Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

O objetivo geral deste experimento é realizar uma genotipagem rápida e precisa de baiacu tóxico por meio da análise de pequenos amplicons de PCR. A parte comestível do baiacu que é usada para preparar o prato de baiacu varia de acordo com sua espécie e algumas das espécies contêm toxinas em todo o corpo. Este músculo o banco de dados e masu e barbatana e pele de nascimento de baiacu pode ajudar na genotipagem de baiacu do ponto de vista de alimentos de segurança total para todos e para investigação.

Para realizar a extração de DNA usando um kit, coloque primeiro 30 a 50 miligramas de tecido de peixe em um tubo de microcentrífuga de 0,5 ou 1,5 mililitro. Esmague o tecido sem barbatana e pele, usando uma microespátula. Adicione 180 microlitros do tampão de lise do tecido animal e 40 microlitros de proteinase k e vórtice brevemente.

Incube a 56 graus Celsius em um aquecedor de bloco por duas horas ou durante a noite. Centrifugue a amostra por cinco minutos a 13000xg. Depois de transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, adicione 200 microlitros do tampão caotrópico contendo cloridrato de guanidina do kit.

Em seguida, adicione 200 microlitros de etanol 99,5% e misture por vórtice. Transferir a mistura, incluindo o precipitado, para a coluna de centrifugação colocada num tubo de recolha de dois mililitros. Após centrifugar por um minuto a 13000xg, descarte o fluxo.

Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem um, contendo cloridrato de guanidina do kit, e centrifugue como antes. Descarte o fluxo e o tubo de coleta. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de coleta de dois mililitros fornecido com o kit.

Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem dois e centrifugue por três minutos a 20.000xg. Depois de descartar o fluxo e o tubo de coleta, transfira a coluna de centrifugação para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Pipetar 200 microlitros do tampão de eluição para o centro da membrana da coluna de centrifugação.

Após um minuto, centrifugue por um minuto a 6000xg. Em seguida, pipete 50 microlitros do aluette para uma cubeta ultravioleta descartável. Medir o espectro ultravioleta do aluette em 220 a 300 nanómetros e a absorbância em 260 nanómetros utilizando um espectrofotómetro.

O uso de reagente sem detergente é fundamental para o sucesso da cromatografia líquida porque o reagente causa possíveis danos à coluna analítica. Trabalhando em uma bancada limpa para evitar contaminação, configure um PCR de 25 microlitros para cada amostra de DNA extraída, um controle positivo e um controle negativo, no gelo, conforme descrito no protocolo de texto. Para facilitar a operação, faça uma quantidade suficiente de coquetel contendo todos os reagentes sem DNA molde e dispense-o.

Use a DNA polimerase com atividade de revisão para evitar a adição de três saliências de adenina primária ao produto de PCR. Realize a amplificação por PCR em um termociclador usando o programa de ciclo mostrado no protocolo de texto. Para realizar a digestão enzimática, adicione dois microlitros do tampão de digestão enzimática à solução de PCR.

Adicione um microlitro de cada enzima de restrição e misture delicadamente. Incubar a amostra por 30 minutos a 37 graus Celsius no termociclador, seguido de cinco minutos a 72 graus Celsius. Filtre a solução de reação com um dispositivo de filtro centrífugo de 0,2 a 0,5 mícron para evitar entupimento e evitar danos à coluna analítica.

Transferir o filtrado para um frasco cónico de polipropileno e conservar a 20 graus Celsius até à análise. Prepare uma solução de hexafluoroisopropanol e trietilamina em um frasco de um litro, conforme descrito no protocolo de texto. Conecte o frasco à linha A do instrumento de cromatografia líquida, resfriando o frasco usando um refrigerador portátil de resfriamento direto para evitar a vaporização.

Conecte outro frasco cheio de metanol à linha B.Conecte a coluna de proteção e a coluna analítica ao instrumento. Comece a fluir a fase móvel inicial para equilibrar as colunas. Se você estiver usando um espectrômetro de massa sem software para controlar a pressão do C-Trap, você deve reduzir a pressão do C-Trap controlando manualmente a barra.

Para fazer isso, puxe o botão para destravar e gire o botão no sentido anti-horário muito lentamente para reduzir a pressão de alto vácuo para 1/3. A pressão indicada deve mudar gradualmente de forma retardada. Ignore a mensagem de aviso sobre baixa pressão.

Empurre o botão para travar. Após configurar a calibração, conforme descrito no protocolo de texto, mova a sonda de ionização por eletrospray aquecida para mais perto da interface do espectrômetro de massa na posição B. Conecte à sonda e a uma seringa com um tubo. Infundir o calibrante constantemente a uma vazão de 10 microlitros por minuto usando a bomba de seringa embutida.

Verifique apenas os seis íons de massa mais baixa na tabela de calibração personalizada. Prossiga com a calibração depois que a intensidade dos sinais estiver estabilizada. Após a calibração, verifique apenas os seis íons de massa mais alta e prossiga com a calibração.

Evite calibrar usando todos os íons de uma só vez para evitar falhas. Mova a sonda para a posição D para uma vazão de 0,4 mililitros por minuto e conecte ao instrumento com um tubo de metal inerte. Depois de configurar os parâmetros conforme descrito no protocolo de texto, limpe as bolhas tocando no fundo dos frascos.

Coloque os frascos de amostra no suporte de amostras e injete um microlitro de uma amostra usando o amostrador automático para iniciar a análise. Abra os arquivos de dados brutos com um software de navegador e confirme se todas as aquisições foram concluídas com sucesso, incluindo os controles positivo e negativo. Configure um método conforme descrito no protocolo de texto e clique no botão executar na guia run cue para iniciar o software de deconvolução.

Depois que a sugestão for concluída, selecione uma linha e clique em abrir resultado na legenda superior para obter os resultados da deconvolução. Aqui está um cromatograma típico de corrente de íons totais obtido de um controle negativo e uma amostra de baiacu. Cada pico representa um duplex de DNA que é separado com base em seu comprimento.

Neste exemplo, três picos da amostra de baiacu são observados. Esses picos são os resultados da digestão do amplicon usando duas endonucleases. Não são observados picos na amostra de controlo negativo.

Cada pico representa um espectro de massa que compreende íons carregados multiplicados. A ampliação do espectro de massa permite que dezenas de picos resolvidos isotopicamente sejam perceptíveis. Esta resolução é um requisito para determinar a massa monoisotópica e só é viável através de um espectrómetro de massa de alta resolução.

Neste exemplo, as massas monoisotópicas do terceiro pico são 16296.7656 e 16468.6616 Daltons. Considerando uma tolerância de massa de três ppm, os valores medidos são idênticos aos valores teóricos de takifugu rubripes, conforme mostrado aqui. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia usando instrumentos e aparelhos comuns.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar pequenos amplicons por cromatografia líquida espectrometria de massa de alta resolução para genotipagem. A técnica pode ser aplicada na análise de outros polimorfismos de DNA, desde que a variação da sequência seja refletida nos pequenos amplicons a serem analisados. No entanto, esta técnica identifica apenas composições de base, a substituição de base dentro do mesmo produto não pode ser distinguida.