Name: Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a isolar complexos de ARN-proteína em células eucarióticas usando eluição direcionada por oligonucleotídeos. Este método revela a composição de proteínas de ligação ao ARN em transcritos retrovirais, incluindo a helicase DHX9/RHA.

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Os autores agradecem o apoio pelo NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> tampão composições </td></tr><tr><td> Tampão de Lavagem: </td></tr><tr><td> mM de Tris-HCl a 50, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mM de NaCl </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> Tampão de baixo teor de sal: </td></tr><tr><td> mM de Tris-HCl a 20, pH 7,5 </td></tr><tr><td> 10 mM de NaCl </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> 2 mM de DTT </td></tr><tr><td> 1x cocktail inibidor de protease livre EDTA- </td></tr><tr><td> RNase Out 5 ul / ml (inibidor de RNase) </td></tr><tr><td> Citoplasmático de tampão de lise: </td></tr><tr><td> 0,2 M de sacarose </td></tr><tr><td> 1,2% de Triton X-100 </td></tr><tr><td> NETN-150 Tampão de Lavagem: </td></tr><tr><td> mM de Tris-HCl a 20, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 150 mMNaCl </td></tr><tr><td> 0,5% de NP-40 </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> 10% de Glicerol </td></tr><tr><td> Tampão de Ligação: </td></tr><tr><td> HEPES 10 mM, pH 7,6 </td></tr><tr><td> KCl 40 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 3 mM </td></tr><tr><td> 2 mM de DTT </td></tr><tr><td> 5% de glicerol </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Composições de memória intermédia. 1. Preparação de células e com a matriz de afinidade <ol><li> A cultura de uma linha celular de interesse à sub-confluência (80%) numa placa de 10 cm. Utilizar placas de 10 cm para imunoprecipi independentes (IP) de uma proteína de revestimento de MS2-NLS marcado com FLAG. Execute o IP utilizando anti-soros para a marca de epitopo-FLAG. Ao expressar o MS2 plasmídeo proteína de revestimento marcado com FLAG, as células transfectar 24-48 h antes da colheita 20. NOTA: A RNP particular pode ser enriquecida a partir nuclear ou citoplasmaOs lisados ​​de IC ou uma preparação bioquimicamente fraccionadas, tais como fracções de gradiente de sacarose. Recomenda-se a colheita do ligado de células não transfectadas em paralelo para instituir um controlo negativo adicional. </li><li> Transferir 60 uL por IP de proteína G suspensão esférulas magnéticas para um tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. </li><li> Colocar o tubo em uma cremalheira íman para tubos de microcentrífuga para separar os grânulos a partir da solução de armazenamento. </li><li> Retirar a solução de armazenamento, chamando-o cuidadosamente com uma micropipeta. </li><li> Retire o tubo do rack ímã. </li><li> Lavagem e equilibrar as contas com 600 ul (10 vezes o volume utilizado de esferas) de 1x tampão de lavagem (Tris-HCl a 20, pH 7,4; MgCl2 3 mM, e NaCl 150 mM) e-sobre-extremidade final da rotação durante 3 min à temperatura ambiente. </li><li> Colocar o tubo na cremalheira ímã e remova o tampão de lavagem. </li><li> Adicionar 10 volumes (600 ul) de tampão de lavagem 1x e anticorpo FLAG imunoprecipitar ao pr equilibradaotein G esferas magnéticas (de acordo com a quantidade recomendada pelo fabricante para uma imunoprecipitação) e rodar para a sobre-extremidade final à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min para conjugar o anticorpo imunoprecipitação. Utilizar a IgG de isotipo correspondente como um controlo negativo de anticorpo adequado. </li><li> Colocar o tubo na cremalheira íman para recolher as esferas e para remover o sobrenadante. </li><li> Remover o tubo a partir da cremalheira íman e lavar as esferas de anticorpo conjugado com 10 volumes (600 L) de tampão de lavagem 1x e rotação durante 3 min, à temperatura ambiente. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Colocar o tubo na cremalheira ímã e remova o tampão de lavagem. </li></ol> 2. A colheita da RNP Nota: Preparar a RNP durante o tempo de incubação após o passo 1.8. <ol><li> Remover o meio de cultura das células por aspiração e lavar as células duas vezes com 1-5 ml de gelo-frio 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Use um raspador de células para desalojar molhado,células aderentes antes da colheita por centrifugação a 226 xg durante 4 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar 375 ul de gelado, tampão de baixo teor salino (Tris-HCl a 20, pH 7,5; 3 mM de MgCl2; 10 mM de NaCl; 2 mM de DTT; 1x cocktail inibidor de protease, isento de EDTA; e 5 ul / ml Inibidor de RNase) para o sedimento celular e permitir inchaço, colocando-o em gelo durante 5 min. NOTA: Tailor o volume de tampão de baixo teor salino de acordo com o tamanho do agregado de células. Para 1,2 x 10 6 células de uma placa de 10 cm, 375 ul de tampão é suficiente. </li><li> Para recolher o lisado celular citoplasmática, adicionar 125 ul de tampão de lise arrefecido com gelo (sacarose 0,2 M / 1,2% de Triton X-100), e, em seguida, executar 10 pancadas com um homogeneizador de Dounce que foi pré-arrefecido num balde de gelo. NOTA: Para recolher o extracto celular total, tampão de lise RIPA padrão é recomendada para solubilizar o nucleoplasma / cromatina. </li><li> Rotação numa microcentrífuga a velocidade máxima (16000 xg) durante 1 min; isso vai limpar o sobrenadante de detritos de umanúcleos nd. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifugação de 1,7 mL que foi em gelo. Determinar a concentração de proteína total através de uma norma, o método preferido em laboratório, tais como o Ensaio de Bradford 23. Reserva-se uma alíquota de pelo menos 10% para uma análise de transferência de Western, para ser usado como um controle de entrada. Use o ligado de células colhidas imediatamente para imunoprecipitação ou armazená-lo a -80 ° C para análise futura. NOTA: Em nossa experiência, estas amostras podem ser armazenados e utilizados vários meses mais tarde para análise de imunoprecipitação, sem um compromisso de integridade. </li></ol> 3. Immunoprecipitation <ol><li> Adicionar o volume desejado do lisado de células colhida, com base na concentração de proteína foi determinada na etapa 2.5, com as esferas de anticorpo conjugado alvo. Usando 1X tampão de lavagem, levar o volume total até 600 uL e girar extremidade-sobre-extremidade durante 90 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Este período de tempo é suficiente para gerarum isolamento sólido de complexos de RNP de afinidade elevada, minimizando a ligação não específica. Diluir RNP fontes alternativas, tais como as fracções de gradiente de sacarose, de pelo menos 1: 1 com tampão de lavagem 1x e, em seguida, incuba-los com complexos de anticorpo-grânulo previamente preparados, como mencionado acima. </li><li> Após 90 minutos de incubação, colocar o tubo IP na prateleira ímã para recolher as contas. Reservar o sobrenadante como por escoamento. NOTA: Este primeiro flow-through é uma amostra de controlo importante para medir a eficiência IP. Um ensaio de imunotransferência irá fornecer uma indicação da eficiência de IP, bem como a especificidade das interacções investigados. Recomenda-se manter este sobrenadante para análise a jusante. </li><li> Lavar as, esferas de anticorpo conjugado ligado a RNP com 10 volumes (600 L) de NETN-150 tampão de lavagem arrefecido com gelo (Tris-HCl a 20, pH 7,4; NaCl 150 mM; MgCl2 3 mM; NP40 a 0,5%; e glicerol a 10%), sob rotação durante 3 min, à temperatura ambiente. Repita o passo 3 vezes. NOTA: Este tampão difere do tampão de lise e reduz eficazmente associações fracas ou não-específicas. </li><li> Após a lavagem final, ressuspender os complexos RNP imobilizada em 60 ul de tampão gelado 1x de ligação (HEPES 10 mM, pH 7,6; KCl 40 mM; MgCl2 3 mM; glicerol a 5%, e 2 mM de DTT) e de reserva de 10% dos grânulos complexos imobilizados por Western blot e 20% para o isolamento de ARN. </li></ol> 4. eluição <ol><li> Ajustar o volume remanescente para 100 ul com tampão de ligação arrefecido com gelo 1x e aquecer o tubo a 70 ° C durante 3 min. </li><li> Para isolar complexos de ARN-proteína cognatos, adicionar um oligonucleótido de ADN de ~ 30 nt que é complementar ao contorno da sequência 3 &#39;do ARN de interesse e incuba-se durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave (100 nM de oligonucleótido é suficiente). NOTA: O oligonucleótido é anti-sentido para os resíduos de nucleótidos adjacentes, para o início da tradução do local da construção PCE usados ​​como um example neste protocolo. complementaridade sequência apropriada é fornecido pelo teor de GC ~ 40%. Desenhar o oligonucleótido anti-sentido para a hibridação eficaz para a região mínima complementar do RNA alvo. </li><li> Adicionar 5-10 unidades de ARNase H para o tubo e incubar à temperatura ambiente durante 1 h para clivar o ARN do ARN: ADN híbrido. Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrifugação esterilizado de 1,7 mL; Este exemplo contém os complexos RNP capturados de interesse. NOTA: Dependendo da acessibilidade do ARN cognato, dois ou mais ciclos de tratamento com RNase H podem ser úteis para aumentar a abundância da amostra para as análises a jusante. </li><li> Usar 20% do eluato de uma transferência de Western de proteínas associadas conhecidas e 20% do eluído para isolamento do ARN seguida por RT qPCR. Os restantes 60% pode ser usado para a espectrometria de massa para identificar ou componentes proteicos. </li><li> Em paralelo, submeter-se uma alíquota do lisado celular reservada para isolamento de ARN e a análise de RT-PCR. este assessment fornece uma indicação do enriquecimento de ARN dentro de um complexo de RNP. NOTA: Utilize a preparação proteína isolada em um western blot controle para verificar que a clivagem RNase H foi eficaz na liberação da RNP do complexo immunuoprecipitated. </li></ol> 5. Proteína Análise Eletroforese e Western Blot <ol><li> Objecto de aproximadamente 10-20% do total da amostra de SDS-PAGE e análise de imunotransf erência de acordo com protocolo padrão de laboratório. NOTA: Este passo serve para validar a eficiência e especificidade de IP antes da análise do RNA a jusante. Ele também pode ser usado para avaliar a composição de proteína do complexo RNP isolado. </li></ol> 6. Coleta do RNA imunoprecipitadas NOTA: O isolamento de RNA pode ser feito pelo método de Trizol ou seguindo o protocolo descrito. <ol><li> Ressuspender metade do total da amostra em 750 ul de reagente de ácido tiocianato de guanidina e incubar a sala temperatura durante 5 minutos antes da extracção do ARN a partir dos complexos de RNP PCE-capturados. </li><li> Adicionar 200 ul de clorofórmio a de o tubo, agitar vigorosamente durante 10 segundos, e incubar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Após centrifugação a 16000 xg durante 15 min a 4 ° C, recolher a fase aquosa para um tubo novo e adicionar um volume igual de isopropanol. Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 10 min. Adicionar 1 ml de azul-glicol para a amostra e armazená-lo a -20 ° C no congelador por precipitação ou de processamento eficiente em uma data futura. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante, de modo a não perturbar o sedimento de ARN; a utilização de uma ponta de micropipeta P-200 é recomendado para facilitar este processo. </li><li> Adicionar 500 ul de etanol a 75% a cada tubo, vórtice, e centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante como no passo 6.4. Ar-secar o sedimento durante 2-3 min e ressuspender em 100 mL de água isenta de RNase. NOTA: Não prolongar o tempo o ar-pelota seca, a fim de evitar um problema com a ressuspensão. </li><li> Adicionar 100 ul de amostra de ARN a uma coluna de ARN de limpeza. Processá-lo usando o protocolo do fabricante. Eluir o RNA em 30 mL de água livre de RNase e armazenar a -80 ° C por até 3 meses. NOTA: Este RNA isolado é adequado para análise de jusante por RT-PCR em tempo real (qPCR), microarray, e seqüenciamento RNA. Dependendo da abundância do RNP e a eficiência com a qual a RNP de interesse é isolado, o mesmo lisado pode ser submetido a dois ou mais ciclos de IP para gerar ARN suficiente aplicável para as análises a jusante. </li></ol> A transcrição reversa de ARN e 7. A amplificação do ADNc por PCR <ol><li> Submeter o ARN isolado a transcrição reversa por um iniciador aleatório com uma transcriptase reversa de alta qualidade (RT), de acordo com a manufainstruções do cturer. </li><li> Para amplificar o ARN de interesse, conceber um iniciador anti-sentido específico para o gene dentro da sequência de clivagem com ribonuclease H. Use quantidades semelhantes de o oligonucleótido anti-sentido, um iniciador aleatório, ou um iniciador oligo-dT (Ver Tabela Materiais). NOTA: O iniciador oligo-dT e o ARNm poli-adenilada proporcionar reacções de controlo positivo para as reacções de RT-PCR. </li><li> Reserva 5% da reacção de RT (1 ul) para um qPCR preparativa feito em conjunto com o controlo negativo lisado-IP e amostras de DNA de controlo positivo para definir o ponto de corte e produzir uma curva padrão. Se o valor CT do qPCR preparativa está além do alcance da curva padrão, diluir a reacção RT no consecutivos 1: diluições 5 e repita o passo 7.2. NOTA: Para um seqüenciamento RNA e técnica de espectrometria de massa, consulte o arquivo método complementar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">Por favor clique aqui t</a>o ver este arquivo método complementar. (Botão direito do mouse para baixar). </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

O isolamento RNP e estratégia de identificação RNA cognate aqui descrito é um meio seletivo de investigar a interacção RNA-proteína específica e de descobrir proteínas candidatas co-regulação de um RNP específica em células. A vantagem de utilizar clivagem com ribonuclease H dirigida por oligonucleótidos para isolar RNP é a capacidade para capturar e analisar especificamente o elemento que actua em cis de ARN RNP sobre RNP heterogéneos ligados a jusante do elemento de ARN actuam em cis de in...

a expressão do gene pós-transcrição é regulada com precisão, começando com a transcrição do DNA no núcleo. Controlada pela ligação RNA proteínas (RBPs), mRNA biogênese e metabolismo ocorrem em partículas de ribonucleoproteínas altamente dinâmicos (RNPs), que se associam e dissociam com um mRNA precursor do substrato durante a progressão da RNA metabolismo 1-3. mudanças dinâmicas em componentes RNP afetar o destino pós-transcricional de um mRNA e fornecer garantia de qualidade durante o processamento de transcritos primários, seu tráfico nuclear e localização, a sua actividade como modelos de mRNA para a tradução, ea eventual volume de negócios de mRNAs maduros. Numerosas proteínas são designadas como RBPs em virtude dos seus domínios de aminoácidos conservados, incluindo o motivo de reconhecimento de ARN (RRM), a cadeia dupla de ARN domínio de ligação (RBD), e trechos de resíduos básicos (por exemplo, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs são rotineiramenteisolado por estratégias de imunoprecipitação e são selecionados para identificar os RNAs cognatos. Alguns RBPs co-regular pré-ARNm que estão relacionadas funcionalmente-, designados como regulons ARN 5-8. Estes RBPs, seus mRNAs cognatos, e às vezes RNA não-codificante, formar RNPs catalíticos que variam em composição; a sua singularidade se deve a várias combinações de factores associados, bem como a sequência temporal, localização, e a duração das suas interacções 9. Imunoprecipitação ARN (RIP) é uma técnica poderosa para isolar RNP de células e para identificar transcritos associados utilizando análise da sequência 10-13. Mover-se de candidato a genoma-wide rastreio é viável através de RIP combinada com uma análise de microarray 14 ou sequenciamento de alto rendimento (RNA-Seq) 15. Do mesmo modo, as proteínas co-precipitação pode ser identificado por espectrometria de massa, se eles são suficientemente abundante e separável a partir do anticorpo de co-precipitante 16,17. Aqui, nos dirigimos a metodologia para o isolamento de componentes de RNP de um ARN cognato específico a partir de células humanas de cultura, embora a abordagem é alterável para lisados ​​solúveis das células vegetais, fungos, vírus e bactérias. Análises a jusante do material incluem a identificação de candidatos e validação por imunotransferência, espectrometria de massa, ensaio enzimático bioquímica, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, conforme resumido na Figura 1. Dado o papel fundamental da RNP para controlar a expressão do gene ao nível pós-transcricional, alterações na expressão de RBPs componentes ou a sua acessibilidade às cognato RNAs pode ser prejudicial para a célula e está associada com vários tipos de afecções, incluindo a doença neurológica 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) é necessário para a tradução de mRNAs selecionados de origens celulares e retrovirais 6. Estes RNAs cognatos exibem elementos de actuação cis-estruturalmente relacionados dentro do seuUTR 5 &#39;, que é designado como o elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 19. Actividade RHA-PCE é necessário para a tradução eficiente dependente da tampa de diversos retrovirus, incluindo o HIV-1, e de genes reguladores do crescimento, incluindo Jund 6,20,21. Codificada por um gene essencial (dhx9), RHA é essencial para a proliferação celular e a sua infra-regulação elimina a viabilidade das células 22. A análise molecular de RHA-PCE RNP é um passo essencial para entender por que a atividade RHA-PCE é necessário controlar a proliferação celular. A caracterização precisa dos componentes RNP RHA-PCE no estado estacionário, ou mediante perturbação fisiológica da célula requer o enriquecimento selectivo e captura das RNPs RHA-PCE em abundância suficiente para a análise a jusante. Aqui, o RNA retroviral PCEgag foi etiquetado com 6 cópias do local de ligação de ARN de actuação cis para a proteína de revestimento de MS2 (CP) dentro do enquadramento de leitura aberto. A proteína de revestimento de MS2 foi exogenously co-expressa com PCEgag ARN por transfecção do plasmídeo para facilitar a montagem RNP em células em crescimento. RNP contendo a proteína de revestimento de MS2 ARN com PCEgag cognato MS2-tagged foram imunoprecipitadas a partir do extracto celular e capturada em esférulas magnéticas (Figura 2A). Para capturar selectivamente os componentes ligados ao RNP PCE, a RNP imobilizado foi incubado com um oligonucleótido complementar a sequências distais ao PCE, formando um híbrido de ARN-ADN que é o substrato para a actividade de RNase H. Desde PCE é posicionado no &#39;terminal do 5&#39; não traduzida a 5 região, o oligonucleótido é complementar às sequências de ARN adjacentes ao sítio de iniciação da tradução retroviral (gag codão de iniciação). Clivagem com ribonuclease H perto do início da mordaça codão libertado complexo UTR a 5 &#39;a partir do RNP imobilizada, que foi recolhido como o eluente. Em seguida, a amostra foi avaliada por RT-PCR para confirmar a captura de PCEgag e por SDS-PAGE e imunotransf erência para confirmar a capture da proteína de revestimento alvo MS2. A validação da proteína de ligação a ARN-associado PCE, DHX9 / ARN helicase A, foi então realizada.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Proteína A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG anticorpo</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RHA anticorpo</td><td>Vaxron</td><td>PA-001</td><td></td></tr><tr><td>TRizol LS reagente</td><td>Tecnologia de</td> <td>vida10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>RNaeasy coluna de limpeza</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript transcriptase reversa</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel inibidor de protease</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Primers hexâmeros aleatórios</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-dT primers</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>Primers de PCR</td><td>IDT</td><td></td><td>Primers específicos para o gene para&nbsp; </td></tr><tr><td>Oligonucleotídeo de amplificação de PCR para clivagem mediada por RNase H</td><td>IDT</td><td></td><td>Primer anti-sentido para RNA alvo</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco Tecnologia de vida</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Meio de cultura de tecidos DMEM</td><td>Tecnologia de vida Gibco</td><td>Tecnologia 11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Tecnologia de vida Gibco Tecnologia</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td></td><td></td><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 ml segurando</td></tr><tr><td>Capuz</td><td></td><td></td> laminar <td>Para cultura de tecidos animais</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> CO2 <td>Para cultura de tecidos animais</td></tr><tr><td>Aparelho</td><td></td><td></td> de gel <td>de proteínas Separação de amostras de proteínas</td></tr><tr><td>Aparelho</td><td></td><td></td> de transferência de proteínas <td>Transferência de amostras de proteínas</td></tr><tr><td>Pronto para uso géis de proteína (4-15%)</td><td></td><td></td> <td>Separação de amostras de proteína</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> de mesa <td>Pellet abaixo do</td></tr><tr><td>rotador</td><td></td><td></td> de mesa de amostra <td>Misture a amostra de ponta a ponta</td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td>Misture as amostras</td></tr></tbody></table>

isolamento de complexos de arn-proteína a partir de células cognate usando eluição oligonucleotide-directed

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

As partículas de ribonucleoproteína direcionam a biogênese e a regulação pós-transcricional de todos os mRNAs por meio de combinações distintas de proteínas de ligação ao RNA. Eles são compostos de elementos de RNA de ação cis dependentes da posição e combinações únicas de proteínas de ligação ao RNA. Definir a composição de uma RNP específica é essencial para alcançar uma compreensão fundamental da regulação gênica. O isolamento de um RNP selecionado é semelhante a encontrar uma agulha no palheiro. Aqui, demonstramos uma abordagem para isolar RNPs associados na região 5 'não traduzida de um mRNA selecionado em células assíncronas e transfectadas. Este RNP cognato demonstrou ser necessário para a tradução de vírus selecionados e genes celulares de resposta ao estresse.
O protocolo de coprecipitação RNA-proteína demonstrado é adequado para a análise a jusante de componentes proteicos por meio de análises proteômicas, immunoblots, Este protocolo experimental demonstra que DHX9 / RNA helicase A é enriquecido no terminal 5 'do RNA retroviral cognato e fornece informações preliminares para a identificação de sua associação com mRNAs cognatos huR e junD associados ao estresse celular.

Resultados RIP anteriores identificaram RNAs gag retrovirais e selecionados RNAs celulares que co-precipitado com DHX9 / RHA, incluindo HIV-1 6, Jund 6 e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, não publicado). O retroviral 5 'UTR foi demonstrada para co-precipitar com DHX9 / RHA no núcleo e para a co-isolar no citoplasma em polirribossomas. Ela é definida exclusivamente como a cis actuando elemento de controlo pós-transcricional (PCE) 6. Para isolar os comple...

Este manuscrito descreve uma abordagem para isolar RNPs cognatos selecionados formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Demonstramos a aplicabilidade dessa abordagem isolando um RNP cognato ligado à região retroviral 5' não traduzida que é composta por DHX9/RNA helicase A.

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

O objetivo geral desta técnica de imunoprecipitação de RNA é isolar e caracterizar seletivamente complexos proteicos de RNA endógenos formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de controle pós-transcricional, como a composição das proteínas de ligação ao RNA que definem os cinco principais UTR de um transcrito retroviral para regular sua expressão gênica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que um pesquisador isole e caracterize seletivamente um complexo proteico de RNA específico de interesse, mantendo a possibilidade de realizar uma análise mais global do RNP a jusante.Bem, as implicações dessa técnica se estendem para a compreensão fundamental de infecções virais e inúmeras doenças celulares. E fornece informações significativas sobre os mecanismos de controle pós-transcricional da expressão gênica. Isso pode significar novos alvos viáveis de drogas.Após a cultura das células e a realização da imunoprecipitação de uma proteína marcada com FLAG de acordo com o protocolo de texto, transfira 60 microlitros por IP de pasta de esferas magnéticas pró-TG para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Coloque o tubo em um rack magnético e remova a solução de armazenamento pipetando cuidadosamente. Em seguida, remova o tubo do rack.Adicione 600 microlitros de 1x tampão de lavagem. E coloque o tubo em um rotador de ponta a ponta em temperatura ambiente por três minutos, para lavar e equilibrar as contas. Coloque o tubo no rack magnético e remova o tampão de lavagem.Em seguida, adicione 10 volumes de tampão de lavagem fresco 1x. Adicione o anticorpo FLAG imunoprecipitante às esferas magnéticas pró-TG equilibradas. Em seguida, gire o tubo em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos, para conjugar o anticorpo imunoprecipitante.Coloque o tubo no ímã e remova o sobrenadante. Em seguida, remova o tubo do ímã e adicione 1x tampão de lavagem às contas e gire em temperatura ambiente por três minutos. Repita a etapa de lavagem duas vezes e remova o tampão final.Remova o meio de cultura das células por aspiração e use 1,5 mililitros de PBS gelado para lavar as células duas vezes. Com um raspador de células, desaloje as células úmidas e aderentes. Pipetar a suspensão celular para tubos frescos e, em seguida, centrifugar a cultura a 226 vezes G a quatro graus Celsius, durante quatro minutos.Adicione 375 microlitros de tampão de baixo teor de sal gelado ao pellet celular e incube a amostra no gelo por cinco minutos para permitir o inchaço. É importante ter cuidado ao adicionar e ressuspender o pellet celular no tampão de lise com baixo teor de sal, para garantir a submersão e o inchaço completos sem interrupção mecânica prematura. Para coletar o lisado de células citoplasmáticas, adicione 125 microlitros de tampão de lise gelada e, em seguida, use um homogeneizador Dounce pré-resfriado para realizar dez golpes.Homogeneizar com força suficiente para permitir a lise da membrana plasmática e os contaminantes do lisado citoplasmático liberado. Mas tome cuidado para não estender demais a interrupção mecânica e correr o risco de contaminações nucleares, interrupção do complexo de proteínas de RNA ou perda de Gire o homogenato em uma microcentrífuga em alta velocidade por um minuto. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,7 mililitro que esteja no gelo.Determine a concentração total de proteínas. Reserve 10% para análise de western blot, para ser usado como controle de entrada. Para realizar a imunoprecipitação, adicione o volume desejado de lisado de células colhidas aos grânulos conjugados com anticorpos alvo.Usando 1x tampão de lavagem, aumente o volume total para 600 microlitros e gire a amostra em temperatura ambiente. Após 90 minutos de incubação, coloque o tubo IP no suporte magnético para coletar as contas. Em seguida, recolha o sobrenadante e reserve-o como fluxo.Em seguida, adicione 10 volumes de tampão de lavagem NETN 150 gelado aos grânulos conjugados com anticorpos ligados a RNP e gire a amostra em temperatura ambiente por três minutos. Depois de ressuspender os complexos RNP imobilizados em tampão de ligação 1x de acordo com o protocolo de texto, ajuste o volume restante em 100 microlitros de tampão de ligação 1x gelado. E aqueça o tubo a 70 graus Celsius por três minutos.Para isolar complexos de proteínas de RNA cognatos, adicione um oligo de DNA de aproximadamente 30 nucleotídeos, complementar ao limite de três sequências primárias do RNA de interesse. E incube por 30 minutos em temperatura ambiente com balanço suave. Adicione cinco a dez unidades ou RNase H ao tubo e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora para separar o RNA do RNA híbrido de DNA.Em seguida, transfira o sobrenadante contendo os complexos RNP capturados de interesse para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mililitro. Para coletar o RNA imunoprecipitado, ressuspender metade da amostra total de complexos de RNA capturados em 750 microlitros de reagente de tiocianato de guanidínio ácido. Adicione 200 microlitros de clorofórmio ao tubo, agite vigorosamente por 10 segundos e incube em temperatura ambiente por três minutos.Após a centrifugação, recolher a fase aquosa num tubo novo e adicionar um volume igual de isopropanol. Misture bem e incube a amostra em temperatura ambiente por pelo menos dez minutos. Adicione um microlitro de azul de glicol à amostra e armazene-o a 20 graus Celsius negativos para precipitação ou processamento eficiente em uma data futura.Centrifugue o tubo a 16.000 vezes G em quatro graus Celsius por dez minutos. Use uma micropipeta P200 para coletar e descartar cuidadosamente o sobrenadante para não perturbar o pellet de RNA. Adicione 500 microlitros de etanol 75% a cada tubo.Vortex e centrifugue os tubos por cinco minutos. Recolha e elimine cuidadosamente o sobrenadante como acabou de ser demonstrado. Seque o pellet ao ar por dois a três minutos e use 100 microlitros de água livre de RNase para ressuspendê-lo.Aplique 100 microlitros da amostra de RNA em uma coluna de limpeza de RNA. E processe-o de acordo com o protocolo do fabricante. Finalmente, eluir o RNA em 30 microlitros de água livre de RNase e armazená-lo a 80 graus Celsius negativos por até três meses.Para isolar elementos de controle pós-transcricional, ou complexos ribonucleoproteicos PCE, GAG, RNA, RHA formados em células em proliferação. A imunoprecipitação de FLAG-MS2 RNP foi realizada em lisados de células HECK293 transfectadas. Os resultados mostram precipitação eficiente da proteína FLAG-MS2.Como DHX9/RHA é encontrado no complexo RNP e não dentro do controle isotópico de IgG, nem dentro do controle negativo. Aqui são mostrados os western blots de complexos de DNA de RNA digeridos pela RNase H. RNase H clivado PCE GAG RNA, liberando o complexo RNP especificamente ligado aos cinco UTR primos.Os RNPs associados a DHX9/RHA foram enriquecidos nos eluentes. É importante ressaltar que os RNPs ligados ao FLAG-MS2 permaneceram com os grânulos conjugados com anticorpos. Neste experimento, a imunoprecipitação HO da alça do caule MS2, contendo RNA GAG PCE retroviral em células e em eluentes, foi validada por RT-PCR e QRT-PCR.Os resultados confirmaram uma associação selecionada entre DHX9/RHA e o retroviral five prime UTR, que tem sido destacado como um RNP único, importante para o controle de tradução direcionado. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente cinco horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de executar todas as etapas de forma eficiente e cuidadosa, para garantir a manutenção dos complexos RNP intactos e o isolamento do complexo RNP específico de interesse.Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massa e RNA-Seq, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a associação global da proteína com o RNA alvo. E análise de região ou completa de todos os transcritos envolvidos em uma RNP específica. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do controle de genes pós-transcricionais explorarem os distintos complexos de proteínas de RNA que governam a expiração do gene viral patogênico e o mecanismo geral de controle da expressão gênica celular.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como colher complexos RNP celulares intactos e determinar sua composição usando enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos seletivos. Não se esqueça também, trabalhar com vírus patogênicos e amostras biológicas e produtos químicos perigosos como ácido ou fenol pode ser extremamente perigoso. Todas as precauções, como equipamento de proteção individual adequado, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

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