Classificação de fluxo e sequenciação Exome das células de Reed-Sternberg do linfoma de Hodgkin clássico

O objetivo geral deste procedimento é separar e concentrar células viáveis de Hodgkin Reed-Sternberg ou HRS de tumores inflamatórios linfocíticos clássicos de linfoma de Hodgkin ou CHL para a geração e análise de dados de sequenciamento de próxima geração de exoma completo de alta qualidade. Este método pode responder a questões-chave na biologia do CHR, incluindo a identificação de mutações de driver-chave, mutações de escape imunológico e também a observação da diversidade gênica dentro da classificação. Esta técnica produz DNA derivado de tumor que é muito alto em qualidade e pureza.

Facilitando a geração de bibliotecas de sequenciamento de próxima geração sem a necessidade de uma etapa de pré-amplificação. Esta técnica pode ter implicações importantes para o diagnóstico do linfoma de Hodgkin, pois pode ajudar na subclassificação e prognóstico. Também pode influenciar na escolha da terapia, pois algumas alterações podem indicar suscetibilidade ou resistência a medicamentos específicos.

Jonathan From teve essa ideia pela primeira vez quando descobriu como visualizar células HRS por citometria de fluxo e realizar os primeiros experimentos de classificação com essas células. Antes de preparar as células, misture os anticorpos pré-titulados num frasco para injetáveis de vidro escuro. Em seguida, adicione PBS e BSA para levar o coquetel de anticorpos a um volume de 100 microlitros.

E transfira o frasco de nitrogênio líquido para um balde de gelo ou gelo seco. Em seguida, descongele rapidamente as células de interesse em um banho-maria de 37 graus Celsius. Quando restar apenas uma pequena porção congelada, despeje as células em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 45 mililitros de meio de descongelamento a 37 graus Celsius e enxágue o frasco criogênico duas vezes com um mililitro de meio de descongelamento fresco.

Depois de agrupar os dois enxágues, deixe as células digerirem em temperatura ambiente por 15 minutos. Quando as células estiverem reequilibradas, colete-as por centrifugação. Aspire todos, exceto os últimos 200 microlitros do sobrenadante.

Suspenda novamente as células no meio de descongelamento restante e deixe-as descansar por mais dois a três minutos. Em seguida, incube as células em 100 microlitros do coquetel de anticorpos por 15 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. No final da incubação, lave as células em três mililitros de meio separador, ressuspendendo o pellet em um mililitro de meio separador fresco.

Em seguida, filtre as células através de um filtro superior de tubo de fluxo de cinco mililitros. Enxágue o tubo e o filtro com mais um mililitro de meio de classificação e mantenha as células no gelo. Antes de iniciar a classificação de células, no software do citômetro de fluxo no menu do experimento, selecione novo experimento e abra a janela de status do instrumento.

Na guia de parâmetros, exclua todos os parâmetros não utilizados. Em seguida, reabra a guia do experimento e selecione a configuração de compensação para criar os controles de compensação. Na janela do navegador, clique no sinal de mais para expandir a amostra de controle de compensação e execute os tubos de controle de compensação sem registrar os dados.

Ajuste as tensões do detector conforme necessário para que as populações de grânulos coradas positivamente para cada cromo da flora estejam entre os canais 10.000 e 100.000. E dos mais brilhantes em seu canal de detecção primário. Registre as tensões necessárias para cada parâmetro para cada tubo.

Em seguida, sob a amostra de controle de compensação, clique com o botão esquerdo para destacar o tubo de controle não corado e carregue o tubo de controle não corado no estágio de amostra. Na janela de controle de aquisição, clique em carregar e execute os controles de compensação individuais nos campos de tensão do detector para que todos os parâmetros insiram manualmente as tensões determinadas. Clique em gravar para obter os dados de controle não corados.

Em seguida, execute todos os controles de compensação restantes, registrando os dados sem alterar nenhuma das configurações do detector. Quando todos os controles tiverem sido analisados, passe um tubo de água deionizada estéril por cinco minutos para limpar o instrumento de qualquer material residual antes de prosseguir. Para bloquear as células para classificação HRS, carregue o tubo experimental e registre pelo menos 100.000 eventos enquanto ajusta a taxa de fluxo para adquirir 3.000 a 4.000 eventos por segundo.

Certifique-se de registrar eventos suficientes para visualizar uma população que pode ser tão pequena quanto uma em 1.000 células. Para identificar os controles somáticos de células B e T, gate nas células CD20 e CD5 positivas, respectivamente. Quando todos os portões estiverem definidos, separe as células em tubos cônicos pré-resfriados de 15 mililitros contendo sete a oito mililitros de meio de coleta.

No final da classificação, transfira as populações de células isoladas para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. E pelete as células por centrifugação. Em seguida, lave as células em um mililitro de PBS fresco e remova os sobrenadantes de cada tubo, tomando cuidado para não perturbar os minúsculos grânulos.

Após a amplificação da biblioteca e a limpeza do cordão do ponto 8X, uma distribuição normal de luz dos tamanhos dos fragmentos na faixa desejada deve ser observada. Bibliotecas que exibem desvios dessa forma indicam a presença de um artefato de alto ou baixo peso molecular e, idealmente, não devem ser sequenciadas. Por exemplo, um dímero adaptador às vezes pode ser transferido através da primeira limpeza do cordão X pontiagudo, aparecendo como um pico agudo centrado em torno de 125 a 130 pares de bases.

Nesse caso, uma limpeza adicional do cordão X pontiagudo deve ser realizada, seguida por uma visualização repetida da distribuição de tamanho para garantir a remoção bem-sucedida do dímero. Após o sequenciamento de multiplexação de quatro amostras por pista, é possível obter uma profundidade média de cobertura de 50 a 100 X em todo o alvo. Embora os gráficos de número de cópias gerados a partir de uma biblioteca de um nanograma possam resultar em ganhos e perdas espúrios de número de cópias.

Aproximadamente 70% dos casos de linfoma de Hodgkin clássico carregam mutações B2M e 820 e/ou deleções que parecem ser clonais e que podem ser usadas para estimar o conteúdo relativo do tumor. Se as células T forem usadas como controles somáticos, o sequenciamento HRS demonstrará ganhos significativos no número de cópias nas posições correspondentes às posições alfa, delta e beta do receptor de células T. Bem como perdas significativas nas posições de cadeia leve pesada e kappa do receptor de células B com uma carga mutacional geral de 100 a 400 mutações somáticas por caso de exoma.

Uma vez dominada, essa técnica, incluindo a classificação de células e a construção da biblioteca de sequenciamento, pode ser concluída em três a quatro dias se for executada corretamente. Após este procedimento, podemos realizar estudos prospectivos maiores e outros métodos, como epigenética, proteômica e metabalômica para obter mais conhecimento sobre o linfoma de Hodgkin e progredir em direção a terapias personalizadas mais específicas. Após seu desenvolvimento, o método nos permitiu estudar células HRS com alta pureza em números relativamente grandes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células HRS e iniciar sua análise genômica.