Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

O objetivo geral desta técnica de imunoprecipitação de RNA é isolar e caracterizar seletivamente complexos proteicos de RNA endógenos formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de controle pós-transcricional, como a composição das proteínas de ligação ao RNA que definem os cinco principais UTR de um transcrito retroviral para regular sua expressão gênica. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite que um pesquisador isole e caracterize seletivamente um complexo proteico de RNA específico de interesse, mantendo a possibilidade de realizar uma análise mais global do RNP a jusante.

Bem, as implicações dessa técnica se estendem para a compreensão fundamental de infecções virais e inúmeras doenças celulares. E fornece informações significativas sobre os mecanismos de controle pós-transcricional da expressão gênica. Isso pode significar novos alvos viáveis de drogas.

Após a cultura das células e a realização da imunoprecipitação de uma proteína marcada com FLAG de acordo com o protocolo de texto, transfira 60 microlitros por IP de pasta de esferas magnéticas pró-TG para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Coloque o tubo em um rack magnético e remova a solução de armazenamento pipetando cuidadosamente. Em seguida, remova o tubo do rack.

Adicione 600 microlitros de 1x tampão de lavagem. E coloque o tubo em um rotador de ponta a ponta em temperatura ambiente por três minutos, para lavar e equilibrar as contas. Coloque o tubo no rack magnético e remova o tampão de lavagem.

Em seguida, adicione 10 volumes de tampão de lavagem fresco 1x. Adicione o anticorpo FLAG imunoprecipitante às esferas magnéticas pró-TG equilibradas. Em seguida, gire o tubo em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos, para conjugar o anticorpo imunoprecipitante.

Coloque o tubo no ímã e remova o sobrenadante. Em seguida, remova o tubo do ímã e adicione 1x tampão de lavagem às contas e gire em temperatura ambiente por três minutos. Repita a etapa de lavagem duas vezes e remova o tampão final.

Remova o meio de cultura das células por aspiração e use 1,5 mililitros de PBS gelado para lavar as células duas vezes. Com um raspador de células, desaloje as células úmidas e aderentes. Pipetar a suspensão celular para tubos frescos e, em seguida, centrifugar a cultura a 226 vezes G a quatro graus Celsius, durante quatro minutos.

Adicione 375 microlitros de tampão de baixo teor de sal gelado ao pellet celular e incube a amostra no gelo por cinco minutos para permitir o inchaço. É importante ter cuidado ao adicionar e ressuspender o pellet celular no tampão de lise com baixo teor de sal, para garantir a submersão e o inchaço completos sem interrupção mecânica prematura. Para coletar o lisado de células citoplasmáticas, adicione 125 microlitros de tampão de lise gelada e, em seguida, use um homogeneizador Dounce pré-resfriado para realizar dez golpes.

Homogeneizar com força suficiente para permitir a lise da membrana plasmática e os contaminantes do lisado citoplasmático liberado. Mas tome cuidado para não estender demais a interrupção mecânica e correr o risco de contaminações nucleares, interrupção do complexo de proteínas de RNA ou perda de Gire o homogenato em uma microcentrífuga em alta velocidade por um minuto. Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de 1,7 mililitro que esteja no gelo.

Determine a concentração total de proteínas. Reserve 10% para análise de western blot, para ser usado como controle de entrada. Para realizar a imunoprecipitação, adicione o volume desejado de lisado de células colhidas aos grânulos conjugados com anticorpos alvo.

Usando 1x tampão de lavagem, aumente o volume total para 600 microlitros e gire a amostra em temperatura ambiente. Após 90 minutos de incubação, coloque o tubo IP no suporte magnético para coletar as contas. Em seguida, recolha o sobrenadante e reserve-o como fluxo.

Em seguida, adicione 10 volumes de tampão de lavagem NETN 150 gelado aos grânulos conjugados com anticorpos ligados a RNP e gire a amostra em temperatura ambiente por três minutos. Depois de ressuspender os complexos RNP imobilizados em tampão de ligação 1x de acordo com o protocolo de texto, ajuste o volume restante em 100 microlitros de tampão de ligação 1x gelado. E aqueça o tubo a 70 graus Celsius por três minutos.

Para isolar complexos de proteínas de RNA cognatos, adicione um oligo de DNA de aproximadamente 30 nucleotídeos, complementar ao limite de três sequências primárias do RNA de interesse. E incube por 30 minutos em temperatura ambiente com balanço suave. Adicione cinco a dez unidades ou RNase H ao tubo e incube a amostra à temperatura ambiente por uma hora para separar o RNA do RNA híbrido de DNA.

Em seguida, transfira o sobrenadante contendo os complexos RNP capturados de interesse para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mililitro. Para coletar o RNA imunoprecipitado, ressuspender metade da amostra total de complexos de RNA capturados em 750 microlitros de reagente de tiocianato de guanidínio ácido. Adicione 200 microlitros de clorofórmio ao tubo, agite vigorosamente por 10 segundos e incube em temperatura ambiente por três minutos.

Após a centrifugação, recolher a fase aquosa num tubo novo e adicionar um volume igual de isopropanol. Misture bem e incube a amostra em temperatura ambiente por pelo menos dez minutos. Adicione um microlitro de azul de glicol à amostra e armazene-o a 20 graus Celsius negativos para precipitação ou processamento eficiente em uma data futura.

Centrifugue o tubo a 16.000 vezes G em quatro graus Celsius por dez minutos. Use uma micropipeta P200 para coletar e descartar cuidadosamente o sobrenadante para não perturbar o pellet de RNA. Adicione 500 microlitros de etanol 75% a cada tubo.

Vortex e centrifugue os tubos por cinco minutos. Recolha e elimine cuidadosamente o sobrenadante como acabou de ser demonstrado. Seque o pellet ao ar por dois a três minutos e use 100 microlitros de água livre de RNase para ressuspendê-lo.

Aplique 100 microlitros da amostra de RNA em uma coluna de limpeza de RNA. E processe-o de acordo com o protocolo do fabricante. Finalmente, eluir o RNA em 30 microlitros de água livre de RNase e armazená-lo a 80 graus Celsius negativos por até três meses.

Para isolar elementos de controle pós-transcricional, ou complexos ribonucleoproteicos PCE, GAG, RNA, RHA formados em células em proliferação. A imunoprecipitação de FLAG-MS2 RNP foi realizada em lisados de células HECK293 transfectadas. Os resultados mostram precipitação eficiente da proteína FLAG-MS2.

Como DHX9/RHA é encontrado no complexo RNP e não dentro do controle isotópico de IgG, nem dentro do controle negativo. Aqui são mostrados os western blots de complexos de DNA de RNA digeridos pela RNase H. RNase H clivado PCE GAG RNA, liberando o complexo RNP especificamente ligado aos cinco UTR primos.

Os RNPs associados a DHX9/RHA foram enriquecidos nos eluentes. É importante ressaltar que os RNPs ligados ao FLAG-MS2 permaneceram com os grânulos conjugados com anticorpos. Neste experimento, a imunoprecipitação HO da alça do caule MS2, contendo RNA GAG PCE retroviral em células e em eluentes, foi validada por RT-PCR e QRT-PCR.

Os resultados confirmaram uma associação selecionada entre DHX9/RHA e o retroviral five prime UTR, que tem sido destacado como um RNP único, importante para o controle de tradução direcionado. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente cinco horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de executar todas as etapas de forma eficiente e cuidadosa, para garantir a manutenção dos complexos RNP intactos e o isolamento do complexo RNP específico de interesse.

Após este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massa e RNA-Seq, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a associação global da proteína com o RNA alvo. E análise de região ou completa de todos os transcritos envolvidos em uma RNP específica. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do controle de genes pós-transcricionais explorarem os distintos complexos de proteínas de RNA que governam a expiração do gene viral patogênico e o mecanismo geral de controle da expressão gênica celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como colher complexos RNP celulares intactos e determinar sua composição usando enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos seletivos. Não se esqueça também, trabalhar com vírus patogênicos e amostras biológicas e produtos químicos perigosos como ácido ou fenol pode ser extremamente perigoso. Todas as precauções, como equipamento de proteção individual adequado, devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.