Name: Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda genotipagem de peixes-baiacu tóxicos por PCR-RFLP combinado com cromatografia líquida e espectrometria de massa. Este método utiliza coluna monolítica de sílica para separação eficiente de amplicons digeridos.

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Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Auxílio para Pesquisa Científica da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (15K08060).

1. Extração de DNA Nota: Use uma sala separada para exames de extração de DNA e pós-PCR, tais como eletroforese em gel e LC / ESI-MS. Adicionar etanol ao tampão de lavagem 1 (contendo cloridrato de guanidina) e tampão de lavagem 2 (não contendo cloridrato de guanidina) de acordo com o protocolo do kit de extracção de ADN. As amostras de peixes foram obtidos a partir de peixe grossistas e mercados retalhistas no Japão. <ol><li> Coloque 30-50 mg de tecido de peixe num tubo de 0,5 ml ou 1,5 ml de microcentrífuga. Esmagar o tecido usando um micro-espátula (exceto para fin e pele). Nota: No caso de aleta, utilizar um tubo de 0,5 ml de imersão. </li><li> Adicionar 180 ul de tampão de lise e 40 ul de proteinase K e vortex brevemente. Incubar a 56 ° C num bloco de aquecimento durante 2 horas ou durante a noite. Misturar em vortex brevemente a cada 15 minutos durante a incubação. Nota: lise completa não é necessária. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 13.000 x g. Após centrifugação, se uma pequena amount de óleo existe sobre a superfície, no caso de uma amostra gordos tais como o fígado, descartá-lo. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de caotrópico contendo cloridrato de guanidina e misturar por vortex. Adicionar 200 uL de etanol (99,5%) e mistura por turbilhonamento novamente. </li><li> Transferir a mistura para a coluna de rotação colocados num tubo de recolha de 2 ml. Centrifugar durante 1 min a 13.000 x g. Descartar o fluxo de passagem. Cuidado: Não adicione água sanitária para o lixo porque guanidina pode formar compostos altamente reativos com lixívia. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lavagem 1 (contendo cloridrato de guanidina) e centrifugação durante 1 min a 13.000 x g. Elimine o escoamento eo tubo de coleta. </li><li> Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml fornecido com o kit. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem 2 e centrifuga-se durante 3 min a 20.000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha. Transferir a coluna de centrifugação para uma nova1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Pipete 200 pi de tampão de eluição para o centro da membrana por coluna de centrifugação. Após 1 min, centrifugar durante 1 min a 6000 x g. </li><li> Pipetar 50 ul do eluato a uma cuvete descartável de UV e medir o espectro de UV do eluato a 220-300 nm e a absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. </li><li> Verificar o espectro de UV do DNA com o pico a 260 nm. Calcula-se a concentração de DNA aproximado utilizando a equação simples &quot;concentração de ADN (ng / mL) = absorvância a 260 nm x 50&quot;. Nota: concentração de DNA típica extraído das aletas de pufferfish é de 63 ± 30 ng / mL (n = 20). </li><li> Se a concentração de ADN é maior do que 10 ng / mL, diluir as amostras de ADN com tampão Tris-EDTA (TE) (pH 8) a 5 ng / mL. </li><li> Armazenar a amostra a -20 ° C ou prosseguir para a amplificação por PCR (Secção 2). </li></ol> 2. PCR <ol><li> Configurar 25 mL PCR para cada extragiu amostra de ADN, de controlo positivo (0,2 uM de oligonucleótidos sintetizados possuindo a sequência alvo em tampão TE a pH 8,0) e controlo negativo (água ultra-purificada em vez da amostra de DNA) em gelo de acordo com as Tabelas 1 e 2 numa bancada limpa para evitar a contaminação. Nota: Para a operação fácil, fazer uma quantidade suficiente de cocktail contendo todos os reagentes sem DNA modelo e dispensá-la. Use polimerase com actividade correctora de ADN para evitar a adição de 3 &#39;salientes para o produto de PCR. </li><li> Levar a cabo uma amplificação por PCR na termociclador utilizando o programa do ciclo mostrado na Tabela 3. </li></ol> 3. Digestão Enzimática <ol><li> Adicionar 2 ml da solução contendo Tris-HCl 100 (pH 7,5), MgCl2 100 mM, ditiotreitol 10 mM e NaCl 500 mM à solução de PCR. </li><li> Adicionar 1 ml de cada enzima de restrição (Dra I e Msp I) e misture delicadamente. Incubar durante 30 min a 37 ° C no thcycler ermal. </li><li> Incubar durante 5 min a 72 ° C para activar a polimerase de ADN remanescente, que enche a extremidade coesiva gerado por Msp I. </li><li> Opcional: Analisar cada uma com 2,5 ul da solução da reacção por electroforese em gel de poliacrilamida usando uma razão transversal de ligação (% C, percentagem de bisacrilamida) de 3,33 (% em peso) e uma concentração do gel de poliacrilamida (% T) de 15 (% w / v) 38. Manchar o gel usando o corante de ADN fluorescente e observar DNA dupla vertente num transiluminador de luz azul usando uma tela de âmbar. </li><li> Filtra-se a solução de reacção com um dispositivo de filtro centrífugo 0,2-0,5 uM para evitar o entupimento, o que iria danificar a coluna analítica. </li><li> Transferir o filtrado para um frasco de polipropileno afunilada e armazenar a -20 ° C até à análise. </li></ol> 4. LC / ESI-MS Análise <ol><li> Pesar 67,2 g (ca. 42 ml) de HFIP e 1,52 g (cerca de 2,0 ml) de TEA em uma garrafa de 1 L. Adicione 955 ml de água ultrapura (LC / MS graDE) e agita-se com um agitador magnético até que os reagentes estão completamente dissolvidos. Tome-se uma alíquota da solução e verificar o pH (entre 7,85 e 7,95; idealmente pH = 7,9) utilizando um medidor de pH. Nota: Não envie a alíquota para a garrafa para evitar a contaminação por íons metálicos. Se o pH não é 7,9, adicionar uma pequena quantidade de HFIP ou qualquer TEA para ajustar o pH e medir novamente o pH. </li><li> Ligue o frasco com a linha A do cromatógrafo líquido com arrefecimento da garrafa utilizando um refrigerador portátil arrefecimento directo (para uso doméstico) para evitar a vaporização. Conectar uma outra garrafa cheia com metanol a linha B. </li><li> Ligar a coluna de guarda e a coluna analítica (2,0 x 50 mm, tamanho de mesoporos = 30 nm) para o cromatógrafo líquido. Começar a fluir a fase móvel inicial (95% de A e 5% de B) para equilibrar as colunas. </li><li> Prepare a 0,5 mg / ml de sódio trifluoroacetato (pH 3,5) como um calibrador 39. <ol><li> Pesar 50 mg (ca. 34 uL) de ac trifluoroacéticoID numa proveta. </li><li> Adicionar 30 ml de água ultra-purificada e titula-se a pH 3,5 com hidróxido de sódio a 10 mM, com o auxílio de um medidor de pH. </li><li> Encha até 50 ml com água ultrapura. Adicionar 50 ml de acetonitrilo (LC / MS grau) e misturar. </li><li> Pegue uma porção da solução de trabalho e armazená-lo à temperatura ambiente. Armazenar o resto da solução a 4 ° C. </li></ol></li><li> Reduzir a pressão de azoto de C-armadilha como se segue. Nota: Fourier recentes transformar espectrómetros de massa, que são adequados para a análise de proteínas intactas, tem software de controlo para controlar a pressão. <ol><li> Remova a tampa superior esquerda do espectrômetro de massa. A válvula C-armadilha está no canto do primeiro plano esquerdo. </li><li> Verifique o valor da pressão de alto vácuo na janela de estado instrumento de software de controle. Nota: O valor é tipicamente, 3 x 10 -8 bar. </li><li> Puxe o botão para desbloquear e transformar o sentido anti-horário o botão de forma muito lenta para reduzir a imprensa alto vácuoure a 1/3 (tipicamente, de 1 x 10 -8 bar). A pressão indicada deve mudar gradualmente de uma forma retardada. Ignorar a mensagem de aviso sobre baixa pressão. Pressione o botão para bloquear. </li><li> Restaurar a tampa superior para a segurança. </li></ol></li><li> Calibrar o espectrômetro de massa usando trifluoroacetato de sódio 39. Nota: A calibração de massa diária pode ser substituído pelo presente protocolo, no entanto, a calibração recomendado sugerido pelo fabricante deveria ter sido concluído antes desta calibração. <ol><li> Definir parâmetros de digitalização e aquecidos parâmetros da fonte ESI na caixa de controle do instrumento do software de ajuste da seguinte forma: tipo de digitalização MS completo; varredura de intervalo m / z 500-4,000; fragmentação (in-fonte de dissociação (CID) Tensão 60 eV colisão induzida; polaridade negativa; auto controle de ganho (AGC) alvo 1 x 10 6, tempo máximo de injetar 50 ms; caudal de gás 5 bainha; aux caudal de gás 0; gás de varrimento taxa de 0 fluir; spray de tensão de 3 kV; temperatura capilar 320 ° C; S-lente de radiofrequência (RF) nível 100; temperatura do aquecedor 30 ° C. <ol><li> Entrada da lista de íons negativos para ser monitorado como m / z 792,85908, 1.064,80870, 1.336,75832, 1.608,70794, 1.880,65755, 2.152,60717, 2.424,55679, 2.696,50640, 2.968,45602, 3.376,38045. </li></ol></li><li> Mover a sonda ESI aquecida para mais perto da interface do espectrómetro de massa (posição B). Ligar a sonda e uma seringa com um tubo. </li><li> Infundir a calibração constantemente a uma taxa de fluxo de 10 mL / min usando a bomba de seringa encaixado. Verificar apenas a 6 inferiores iões de massa (m / z) 792,85908-2.152,60717 na tabela de calibração personalizado. <ol><li> Continuar com a calibração depois de a intensidade dos sinais são estabilizados. Após a calibração, verificar apenas os seis íons de maior massa (m / z 1.880,65755-3.376,38045) e prossiga com a calibração. Evite calibrar usando todos os íons de uma vez para evitar o fracasso. </li></ol></li></ol></li><li> Mova a sonda para o appropriaposição TE para uma taxa de fluxo de 0,4 ml / min (posição D) e conectar-se o cromatógrafo de fase líquida com um tubo de metal inerte. </li><li> Defina os parâmetros aquecidos fonte ESI na caixa de controle do instrumento do software de ajuste como segue: taxa de fluxo de gás bainha 50; taxa de fluxo de gás aux 15; varrer caudal de gás 1; pulverizar tensão de 2,5 kV; temperatura capilar de 350 ° C; S-lente nível de RF 100; temperatura de aquecimento 350 ° C. </li><li> Definir parâmetros de aquisição do espectrômetro de massa na janela de configuração instrumental da seguinte forma: método de duração 8 min; desviar a válvula, 3.5-6 min para espectrômetro de massa, 0-3,5 e 6-8 min para o lixo; tempo de execução 3,5 a 6 min; polaridade negativa; em tensão CID fonte de 15,0 eV; microscans 3; poder de resolução nominal (em m / z 200) 140.000; -Alvo AGC 1 x 10 6; tempo ion máximo 50 ms; número de scans 1; varredura de intervalo m / z 700-3,500; espectro de perfil tipo de dados. </li><li> Definir parâmetros de cromatógrafo líquido as seguintes: Coluna de temperatura do forno 20 ° C; sample temperatura de tabuleiro de 10 ° C; programa de gradiente de 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% de B, 5-6 min 98% B, 6- 6,05 min 98-5% de B, 6,05-8 min 5% de B; taxa de fluxo 0,4 ml / min. </li><li> Purge bolhas tocando o fundo dos frascos. Definir frascos de amostra no suporte de amostras e injetar 1,0 ul de uma amostra usando o amostrador automático para iniciar a análise. </li><li> Abrir arquivos de dados brutos com o software navegador e confirmar que todas as aquisições são concluída com êxito, incluindo os controlos positivos e negativos. Nota: Normalmente, dois ou três picos seria observado no cromatograma corrente iónica total a um tempo de retenção de 4-5,5 minutos quando pufferfish ADN é amplificado e digerido com sucesso. </li></ol> 5. Deconvolution e Interpretação <ol><li> Inicie o software de deconvolução. Selecione o tipo de experiência &quot;extrato de auto (isotopicamente resolvido)&quot;. </li><li> Editar um método utilizando os seguintes parâmetros: a produção de massa M; S / N threshold 3 limiar abundância relativa 0; carga negativa yes; calcular extraído ion cromatograma corrente (XIC) sim; gama m / z 700-3,500; cobrar transportadora H +; número mínimo de carga detectada 3; isótopo rácio de nucleotídeos; fator de ajuste de 80%; limiar restante 0%; Considere sobreposições yes; cobrar faixa de 3-50; intensidade mínima 1; Espera erro intensidade 3. <ol><li> Salvar como um novo método e selecione-o. </li></ol></li><li> Selecione o diretório onde os arquivos existem dados brutos. Selecione os arquivos de dados brutos a serem analisados ​​e clique em &quot;Adicionar para a Fila&quot; botão. </li><li> Clique no botão &quot;Run&quot; no separador &#39;Run Queue&#39; para iniciar deconvolução. </li><li> Depois que a fila é completada, selecione uma linha e clique em &#39;Resultado Open&#39; na legenda superior para obter os resultados da deconvolução. </li><li> Interpretar os resultados a partir das massas monoisotópico derivados dos picos a um tempo de retenção de 4-5,5 minutos utilizando a tabela 4. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Para extrair ADN, um kit comercial para a extracção de ADN a partir de sangue e de tecidos é utilizado de acordo com o protocolo do fabricante com pequenas modificações (quantidade de proteinase K e centrifugação da solução de lise). No entanto, qualquer kit de extracção pode ser utilizado, desde que o ADN celular pode ser extraída com recuperação e pureza apropriada para PCR. Este método foi testado usando o músculo, aleta, fígado, ovário e pele 37. Barbatana é especialmente apropriado devido à grande área de superfície, o que permite a rápida lise com proteinase K. frescos, congelados, secos, cozidos e amostras pufferfish cozidos foram testados com sucesso 37. O conjunto de primers PCR (Tabela 1) é projetado para baiacu e amplifica o gene do RNA ribossomal 16S mitocondrial de baiacu. O ADN alvo a amplificar é 114-115 pb (género Takifugu) e 86 pb (género lagocephalus) (Tabela 5). Para facilitar método development, foram utilizados oligonucleotídeos sintetizados com as sequências alvo para a referência em vez de recolher espécimes pufferfish autênticos. O conjunto de iniciadores pode ser substituído por um outro conjunto de iniciadores, em resposta ao efeito, no entanto, o comprimento final de ADN após a digestão enzimática deve ser inferior a 100 nt em termos de manutenção da qualidade do espectro de massa necessária para desconvolução bem sucedida. Além disso, a pressão de azoto no C-armadilha deve ser reduzida quando o oligonucleótido alvo é mais do que cerca de 75 nt e a qualidade do espectro de massa não é suficiente para desconvolução bem sucedida. Estas limitações podem ser controlados por meio de desenvolvimentos recentes no software do instrumento, caso contrário, a válvula para o C-armadilha no interior do chassis deve ser ajustado, como descrito na secção de protocolo. Quanto à preparação da amostra, a utilização de reagentes sem detergente é crítica para a LC subsequente em termos de formato de pico apropriado, a intensidade do pico e suficiente tempo de retenção estável 31. 21,24-33 monólito, um C-18 de fase inversa em coluna de sílica em partículas 23,40,41 e uma cromatograf ia de interacção hidrofóbica (HILIC) coluna 42 foram utilizados para a LC / ESI-MS análise de oligonucleótidos. Entre eles, a coluna monólito capilar é superior aos outros em termos de capacidade de separação, no entanto, a coluna monólito capilar utilizado em estudos anteriores foi feita em casa e operado a um caudal baixo (2 ul / min), o que requer instrumentação dedicado a micro LC. Para facilitar a operação fácil, colunas comercialmente disponíveis foram avaliados para a separação de oligonucleótidos longos a taxas de fluxo mais elevadas (100-400 mL / min). Três pares de cadeias duplas de ADN (26, 37 e 53 pb) foram separados usando colunas acima mencionadas, no entanto, os tempos de ciclo da coluna C 18 de partículas de sílica e a coluna -bonded PS-DVB monólito eram 65 e 70 min, respectivamente , enquanto que a da C <sub&gt; 18 -bonded coluna de sílica monólito foi de 8 min (Figura 1). Tomando em consideração a análise rápida, a coluna de sílica monólito C 18 -bonded foi escolhido para os nossos propósitos, apesar da capacidade de separação limitada; No entanto, os restantes duas colunas podem ser empregues quando é necessária a separação melhorada. Teoricamente, no caso de uma coluna monólito, não há o volume intersticial e a fase móvel seria forçado a fluir através dos poros da fase sólida, mantendo um comprimento de percurso consistente, possibilitando assim uma separação eficiente 27. Tais processos seriam manifesta, particularmente na análise de biomacromoléculas, tais como um oligonucleótido, como o lenta difusão das moléculas grandes. Uma das vantagens práticas de uma coluna monólito é que a contra-pressão é mais baixa do que a de uma coluna de sílica em partículas 27. Apesar da elevada taxa de fluxo (400 ul / min) e baixa temperatura da coluna (20 ° C), pressão de retorno máxima dosistema foi de 12,5 MPa 37. Esta é a primeira demonstração da vantagem de uma coluna de sílica -bonded monólito C 18 para a análise rápida de um oligonucleótido de comprimento. Devido à elevada taxa de fluxo, um instrumento dedicado para micro LC e alinhamento preciso na interface não são necessários. Em vez disso, uma sonda de ESI aquecida é necessária para dissociar o duplex de DNA e auxiliar de ionização de ADN, tal como descrito mais tarde. cromatograf ia de par iónico é comumente utilizado para a separação de MS-compatível de oligonucleótidos. No entanto, um reagente de par iónico geralmente interfere com o processo de ESI e diminui a sensibilidade de ESI-MS. Portanto, o HFIP é frequentemente utilizada para a fase móvel, para melhorar a sensibilidade do oligonucleótido. No entanto, HFIP (ponto de ebulição 59 ° C) vaporiza-se rapidamente na interface antes (ponto de ebulição 65 ° C) de metanol e, por conseguinte, esta perda de solvente aumenta o pH e promove a dissociação do reagente de par iónico (ou seja, TEA)a partir do oligonucleótido. Porque o presente método emprega uma sonda ESI aquecida, que nebuliza o eluato com azoto quente a 350 ° C, este efeito pode ser mais enfatizado. Em vez de tampão de HFIP-TEA, Erb e Oberacher recomendado etilo cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA; pH 8,4) para a análise de genotipagem devido a uma redução na formação de produtos de adição com os iões metálicos vestigiais 33. Os autores deduzido que em si CycHDMAA suprimida a formação do aducto de metal. Apesar da literatura, formação de aduto não significativo foi observado no presente método. Além disso, o benefício notável do sistema HFIP-TEA-metanol é que a área do pico obtido com o sistema de HFIP-TEA-metanol foi 17 vezes maior do que a obtida a partir do sistema CycHDMAA-acetonitrilo ao analisar um amplicon 86 bp de T. poecilonotus (dados não mostrados). Uma desvantagem do sistema de HFIP-TEA-metanol, no entanto, é o aumento do custo em relação ao sistema CycHDMAA-acetonitrilo. Cálculo da massa monoisotópica requer a separação de picos isotópicos de iões de cargas múltiplas. Portanto, a resolução é crítica para a presente análise. Apesar de poder de resolução requerida é dependente do comprimento de pares de bases do analito, analisadores TOF convencionais, que têm um poder de resolução de várias dezenas de milhares de pessoas, pode ser limitado para a análise de oligonucleótidos curtos. As massas teóricas monoisotópico mostrados na Tabela 4 foram calculados a partir das composições de base de correspondentes dos analitos. Alternativamente, Muddiman et ai. Desenvolveram uma aplicação de software para calcular a composição da base da massa 43 precisas. Um programa similar foi integrado no sistema automatizado ESI-MS 16-18. A utilização destes algoritmos pode melhorar a robustez do presente método porque uma massa monoisotópica medido nem sempre corresponde a uma base única composição óasa para a tolerância de massa de 3 ppm resultante do erro de medição inevitável. Infelizmente, não foi possível obter esses produtos de software para o presente estudo. A presente determinação espécies baseado na massa monoisotópica podem ser adequados não só para a diferenciação de pufferfish mas também para a detecção de outros polimorfismos do ADN, porque o presente método baseia-se na análise da composição de base e não envolve um processo especialmente concebido para pufferfish. Tal como para a detecção de polimorfismos de ADN, o sistema de ESI-MS dedicado é totalmente automatizada e fácil de operar, que pode ser adequado para utilização em diagnóstico, tais como a detecção de agentes patogénicos 15,17,18,20,30. Por outro lado, o presente método é viável com instrumentos comuns de investigação e aparelhos e, portanto, adequados para usos de investigação. ESI-MS já foi aplicada ao polimorfismo de ADN humano tal como 13,28,32 single nucleotide polymorphism, repetição tandem curtas 26, E DNA mitocondrial analsis 16,19. Micro RNA também foi analisado via LC capilar / ESI-MS 44. Estas aplicações publicadas também pode ser realizado através do presente método. Além disso, este método pode ser adequado para o controlo da interacção entre os compostos de oligonucleótidos e de baixo peso molecular, tais como a interacção de antibióticos e ARN ribossomal 45 devido à separação de baixa temperatura. Em tais casos, oligonucleótidos e compostos de baixo peso molecular devem ser detectados simultaneamente, o que é uma vantagem da utilização de LC / ESI-MS. Não há uma limitação de que a instrumentação não é adequado para a realização de análise paralelo como em técnicas convencionais, tais como a sequenciação de Sanger e PCR em tempo real. Além disso, o presente método identifica apenas a composição de base e qualquer substituição de base dentro da mesma molécula não podem ser distinguidos. No entanto, a análise de DNA baseado no MS descrito aqui ainda pode ter mérito no prazoS de precisão em comparação com a ligação técnicas à base de corantes, tais como electroforese em gel e PCR em tempo real de ADN.

Espectrometria de massa (MS) é uma tecnologia aceite para identificação rápida e fiável de ácidos nucleicos, de laser assistida por matriz dessorção / ionização (MALDI) e ionização por electrospray (ESI) a ser utilizado para ionização 1,2. A técnica MALDI é tipicamente combinado com um tempo de voo com analisador (TOF); No entanto, a aplicação de MALDI-TOF MS está limitada a oligonucleótidos curtos (~ 25 nucleótidos (nt)) devido à fragmentação posterior, formação do aduto e baixa eficiência de ionização de 1,2. Em contraste, a ESI é aplicável a oligonucleótidos mais longos (&gt; 100 nt), mas muitos estados de carga múltipla de iões carregados ([M-NH] n-) são produzidos simultaneamente de biomacromoléculas e, por conseguinte, a massa do analito pode exceder o máximo limite da gama m / z do espectrômetro. Isto requer a interpretação dos espectros convoluta, ou seja, a transformação de uma série estado de carga na massa correspondendovia deconvolução. No caso da medição de massa de uma molécula pequena, o pico da massa monoisotópica, ou seja, a massa da molécula contendo apenas o isótopo mais comum de cada elemento é o mais abundante e observada naturalmente 3. Como o peso molecular aumenta, os deslocamentos de distribuição isotópica para maior m / z e o pico monoisotópico é obscurecida pelo ruído de linha de base 3-5. Uma vez que o pico monoisotópico não é mais detectável por massas superiores a 10 kDa 3, a massa molecular média é utilizado para a medição em vez do que a massa monoisotópica 5. Em tais casos, a distribuição isotópica em que cada um dos picos individuais são separados por uma Da só pode ser observado quando um analisador de massa de alta resolução tal como um TOF, uma ressonância de ciclotrão ião transformada de Fourier modificado Kingdon analisador armadilha 6, ou uma transformada de Fourier analisador é utilizado para análise. No entanto, o pico mais abundante é a sometimes não é consistente com a massa molecular média de 5. Estes problemas podem levar a dificuldades para a determinação exacta analitos. Dada a variação na abundância natural dos isótopos estáveis ​​e as dificuldades na determinação da massa molecular média, a medição da massa monoisotópica é ideal para a caracterização de massa de biomoléculas 3,4. Na prática, se um pico monoisotópico podem ser observadas ou não, a massa monoisotópica pode ser estimado por comparação do padrão de distribuição isotópica observada para a teórica calculada a partir de um modelo de analito 4,7-10. O algoritmo de ajuste 8 está agora incorporado no software proprietário. No contexto de ESI-MS, a dissociação de um duplex de DNA, purificação e dessalinização são necessárias para a medição directa para evitar a falha de ionização devido à supressão de iões e formação de aduto 2,10-14. Estes procedimentos são troublesome, no entanto, sistemas analíticos totalmente automatizados foram desenvolvidos comercialmente envolvendo reacção em cadeia da polimerase (PCR), a preparação da amostra e ESI-MS para a detecção de agentes patogénicos 15-20. Outra abordagem é a introdução de cromatografia líquida (LC) para a separação. LC proporciona uma separação em linha dos analitos a partir de substâncias que coexistem e não requer uma preparação da amostra trabalhoso antes da ionização 21,22. No entanto, a separação de ácidos nucleicos utilizando uma fase móvel MS-compatível é mais difícil do que para a maioria dos outros compostos tais como fármacos, péptidos e proteínas, devido à natureza polianiónica dos nucleótidos. Os exemplos mais bem sucedidos de LC / ESI-MS envolvem o uso de par-ião de LC de fase reversa. Uma fase móvel de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol foi inicialmente proposto por Apffel et al., Para separar e detectar os oligonucleótidos curtos 23. Aplicação de LC / genotipagem ESI-MS para differentiation de espécies de agentes patogénicos, polimorfismos de nucleotídeo único e repetições curtas em tandem foi relatado usando uma coluna de polímero monólito capilar que pode separar oligonucleotídeos mais 1,21,24-33. No Japão e nos Estados Unidos, intoxicação alimentar grave ocorreu devido a erros de identificação e preparação inadequado de baiacu, e isso apesar do fato de que a distribuição e preparação de baiacu é rigorosamente controlada por legislação de segurança alimentar 34,35. Além disso, um homicídio intencional utilizando extrato de baiacu aconteceu no Japão 36. Portanto, a diferenciação de espécies pufferfish é necessária tanto a saúde pública e pontos de vista de investigação forense. Além disso, porque Takifugu Rubripes é muito mais caro do que outros tipos de baiacu, uma capacidade de diferenciação é também necessária no contexto de investigações de fraude alimentar. Aqui, um método detalhado para a determinação do monoisotopic massa de um produto de PCR por LC / ESI-MS, utilizando uma coluna de sílica monólito de fase reversa e um espectrómetro de massa de alta resolução é descrito. Especificamente, a abordagem foi desenvolvida para permitir a diferenciação de espécies tóxicas pufferfish baseadas na utilização da PCR, comprimento de polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP) Método 37, o qual é o primeiro exemplo para a diferenciação de espécies de animais, utilizando MS.

<table><tbody><tr><td>DNeasy Sangue & Kit de lenços de papel (50)</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Kit de extração de DNA</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5+ vol%)</td><td>Wako</td><td>054-07225</td><td>Para diluição de tampões de lavagem</td></tr><tr><td>Tampão TE (pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>310-90023</td><td>Para diluição de amostra de DNA</td></tr><tr><td>PCR primer</td><td>Fasmac</td><td>NA</td><td>Purificado com coluna de cartucho de fase reversa pelo fornecedor</td></tr><tr><td>Modelo DNA</td><td>Eurofins Genomics</td><td>NA</td><td>Purificado por HPLC pelo fornecedor</td></tr><tr><td>Água ultrapurificada</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Gerado com um sistema de purificação direta de água Milli-Q (Merck Millipore), usado para preparação de amostras</td></tr><tr><td>Sem detergente 5x Phusion HF Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-520L</td><td>Use em vez do tampão fornecido de DNA polimerase</td></tr><tr><td>Pfu-X DNA polimerase</td><td>Jena Bioscience</td><td>Mistura de dNTP PCR-207S</td><td></td></tr><tr><td>(20 mM cada)</td> <td>Jena Bioscience</td><td>NA</td><td>Fornecido com a DNA polimerase</td></tr><tr><td>10&vezes; Tampão universal M</td><td>Takara Bio</td><td>NA</td><td>Contendo 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de MgCl2, 10 mM de ditiotreitol e 500 mM de NaCl</td></tr><tr><td>Dra I</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0224</td><td>Enzima</td></tr><tr><td>de restrição Msp I</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0544</td><td>Enzima de restrição</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Fluka</td><td>42060-50ML</td><td>Aditivo eluente para grau LC-MS.</td></tr><tr><td>Trietilamina (TEA)</td><td>Fluka</td><td>65897-50ML</td><td>Aditivo eluente para grau LC-MS.</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Para preparação de calibrante.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (1,0 M)</td><td>Fluka</td><td>72082</td><td>Diluir a 10 mM com água ultrapurificada e utilizar para titulação de ácido trifluoroacético.</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>Para preparação de calibrante, grau LC/MS.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Kanto</td><td>25185-76</td><td>Para fase móvel, grau LC / MS.</td></tr><tr><td>Água</td><td>Thermo Fisher</td><td>W6-1</td><td>Para fase móvel, grau LC / MS.</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (0,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>0030123301</td><td>PCR clean grade</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>0030123328</td><td>PCR clean grade</td></tr><tr><td>UVette</td><td>Eppendorf</td><td>0030106300</td><td>Cubeta UV descartável.</td></tr><tr><td>Gel Green</td><td>Biotium</td><td>41004</td><td>Coloração de DNA fluorescente</td></tr><tr><td>Filtro Cosmospin G (0.2 &mu; m)</td> <td>Nakalai Tesque</td><td>06549-44</td><td>Feito de membrana hidrofílica de politetrafluoretileno (PTFE). Qualquer unidade de filtro centrífugo (tamanho do poro, 0.2&ndash; 0,5 &mu; m) feito de PTFE hidrofílico ou outra membrana de baixa ligação é aplicável.</td></tr><tr><td>300 &mu; l Frasco de parafuso PP</td><td>American Chromatography Supplies</td><td>V0309P-1232</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de rosca pré-montada e septos</td><td>Coluna analítica Finneran</td><td>5395-09R</td><td></td></tr><tr><td>Monobis C18 (2.0&times; 50 mm, tamanho do mesoporo = 30 nm)</td><td>Kyoto Monotech</td><td>2050H30ODS</td><td>Fora do Japão, disponível para compra na GL Sciences através de seus distribuidores. (http://www.glsciences.com/distributors/)</td></tr><tr><td>Coluna de guarda Monobis C18</td><td>Kyoto Monotech</td><td>GCSET-ODS3210</td><td>Suporte incluído.</td></tr><tr><td>Cadenza CW-C18 (3.0&vezes; 250 mm)</td> <td>Imtakt</td><td>CW036</td><td>C18-ligado coluna de sílica particulada</td></tr><tr><td>ProSwift RP-4H (1,0&vezes; 250 mm)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>066640</td><td>Coluna monolítica de poli (estireno-divinilbenzeno)</td></tr><tr><td>Misturador Themo C</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.023</td><td>Para digestão de tecidos de peixes.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Shimadzu</td><td>UV-3150</td><td>Quantificação da concentração de DNA.</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Frigorífico portátil</td><td>Twinbird</td><td>D-CUBE</td><td>Para fase móvel aquosa para evitar a evaporação do HFIP. Isso pode ser substituído por uma caixa de gelo.</td></tr><tr><td>Cromatógrafo líquido Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q Espectrômetro de massa exativo</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td>Espectrômetro de massa com transformada de Fourier equipado com o analisador de armadilha Kingdon modificado.</td></tr><tr><td>Deconvolução de proteínas 3.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td>Use a versão 3.0 ou superior com um modelo de padrão isotópico de nucleotídeo.</td></tr></tbody></table>

melhoria polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism genotipagem de pufferfish tóxico por cromatografia líquida / espectrometria de massa

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Uma versão melhorada de um método para a genotipagem de espécies tóxicas pufferfish por espectrometria de massa de cromatografia / ionização por electrospray líquida (LC / ESI-MS) de reacção em cadeia da polimerase (PCR) fragmento -restriction polimorfismo de comprimento (RFLP), está descrito. a extracção do ADN é realizada utilizando um estojo de extracção de ADN à base de membrana de sílica. Após a amplificação por PCR utilizando um tampão de PCR livre de detergente, as enzimas de restrição são adicionados à solução sem purificar a solução da reacção. Uma coluna de sílica monólito de fase inversa e uma transformação de Fourier espectrómetro de massa de alta resolução com um analisador de armadilha Kingdon modificada são utilizados para a separação e detecção, respectivamente. A fase móvel, que consiste em mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol 400, trietilamina 15 mM (pH 7,9) e metanol, é entregue a um caudal de 0,4 ml / min. O tempo de ciclo para a análise / ESI-MS LC é de 8 min incluindo equilíbrio da coluna. software Deconvolution ter um isótopo modelo de distribuição of o oligonucleótido é utilizado para calcular a massa monoisotópica correspondente do espectro de massa. Para a análise de oligonucleotídeos (variação de 26-79 nucleótidos), precisão de massa foi de 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) e excelente exatidão e precisão foram mantidas por 180 horas sem o uso de um padrão de massa de bloqueio.

Três colunas comercialmente disponíveis foram avaliados para a separação de oligonucleótidos longos a taxas de fluxo de 100-400 mL / min. Uma grande poro de octadecilo de cadeia de carbono (C 18) da coluna de partículas de sílica -bonded (a), um poli comercialmente disponível (estireno-divinilbenzeno) (PS-DVB) monólito coluna (b) e uma coluna de sílica monólito -bonded C 18 ( C) foram comparadas (Figura 1). Três pares de cadeias duplas de ADN (26, 37 e 53 pb) foram separados utilizando todas as colunas, e a sílica -bonded monólito coluna C 18 foi utilizado em estudos subsequentes. Os resultados representativos para a análise de uma amostra de ADN extraído a partir do músculo do T. rubripes é mostrado na Figura 2. isotopicamente picos resolvidos, como mostrado na figura 2a, são necessários para o cálculo com êxito a massa monoisotópica. O teórico e measured massa monoisotópico de T. rubripes são mostradas na Figura 2b. Uma vez que a digestão com as endonucleases é realizada apenas após amplificação por PCR, sem purificação, a extremidade 3&#39;-pegajoso gerado pelo Msp I endonuclease é preenchido com a polimerase de ADN restante. De acordo com a análise de produtos de amplificação derivados de moldes de ADN sintéticos, precisão de massa variou entre -2,48 a 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm em média, n = 280). Assim, uma tolerância de massa de 3 ppm foi utilizado para a diferenciação de espécies (Tabela 4). Usando a tabela, todas as amostras pufferfish obtidos de mercados e lojas foram devidamente diferenciados como espécies específicas 37. De acordo com a análise periódica da amostra obtida a partir do modelo de ADN sintético de T. chrysops, todas as massas monoisotópico dos analitos foram determinados com sucesso dentro de ± 3 ppm por pelo leAST 180 HR, sem qualquer calibração de massa (Figura 3). Isto significa que a calibração de massa seria necessário numa base semanal. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig1.jpg" /> Figura 1: Total de iões cromatogramas correntes do produto de PCR-RFLP derivado a partir do modelo de ADN sintetizada de T. pardalis utilizando uma coluna C 18 -bonded de partículas de sílica (a, 3 x 250 mm, dimensão das partículas 3 micrómetros), um poli (estireno-divinilbenzeno) (PS-DVB) coluna monólito (b, 1,0 × 250 mm) e um C 18 -bonded monólito coluna de sílica (C, presente método) Condições de (a):. velocidade de fluxo de 0,2 ml / min; proporção de metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Condições para (b):taxa de fluxo 0,1 ml / min; proporção de metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. A temperatura para ambas as colunas foi de 20 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig2.jpg" /> Figura 2: Os resultados representativos para a análise de músculo cru de T. rubripes. (a) íon total de cromatogramas atuais típicos e espectro de massa. (B) massas monoisotópico teóricas e medidas dos produtos de PCR-RFLP derivados a partir do modelo de ADN sintetizada de T. rubripes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver um grande</a>r Versão desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54402/54402fig3.jpg" /> Figura 3:. Teste de estabilidade digerido amplicões obtidos a partir do ADN sintético de T. Chrysops foram analisados ​​a cada 10 h. Calibração de massa não foi realizada durante o teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Seqüência </td></tr><tr><td> lago86F </td><td> 5&#39;-3&#39;-CCATGTGGAATGAAAACACC </td></tr><tr><td> taki114F </td><td> 5&#39;-3&#39;-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA </td></tr><tr><td> fugu86-114R </td><td> 5&#39;-3&#39;-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG </td></tr></tbody></table>Tabela 1: PCR primers. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reagentes da RCP </td><td> volume utilizado </td><td> A concentração final </td></tr><tr><td> água ultrapurificada </td><td> 15,75 mL </td><td></td></tr><tr><td> sem detergente 5x Tampão </td><td> 5,0 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> de mistura de dNTP (10 mM cada) </td><td> 0,5 ul </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> mistura de iniciadores (10 uM cada de lago86F, taki114F e fugu86-114R em tampão TE pH 8,0) </td><td> 1.0 ul </td><td> 0,4 uM cada </td></tr><tr><td> DNA polimerase (2,5 unidades / ul) </td><td> 0,25 mL </td><td> 0,1 unidades / ul </td></tr><tr><td> DNA molde em tampão de TE pH 8,0 (5,0-10 ng / pL de amostra extraída, 0,2 uM de ADN sintético como controlo positivo) </td><td> 2,5 ul </td><td> 0,5-1,0 ng / ul de ADN extraído e 20 nM para o ADN sintético </td></tr><tr><td></td><td> Total: 25 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 2: Componentes de uma escala de 25 ul de PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Ciclo </td><td> Condição </td><td> Função </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 min a 95 ° C </td><td> A desnaturação inicial </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 30 s a 95 ° C </td><td> desnaturação </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 30 s a 56 ° C </td><td> Recozimento </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 30 s a 72 ° C </td><td> Alongamento </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Repetir 2-4 (no total 30 ciclos) </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 7 min a 72 ° C </td><td> Alongamento final </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Manter a 12 ° C até à remoção da amostra </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 3: programa de PCR. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> número de pico no tempo de retenção de 4,0-5,5 min </td><td colspan="2"> massa monoisotópica de o terceiro pico na gama (Da) </td><td colspan="2"> massa monoisotópica do segundo pico na gama (Da) </td><td rowspan="2"> espécies Pufferfish </td></tr><tr><td> Strand menor </td><td> maior cadeia </td><td> Strand menor </td><td> maior cadeia </td></tr><tr><td rowspan="5"> 2 </td><td rowspan="5"> → </td><td rowspan="5"> → </td><td> 15890,707-15890,803 </td><td> 16177,531-16177,629 </td><td> L. inermis </td></tr><tr><td> 15921,702-15921,797 </td><td> 16146,537-16146,634 </td><td> L. gloveri </td></tr><tr><td> 15930,713-15930,809 </td><td> 16137,525-16137,622 </td><td> L. lunaris </td></tr><tr><td> 15937,697-15937,792 </td><td> 16131,537-16131,634 </td><td> L. wheeleri </td></tr><tr><td> 24173,034-24173,179 </td><td> 24566,905-24567,053 </td><td> T. chrysops </td></tr><tr><td rowspan="6"> 3 </td><td rowspan="2"> 16295,706-16295,804 </td><td rowspan="2"> 16467,610-16467,709 </td><td> 11341,851-11341,919 </td><td> 11466,875-11466,944 </td><td> T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus </td></tr><tr><td> 11654,908-11654,978 </td><td> 11770,920-11770,991 </td><td> T. niphobles </td></tr><tr><td> 16296,701-16296,799 </td><td> 16468,605-16468,704 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. rubripes </td></tr><tr><td> 16311,701-16311,799 </td><td> 16452,610-16452,709 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. poecilonotus T. exascurus </td></tr><tr><td> 16320,713-16320,811 </td><td> 16443,599-16443,697 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. porphyreus T. obscurus </td></tr><tr><td> 16599,751-16599,851 </td><td> 16780,667-16780,767 </td><td> → </td><td> → </td><td> T. vermicularis </td></tr></tbody></table> Tabela 4: A diferenciação de massas de pufferfish monoisotópico derivados de LC / ESI-MS. <img alt="tabela 5" src="/files/ftp_upload/54402/54402tbl5.jpg" /> Tabela 5: sequência de ADN amplificado (a) a sequência é idêntica a.a das outras espécies pufferfish, conforme descrito na Tabela 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402tbl5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.</a>

Um método de polimorfismo de fragmentos de reacção em cadeia da polimerase restrição melhorado para genotipagem espécies pufferfish por cromatografia / espectrometria de massa líquida é descrito. Uma coluna de sílica de fase inversa monólito é empregue para a separação de fragmentos amplificados digeridos. Este método pode elucidar as massas monoisotópico de oligonucleótidos, que é útil para identificar a composição de base.

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

O objetivo geral deste experimento é realizar uma genotipagem rápida e precisa de peixes-balão tóxicos mediante a análise de pequenos amplicons de PCR. A parte comestível do peixe-balão utilizada no preparo do prato varia conforme a espécie, e algumas espécies contêm toxinas em todo o corpo. Este músculo, o banco de dados, o masu, a barbatana e a pele natal do peixe-balão podem auxiliar na genotipagem do peixe-balão do ponto de vista da segurança alimentar total e para investigação.Para realizar a extração de DNA utilizando um kit, coloque inicialmente 30 a 50 miligramas de tecido de peixe em um tubo de microcentrífuga de 0,5 ou 1,5 mililitro. Esmague o tecido sem nadadeira e pele, utilizando uma microespátula. Adicione 180 microlitros do tampão de lise de tecido animal e 40 microlitros de proteinase K e vortexie brevemente.Incubar a 56 graus Celsius em um aquecedor de bloco por duas horas ou durante a noite. Centrifugar a amostra por cinco minutos a 13000×g. Após transferir o sobrenadante para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, adicionar 200 microlitros do tampão caotrópico contendo cloreto de guanidina do kit.Em seguida, adicione 200 microlitros de etanol 99,5% e misture por vortex. Transfira a mistura, incluindo qualquer precipitado, para a coluna de centrifugação colocada em um tubo de coleta de dois mililitros. Após centrifugação por um minuto a 13000×g, descarte o fluxo passante.Adicione 500 microlitros do tampão de lavagem um, contendo cloreto de guanidina do kit, e centrifugue como antes. Descarte o fluxo passante e o tubo de coleta. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de dois mililitros fornecido com o kit.Adicione 500 microlitros do tampão de lavagem dois e centrifugue por três minutos a 20.000×g. Após descartar o fluxo passante e o tubo de coleta, transfira a coluna de centrifugação para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Pipete 200 microlitros do tampão de eluição para o centro da membrana da coluna de centrifugação.Após um minuto, centrifugue por um minuto a 6000xg. Em seguida, pipete 50 microlitros da alueta para uma cubeta ultravioleta descartável. Meça o espectro ultravioleta da alueta entre 220 e 300 nanômetros e a absorbância em 260 nanômetros utilizando um espectrofotômetro.O uso de reagente livre de detergentes é essencial para o sucesso da cromatografia líquida, pois o reagente pode causar danos à coluna analítica. Trabalhando em uma bancada limpa para evitar contaminação, monte uma reação de PCR de 25 microlitros para cada amostra de DNA extraído, um controle positivo e um controle negativo, em gelo, conforme descrito no protocolo do texto. Para facilitar a operação, prepare uma quantidade suficiente de coquetel contendo todos os reagentes, exceto o DNA molde, e distribua-o.Utilize uma DNA polimerase com atividade de revisão para evitar a adição de saliências adeninas em três primas aos produtos de PCR. Realize a amplificação por PCR em um termociclador utilizando o programa de ciclagem descrito no protocolo textual. Para realizar a digestão enzimática, adicione dois microlitros do tampão de digestão enzimática à solução de PCR.Adicione um microlitro de cada enzima de restrição e misture suavemente. Incube a amostra por 30 minutos a 37 graus Celsius no ciclador térmico, seguido por cinco minutos a 72 graus Celsius. Filtre a solução da reação com um dispositivo de filtração centrífuga de 0,2 a 0,5 mícron para prevenir entupimentos e evitar danos à coluna analítica.Transfira o filtrado para um vial cônico de polipropileno e armazene a 20 graus Celsius até a análise. Prepare uma solução de hexafluoroisopropanol e trietilamina em um frasco de um litro conforme descrito no protocolo do texto. Conecte o frasco à linha A do instrumento de cromatografia líquida, resfriando o frasco com um refrigerador portátil de resfriamento direto para evitar a vaporização.Conecte outro frasco cheio com metanol à linha B. Conecte a coluna de proteção e a coluna analítica ao instrumento. Inicie o fluxo da fase móvel inicial para equilibrar as colunas. Se você estiver usando um espectrômetro de massas sem software para controlar a pressão do C-Trap, será necessário reduzir a pressão do C-Trap manualmente, ajustando a válvula.Para fazer isso, puxe o botão para destravar e gire o botão no sentido anti-horário muito lentamente para reduzir a pressão de vácuo alto a 1/3. A pressão indicada deve mudar gradualmente de forma atrasada. Ignore a mensagem de aviso sobre baixa pressão.Empurre o botão para travar. Após configurar a calibração, conforme descrito no protocolo textual, mova a sonda de ionização por eletrospray aquecida mais próxima à interface do espectrômetro de massas na posição B. Conecte a sonda e uma seringa com um tubo. Infunda o calibrador constantemente a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por minuto utilizando a bomba de seringa embutida.Verifique apenas os seis íons de massa mais baixa na tabela de calibração personalizada. Prossiga com a calibração após a estabilização da intensidade dos sinais. Após a calibração, verifique apenas os seis íons de massa mais alta e prossiga com a calibração.Evite calibrar utilizando todos os íons de uma vez para evitar falhas. Mova a sonda para a posição D para obter uma vazão de 0,4 mililitros por minuto e conecte ao instrumento com um tubo de metal inerte. Após configurar os parâmetros conforme descrito no protocolo do texto, remova as bolhas batendo na base dos frascos. Coloque os frascos da amostra no suporte de amostras e injete um microlitro de uma amostra utilizando o amostrador automático para iniciar a análise. Abra os arquivos de dados brutos com um software navegador e confirme que todas as aquisições foram concluídas com sucesso, incluindo os controles positivo e negativo. Configure um método conforme descrito no protocolo textual e, em seguida, clique no botão executar na guia fila de execução para iniciar o software de desconvolução.Após a conclusão da sequência, selecione uma linha e clique em abrir resultado na legenda superior para obter os resultados da desconvolução. Abaixo, há um cromatograma típico de corrente iônica total obtido a partir de uma amostra controle negativo e de um peixe-balão. Cada pico representa um duplex de DNA separado com base em seu comprimento.Neste exemplo, são observados três picos da amostra de peixe-balão. Esses picos são os resultados da digestão do amplicon utilizando duas endonucleases. Nenhum pico é observado na amostra controle negativa.Cada pico representa um espectro de massa que compreende íons com múltiplas cargas. Ampliar o espectro de massa permite que dezenas de picos resolvidos isotopicamente sejam notáveis. Essa resolução é um requisito para determinar a massa mono-isotópica e só é viável por meio de um espectrômetro de massas de alta resolução.Neste exemplo, as massas monoisotópicas do terceiro pico são 16296,7656 e 16468,6616 Daltons. Considerando uma tolerância de massa de três ppm, os valores medidos são idênticos aos valores teóricos de takifugu rubripes, conforme mostrado aqui. Após dominada, esta técnica pode ser realizada em um dia utilizando instrumentos e aparelhos comuns.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar pequenos amplicons por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas de alta resolução para genotipagem. A técnica pode ser aplicada na análise de outras polimorfismos de DNA, desde que a variação de sequência esteja refletida nos pequenos amplicons a serem analisados. No entanto, esta técnica identifica apenas as composições de bases; substituições de bases dentro do mesmo mercúrio não podem ser distinguidas.

improved-polymerase-chain-reaction-restriction-fragment-length

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Esta publicação descreve como usar o Peixe Agilent Sistema de Identificação de Espécies para identificar as espécies de peixe através da extração de DNA e realização de PCR e análise de RFLP.

Baseados em DNA Peixe Protocolo Identificação de Espécies

Fonte: Gulla, S., et al. Análise em Tandem-Repetição Multi-locus da Bactéria Yersinia ruckeri com patígenos de peixes por PCR multiplex e eletroforese capilar. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o procedimento para separar amplificações de repetição em tandem de número variável marcadas fluorescentemente (VNTR), derivadas de uma bactéria patogênica de peixes, usando eletroforese capilar para gerar perfis eletroferográficos específicos de tamanho para identificação bacteriana.

Detecção de patógenos de peixes usando análise de repetição em tandem de número variável (VNTR)

Este vídeo descreve a técnica de eletroforese capilar para analisar amplicons de PCR marcados com fluorescência obtidos de várias amostras com base em seu tamanho. Ele gera um padrão migratório que determina os comprimentos dos pares de bases dos fragmentos com a ajuda do corante fluorescente marcado em cada fragmento.

Eletroforese capilar: uma técnica para analisar amplicons de reação em cadeia da polimerase marcados com fluorescência

PCR combinada com a análise de fusão de alta resolução (HRMA) é demonstrado como um método rápido e eficiente para a genotipagem de peixe-zebra.

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Uma técnica para estimativa de laboratório da rede trófica eficiência de transferência de bifenil policlorados (PCB) congêneres de peixes piscívoros de suas presas é apresentado. Para maximizar a aplicabilidade dos resultados do laboratório para o campo, o piscívoro deve ser alimentado presa peixe que são tipicamente consumidos no campo.

Estimativa Laboratório de Líquido tróficas eficiências de transferência de PCB para Lake Trout (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) De sua rapina

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

Análises de conteúdo de intestino mais comuns de macroinvertebrados são visuais. Exigindo intenso conhecimento sobre diversidade morfológica de organismos de presas, eles falta suave rapina encorpada e, devido à forte cominuição de rapina, são quase impossíveis para alguns organismos, incluindo anfípodes. Nós fornecemos abordagens genéticas detalhadas, a novela de macroinvertebrados presas identificação na dieta de anfípodes.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Zebrafish têm sido usados como organismos modelo genético confiável na investigação biomédica, especialmente com o advento das tecnologias de edição de gene. Quando os fenótipos larvas são esperados, identificação de DNA de extração e genótipo pode ser desafiador. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente de genotipagem para larvas de peixe-zebra, por cauda de recorte, tão cedo quanto pós-fertilização 72-h.

Extração de DNA do elevado-throughput e genotipagem de larvas de Zebrafish 3dpf por Fin recorte

O ensaio de análise em tandem-repetição de número variável multi-Locus (MLVA) apresentado aqui permite a genotipagem de alta resolução barata, robusta e portátil da bactéria patogênica Yersinia ruckeri. Partindo das culturas puras, o ensaio emprega o PCR multiplex e a electroforese capilar para produzir os perfis do MLVA do dez-loci para aplicações a jusante.

Multi-Locus variável-número tandem-repita a análise do peixe-patogénico bactéria Yersinia ruckeri pela PCR multiplex e pela electroforese capilar

O crescimento de culturas bacterianas radiolabeled em pratos do de microtitulação facilita a amostragem elevada da taxa de transferência que permite testes técnicos e biológicos múltiplos da repetição da abundância da associação do nucleotide, incluindo aquele de (p) ppgpp. Os efeitos das transições de crescimento provocados por fontes de estresse fisiológico, bem como a recuperação do estresse podem ser monitorados.

Usando microtiter prato Radiolabeling para múltiplo in vivo medições de Escherichia coli (p) ppGpp seguido por cromatografia em camada fina

Desenvolvemos um método QuEChERS-HPLC modificado para avaliar os níveis internos de 16 PAHs em embriões de peixe-zebra.

Um método QuEChERS-HPLC modificado para detecção de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em embriões de peixe-zebra expostos a partículas finas

Aprenda genotipagem de peixes-baiacu tóxicos por PCR-RFLP combinado com cromatografia líquida e espectrometria de massa. Este método utiliza coluna monolítica de sílica para separação eficiente de amplicons digeridos.

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

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