular e capturada em esférulas magnéticas (Figura 2A). Para capturar selectivamente os componentes ligados ao RNP PCE, a RNP imobilizado foi incubado com um oligonucleótido complementar a sequências distais ao PCE, formando um híbrido de ARN-ADN que é o substrato para a actividade de RNase H. Desde PCE é posicionado no &#39;terminal do 5&#39; não traduzida a 5 região, o oligonucleótido é complementar às sequências de ARN adjacentes ao sítio de iniciação da tradução retroviral (gag codão de iniciação). Clivagem com ribonuclease H perto do início da mordaça codão libertado complexo UTR a 5 &#39;a partir do RNP imobilizada, que foi recolhido como o eluente. Em seguida, a amostra foi avaliada por RT-PCR para confirmar a captura de PCEgag e por SDS-PAGE e imunotransf erência para confirmar a capture da proteína de revestimento alvo MS2. A validação da proteína de ligação a ARN-associado PCE, DHX9 / ARN helicase A, foi então realizada.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Proteína A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG anticorpo</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RHA anticorpo</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS reagente</td><td>Tecnologia de</td> <td>vida10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>RNaeasy coluna de limpeza</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript transcriptase reversa</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Primers hexâmeros aleatórios</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT primers</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>Primers de PCR</td><td>IDT</td><td></td><td>Primers específicos para o gene para&nbsp; </td></tr><tr><td>Oligonucleotídeo de amplificação de PCR para clivagem mediada por RNase H</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer anti-sentido para RNA alvo</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco Tecnologia de vida</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de tecidos DMEM</td><td>Tecnologia de vida Gibco</td><td>Tecnologia 11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Tecnologia de vida Gibco Tecnologia</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td></td><td></td><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml segurando</td></tr><tr><td>Capuz</td><td></td><td></td> laminar <td>Para cultura de tecidos animais</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> CO2 <td>Para cultura de tecidos animais</td></tr><tr><td>Aparelho</td><td></td><td></td> de gel <td>de proteínas Separação de amostras de proteínas</td></tr><tr><td>Aparelho</td><td></td><td></td> de transferência de proteínas <td>Transferência de amostras de proteínas</td></tr><tr><td>Pronto para uso géis de proteína (4-15%)</td><td></td><td></td> <td>Separação de amostras de proteína</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> de mesa <td>Pellet abaixo do</td></tr><tr><td>rotador</td><td></td><td></td> de mesa de amostra <td>Misture a amostra de ponta a ponta</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td>Misture as amostras</td></tr></tbody></table>

isolamento de complexos de arn-proteína a partir de células cognate usando eluição oligonucleotide-directed

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

As partículas de ribonucleoproteína direcionam a biogênese e a regulação pós-transcricional de todos os mRNAs por meio de combinações distintas de proteínas de ligação ao RNA. Eles são compostos de elementos de RNA de ação cis dependentes da posição e combinações únicas de proteínas de ligação ao RNA. Definir a composição de uma RNP específica é essencial para alcançar uma compreensão fundamental da regulação gênica. O isolamento de um RNP selecionado é semelhante a encontrar uma agulha no palheiro. Aqui, demonstramos uma abordagem para isolar RNPs associados na região 5 'não traduzida de um mRNA selecionado em células assíncronas e transfectadas. Este RNP cognato demonstrou ser necessário para a tradução de vírus selecionados e genes celulares de resposta ao estresse.
O protocolo de coprecipitação RNA-proteína demonstrado é adequado para a análise a jusante de componentes proteicos por meio de análises proteômicas, immunoblots, Este protocolo experimental demonstra que DHX9 / RNA helicase A é enriquecido no terminal 5 'do RNA retroviral cognato e fornece informações preliminares para a identificação de sua associação com mRNAs cognatos huR e junD associados ao estresse celular.

Resultados RIP anteriores identificaram RNAs gag retrovirais e selecionados RNAs celulares que co-precipitado com DHX9 / RHA, incluindo HIV-1 6, Jund 6 e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, não publicado). O retroviral 5 'UTR foi demonstrada para co-precipitar com DHX9 / RHA no núcleo e para a co-isolar no citoplasma em polirribossomas. Ela é definida exclusivamente como a cis actuando elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 6. Para isolar os comple...

Este manuscrito descreve uma abordagem para isolar RNPs cognatos selecionados formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Demonstramos a aplicabilidade dessa abordagem isolando um RNP cognato ligado à região retroviral 5' não traduzida que é composta por DHX9/RNA helicase A.

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

O objetivo geral desta técnica de imunoprecipitação de RNA é isolar e caracterizar seletivamente complexos proteicos de RNA endógenos formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de controle pós-transcricional, como a composição das proteínas de ligação ao RNA que definem os cinco principais UTR de um transcrito retroviral para regular sua expressão gênica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que um pesquisador isole e caracterize seletivamente um complexo proteico de RNA específico de interesse, mantendo a possibilidade de realizar uma análise mais global do RNP a jusante.Bem, as implicações dessa técnica se estendem para a compreensão fundamental de infecções virais e inúmeras doenças celulares. E fornece informações significativas sobre os mecanismos de controle pós-transcricional da expressão gênica. Isso pode significar novos alvos viáveis de drogas.Após a cultura das células e a realização da imunoprecipitação de uma proteína marcada com FLAG de acordo com o protocolo de texto, transfira 60 microlitros por IP de pasta de esferas magnéti

isolation-cognate-rna-protein-complexes-from-cells-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Um passo a passo para protocolo de isolamento e identificação de RNA complexos associados através de RIP-Chip.

Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

Este vídeo demonstra um ensaio de extração de RNA in vitro para identificar proteínas de ligação a RNA (RBPs), que interagem com as sequências de elementos ricos em adenilato-uridilato (ARE) no mRNA. Os RBPs alvo de um lisado celular são misturados com uma sonda de RNA para formar complexos de RNA-proteína. Os complexos são isolados por purificação de afinidade utilizando a afinidade do marcador de destiobietina da sonda de RNA a um grânulo magnético marcado com estreptavidina.

Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

Muitos mRNAs que codificam as proteínas mitocondriais são associados com a membrana exterior mitocondrial. Descreve-se um processo de fracionamento subcelular que visa o isolamento de mitocôndrias de levedura com seus mRNAs e ribossomos associados. Este protocolo pode ser aplicado a células cultivadas sob diversas condições, a fim de revelar os mecanismos de localização de mRNA e tradução localizada perto das mitocôndrias.

Isolamento de mRNAs Associated com mitocôndrias de levedura para estudar mecanismos de regionalização de Tradução

as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

Este método de suspenso de RNA permite identificar os alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA (lncRNA). Baseado na hibridação de caseiras, concebidas antido sentidas oligonucleotide sondas de DNA específicas para este lncRNA em um tecido apropriadamente fixo ou linha de células, com eficiência permite a captura de todos os alvos de RNA do lncRNA.

Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Um procedimento de isolamento de RNA em tandem (viagem) para recuperação de complexos mRNA-proteínas endogenamente formado é descrito. Especificamente, complexos de RNA-proteína são quitosana na vivo, polyadenylated RNAs são isolados de extratos com grânulos de oligo (descolamento) e particulares mRNAs são capturados com modificados oligonucleotides antisentidos do RNA. Proteínas vinculadas a mRNAs são detectadas pela análise de immunoblot.

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

Complexos de RNA/proteínas purificados usando estratégia botin-streptavidin são eluídos a solução sob condições de desnaturação de forma inadequada para mais de purificação e análise funcional. Aqui, descrevemos uma modificação desta estratégia que utiliza um foto-cleavable vinculador em RNA e um passo de UV-eluição suave, produzindo complexos de RNA/proteína nativos e totalmente funcionais.

Purificação de etapa única de complexos macromoleculares usando RNA ligado à biotina e um foto-cleavable vinculador

Aqui, nós descrevemos o conjunto de complexos do alongamento do polymerase II (pol II) do RNA que exigem somente o ADN sintético curto e oligonucleotídeos do RNA e o pol purificado II. Esses complexos são úteis para estudar mecanismos subjacentes ao processamento cotranscricional de transcrições associadas ao complexo de alongamento pol II.

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

Aprenda a isolar complexos de ARN-proteína em células eucarióticas usando eluição direcionada por oligonucleotídeos. Este método revela a composição de proteínas de ligação ao ARN em transcritos retrovirais, incluindo a helicase DHX9/RHA.

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

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