Name: Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a técnica AFLIP para detectar receptores de fatores de crescimento de baixa abundância em embriões de zebrafish. Este método combina marcação por afinidade com imunoprecipitação para estudos de biologia do desenvolvimento.

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Os autores agradecem a Gilberto Morales pelo cuidado e manutenção dos peixes, e aos Drs. Claudia Rivera e Hector Malagòn (IFC-UNAM Animal Facility) por sua ajuda na imunização de coelhos. Este trabalho foi apoiado por doações da CONACYT 131226 e PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

Todos os experimentos realizados em animais foram aprovados pelo Comitê de Laboratório Animal Care e Use da Universidade Nacional Autônoma do México (UNAM), sob o número CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: &quot;Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México&quot;). 1. Preparação do extracto do embrião Proteína <ol><li> Colete 100 - 200 embriões para cada condição para comparar (morphants vs. tipo selvagem) no estágio desejado, por exemplo 72 horas após a fertilização (hpf). </li><li> Embriões lugar em placas de Petri contendo água de peixe (ver Tabela 1) e dechorionate manualmente embriões usando uma pinça de ponta fina. Evitar o uso de pronase durante este passo (ou qualquer outra protease ao longo do protocolo), uma vez que podem digerir o receptor alvo. </li><li> embriões lugar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e lavar embriões twgelo com uma solução de tampão de fosfato de 1x (PBS) (ver Tabela 1). </li><li> Adicionar 500 ul de tampão deyolk (ver Tabela 1). </li><li> Liberar mais de gema de cuidado pipetando para cima e para baixo (cerca de 30 - 40 vezes) os embriões na solução. Para 72 hpf e 48 embriões HPF usar azul e amarelo pontas de pipeta, respectivamente. pontas amarelas pode precisar de ser ligeiramente cortada para evitar a destruição de embriões. O lançamento gema de sucesso pode ser verificado observando-se os embriões sob o microscópio. </li><li> Recolhe embriões por centrifugação a 600 xg durante 15 seg. </li><li> Elimine o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta. </li><li> Embriões lavar duas vezes com 500 ul de tampão de lavagem (ver Tabela 1) por vortex suavemente na velocidade mais baixa. </li><li> Recolhe embriões por centrifugação a 600 xg durante 15 seg. </li><li> A partir daqui, o processo continua a 4 ° C. </li><li> Elimine o sobrenadante cuidadosamente, usando uma pipeta. </li><li> Ressuspender embriões em 350 ul de tampão de lise (ver Tabela 1) e homogeneizar utilizando um pilão de plástico. </li><li> Incubar embriões lisadas 30 min, com agitação num agitador tubo de ensaio a 4 ° C. </li><li> Centrifugar embriões lisadas a 11000 xg durante 15 minutos a fim de remover os detritos insolúveis. </li><li> Transferência afastada sobrenadante utilizando uma pipeta para um tubo fresco. </li><li> Determinar a proteína total pelo ensaio de proteína de Bradford 4, ou outro procedimento adequado. Se ensaio de Bradford é utilizado, realizar a curva de calibração na presença de concentrações equivalentes dos detergentes presentes no tampão de lise, uma vez que causam uma subestimação da proteína padrão 4. </li></ol> 2. Detecção da proteína endógena do Receptor <ol><li> Affinity Labeling e Immunoprecipitation (todos estes passos, a 4 ° C) <ol><li> Coloque 400-500 ug de proteína total de embriões num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e diluir até 1 ug / uL com tampão 1 (ver Tabela 1). Nota: A fim de obter 500 mg de proteína embrião total, cerca de 100-200 embriões devem ser inicialmente processado. 72 hpf embriões rotineiramente obter ~ 5 ^ g de proteína total de embrião, o qual é suficiente para a detecção betaglicano. </li><li> Adicionar um volume suficiente de estoque de TGF-β2 marcado para atingir uma concentração final de 150 pM e incubar com agitação em um tubo de ensaio balancim 2 h a 4 ° C. TGF-β2 deve ser marcado antes AFLIP é iniciado, com 125 I pelo método da cloramina T como descrito por Cheifetz et ai. 5. CUIDADO: O uso de blindagem para minimizar a exposição ao manusear 125 I ligando marcado. </li><li> Adicionar um volume suficiente de anticorpo não diluído contra o receptor de interesse, a fim de chegar a uma diluição de 1: 100 e continuar a incubação durante mais 2 horas a 4 ° C (de incubação pode ser O / N). Esta é a diluição óptima de anti-soro # 31, utilizado neste estudo e descrito noutro local 3, mas, dependendo da qualidade do umtibody, uma diluição maior ou menor pode ser a ideal. </li><li> Adicionar 50 ul de pérolas de ligação de imunoglobulina adequada (por exemplo, a proteína G-Sepharose &#39;, que foi previamente equilibrada em TNTE e ressuspensas 1: 5 do seu volume original em TNTE) e incubar durante 50 minutos com agitação num agitador tubo de ensaio a 4 ° C. </li><li> Recuperar os grânulos por microcentrifugação a 11000 xg durante 20 seg. </li><li> Elimine o sobrenadante em um recipiente de lixo radioactivo apropriado. </li><li> Lavam-se as esferas de IP-se três vezes com 1 ml de tampão de lavagem de IP (ver Tabela 1), por agitação em vórtice e microcentrifugação a 11000 xg durante 20 seg de cada vez. </li><li> Ressuspender IP-grânulos em 250 ul de tampão de lavagem IP. </li><li> Adicionar 1,5 uL de suberato de dissuccinimidilo (DSS, dissolvido em DMSO a 10 mg / ml). Preparar a solução de DSS imediatamente antes da sua utilização neste passo. </li><li> Incubar durante 15 min a 4 ° C com agitação. </li><li> A fim de parar a reacção de reticulação, adicionar 500 ul Otampão de lavagem f IP, suplementado com suficiente de Tris-Cl pH 7,4 estoque para atingir 25 mM de Tris-Cl. Os grupos amino livres em Tris capturar DSS que não reagiu. </li><li> Centrifuga-se a 11000 xg durante 20 seg para recolher IP-grânulos e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender IP-esferas em 30 ul de tampão redutor de Laemmli. </li><li> Ferver as amostras 5 min a 94 ° C. </li><li> Opcionalmente, analisar amostras em um contador gama usando o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Análise de amostras <ol><li> amostras submetido a uma desnaturação SDS-PAGE. Use poliacrilamida na percentagem adequada para a massa do receptor e executar gel sob procedimento padrão. </li><li> Mergulhar em gel de solução fixadora (ver Tabela 1) durante 30 min à TA. </li><li> Lavar o gel com água destilada durante 15 min. </li><li> Coloque gel em papel de filtro previamente hidratado e cubra com filme de envolvimento Saran. </li><li> gel seco a 80 ° C durante 1 h. </li><li> Expor gel em um scre phosphorimager brancoen à TA S / N. </li><li> Digitalizar tela exposta usando um phosphorimager usando o protocolo do fabricante. </li></ol></li></ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
<li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O uso de transferências de Western com um anticorpo específico contra uma proteína de interesse é uma ferramenta valiosa para estudar a sua expressão 7 durante a embriogénese. No entanto, immunoblotting de proteínas altamente glicosiladas não tem sido muito bem sucedida, devido à sua transferência ineficiente e de ligação fraca para nitrocelulose ou PVDF membranas 8,9. Proteoglicanos são um bom exemplo desta lacuna, por causa de suas cadeias de glicosaminoglicanos (GAG ...

A detecção específica de proteínas expressas durante o desenvolvimento embrionário é necessária para validar os perfis de expressão obtidos pela medição de seus mRNAs cognatos com RT-PCR ou hibridização in situ (ISH). Isso é comumente alcançado por um western blot de extratos de embriões seguido pela detecção com anticorpos específicos. No entanto, essa abordagem é difícil de aplicar a proteínas que estão em abundância muito baixa ou que possuem propriedades que dificultam sua transferência quantitativa durante o blotting. O betaglicano, também conhecido como receptor β do fator de crescimento transformador tipo III (TGF-β) (TGFBR3), é um exemplo dessas dificuldades. O TGFBR3 é um proteoglicano de membrana em tempo parcial que se liga ao TGF-β através de sua proteína central1, com afinidade notavelmente maior pela isoforma TGF-β2, uma propriedade que o distingue de qualquer outra proteína2 de ligação ao TGF-β. O TGFBR3 no peixe-zebra é expresso a partir de 8 hpf, atingindo um máximo de 72 hpf, conforme detectado por RT-PCR de seu mRNA3. 
No entanto, apesar da disponibilidade de umanticorpo 3 muito específico, todas as tentativas de detectar seu produto traduzido por western blot não tiveram sucesso. Reconhecendo que a natureza proteoglicana do TGFBR3, bem como a suposta baixa abundância, podem ser responsáveis por essa falha, foi desenvolvido um método de detecção, AFLIP, que aproveita a alta afinidade do TGFBR3 pelo TGF-β2. Neste método, um extrato de proteína de embriões agrupados pode se ligar especificamente ao TGF-β2 marcado com 125I e os complexos receptor-ligante são purificados por imunoprecipitação e reticulados antes da separação por SDS-PAGE. Os padrões de migração observados pela autorradiografia dos géis revelaram a presença e a natureza das espécies receptoras marcadas. Essa abordagem combina a especificidade do ligante da marcação de afinidade com a imunoprecipitação por anticorpos específicos, aumentando o alcance de detecção, evitando o ineficiente blotting de transferência de TGFBR3. Devido às suas propriedades inerentes, o ensaio AFLIP não é um ensaio quantitativo, mas pode ser usado para avaliar com segurança as diferenças experimentais relativas no receptor analisado.

<table><tbody><tr><td>Suberato de disuccinimidil (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G Sepharose 4</td> Fast Flow <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Secador de Gel Modelo 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Tufão 9400</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Auto gamma counter</td><td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exposure Cassette</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. Baker</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Sea Marine Mix</td><td>Marine Enterprises International</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

afinidade detecção de etiquetagem endógena receptores de embriões zebrafish

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Ao combinar os poderes da afinidade Labeling e da Immunoprecipitation (AFLIP), foi implementada uma técnica para a detecção de receptores de baixa abundância em embriões de peixe-zebra. Essa técnica aproveita a seletividade e a sensibilidade conferidas pela marcação de afinidade de um determinado receptor por seu ligante com a especificidade da imunoprecipitação. Usamos o AFLIP para detectar o receptor TGF-β tipo III (TGFBR3), também conhecido como betaglicano, durante o desenvolvimento inicial do peixe-zebra. O AFLIP foi fundamental na validação da eficácia de um fenótipo de peixe-zebra do morfo TGFBR3. Na primeira etapa, extratos de proteínas embrionárias são preparados e usados para gerar 125complexos I-TGF-β2-TGFBR3 que são purificados por imunoprecipitação. Posteriormente, esses complexos são reticulados covalentemente e revelados usando separação SDS-PAGE e detecção de autorradiografia. Esta técnica requer a disponibilidade de um ligante marcado e de um anticorpo específico contra o receptor a ser detectado e deve ser facilmente adaptada para identificar qualquer fator de crescimento ou receptor de citocina que atenda a esses requisitos.

A Figura 1 mostra um resultado representativo obtido com AFLIP. Os sinais nas faixas 1 vêm do 125I-ligando ligado de forma covalente, quer a proteína de peixe-zebra betaglicano núcleo (núcleo BG, abaixo da kDa marcador 150) ou o núcleo BG que foi processado para a sua forma de proteoglicanos por ligação de glicosaminoglicanos (GAG, esfregaço variando de 170 kDa para a parte superior do gel). Este padrão de migração, uma proteína núcleo afiado mais um proteogli...

Uma nova técnica para a detecção de receptores endógenos de baixa abundância presentes em embriões de peixe-zebra é descrita. Nós o chamamos de AFLIP porque consiste na marcação de afinidade do receptor por seu ligante ligado à imunoprecipitação.

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar receptores de fatores de crescimento de baixa abundância em embriões de peixe-zebra, combinando a seletividade e a sensibilidade da marcação por afinidade do receptor escolhido por seu ligante radioativo. Este método pode ajudar a responder perguntas em áreas da biologia do desenvolvimento, como níveis de expressão dos receptores e suas propriedades bioquímicas. Este método, que apelidamos de AFLIP, amplia as qualidades descritivas poderosas da marcação por afinidade, uma técnica bem estabelecida em biologia celular, para estudos do desenvolvimento em peixe-zebra.Para iniciar este procedimento, colete 100 a 200 embriões para cada condição e coloque-os em placas de Petri contendo água para peixes. Em seguida, descorionate manualmente os embriões usando pinças de ponta fina e evite usar pronase ou qualquer outra protease durante todo o protocolo, pois isso pode digerir os receptores-alvo. A seguir, coloque os embriões em um tubo microfuge de 1,5 mililitro e lave-os duas vezes com PBS 1X.Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão desovulante. Libere a maior parte da gema pipetando suavemente os embriões na solução para cima e para baixo cerca de 30 a 40 vezes. Para embriões de 72 HPF e 48 HPF, utilize ponteiras de pipeta azuis e amarelas, respectivamente.Pontas amarelas podem precisar ser levemente cortadas para evitar a destruição dos embriões. A liberação bem-sucedida da gema pode ser verificada observando os embriões ao microscópio. A remoção da gema deve ser a mais completa possível, pois lipídios e proteínas da gema podem interferir nas etapas subsequentes de ligação de ligantes ou anticorpos.Em seguida, colete os embriões por centrifugação a 600 x g durante 15 segundos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta. A seguir, lave os embriões duas vezes com 500 microlitros de tampão de lavagem, agitando suavemente em vórtex na velocidade mais baixa.Em seguida, colete os embriões por centrifugação a 600 x g durante 15 segundos. A partir deste ponto, continue o procedimento a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante cuidadosamente usando uma pipeta.Posteriormente, suspendemos os embriões em 350 microlitros de tampão de lise e os homogeneizamos usando um pistilo de plástico. Em seguida, incubamos os embriões lisados por 30 minutos com agitação em um agitador de tubos de ensaio a quatro graus Celsius. A seguir, centrifugamos os embriões lisados a 11.000 × g por 15 minutos para remover os detritos insolúveis.Em seguida, transfira o sobrenadante clarificado para um tubo novo. Determine a proteína total pelo ensaio de proteína de Bradford e trace a curva de calibração. Nesta etapa, coloque de 400 a 500 microgramas de proteína total de embrião em um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro e dilua-o para um micrograma por microlitro com o tampão 1.Em seguida, adicione o padrão de TGF-beta II marcado com Iodo-125 para atingir uma concentração final de 150 picomolar e incube com agitação em um agitador de tubos de ensaio por duas horas a quatro graus Celsius. Depois disso, adicione o anticorpo não diluído contra o receptor de interesse para obter uma diluição de 1:100. Em seguida, continue a incubação a quatro graus Celsius por mais duas horas ou durante a noite.Após a incubação, adicione 50 microlitros de microesferas apropriadas de ligação à imunoglobulina e incube por 50 minutos com agitação em agitador de tubos a quatro graus Celsius. Em seguida, recupere as microesferas por microcentrifugação a 11.000 × g durante 20 segundos e descarte o sobrenadante em um recipiente apropriado para resíduos radioativos. Posteriormente, lave as microesferas de IP três vezes com um mililitro de tampão de lavagem de IP, agitando em vórtex e realizando microcentrifugação a 11.000 × g por 20 segundos a cada vez.Em seguida, ressuspenda as microesferas de IP em 250 microlitros de tampão de lavagem de IP. Prepare uma solução fresca de DSS e adicione 1,5 microlitro dela à amostra. Após isso, incube a amostra por 15 minutos a quatro graus Celsius com agitação.Para interromper a reação de reticulação, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem de IP suplementado com quantidade suficiente de solução estoque de cloreto de tryst em pH 7,4 para atingir 25 milimolar de cloreto de tryst. Em seguida, centrifugue a 11,00 ×g por 20 segundos para recolher as microesferas de IP. Depois disso, descarte o sobrenadante e ressuspenda as microesferas de IP em 30 microlitros de tampão laemmli redutor.Em seguida, ferva a amostra a 94 graus Celsius por cinco minutos antes da eletroforese em gel de SDS-PAGE e, então, analise os géis secos em um fosforímetro ou por autoradiografia convencional. Esta figura mostra os resultados representativos obtidos com AFLIP. Proteínas totais extraídas dos embriões aos 72 hpf e 48 hpf foram submetidas à marcação por afinidade com TGF-beta II iodado-125, seguida de IP com anticorpo de coelho anti-zebrafish BG ou anticorpo de coelho anti-rato BG como controle.Na auto-radiografia, o BG pode ser detectado sem GAG ou como um BG modificado por glicosaminoglicano. Esta figura mostra como o AFLIP pode ser usado para avaliar os níveis de expressão de um determinado receptor em embriões submetidos a uma manipulação experimental, neste caso, a redução do betaglicano pela injeção de morfolino. A linha um mostra o nível do receptor TGF beta III em um embrião selvagem de 72 hpf, enquanto a linha dois mostra o efeito da administração de sete nanogramas de um morfolino direcionado à junção do éxon 2 com o íntron 2 do transcrito primário ZFPG. Observe que a redução da expressão do BG obtida com este morfolino não é reproduzida pelo seu controle desemparelhado.Esses resultados confirmaram que o fenótipo obtido com este morpholino era específico para a inibição do receptor III da TGF beta, conforme descrito anteriormente. O sucesso do AFLIP na detecção de receptores de fatores de crescimento ou citocinas depende da disponibilidade de um ligante radiomarcado que possa se ligar e ser reticulado ao seu receptor. Também é necessário um bom anticorpo para imunoprecipitação.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, se executada corretamente. Como a AFLIP evita a etapa de transferência do western blot, permite uma detecção aprimorada de receptores altamente glicosilados. E observamos aqui o proteoglicano betaglicano, que é transferido de maneira muito ineficiente no western blot. Após este procedimento, outros métodos, como digestão enzimática, podem ser realizados para descrever modificações pós-traducionais adicionais, desde que sejam reveladas por técnicas eletroforéticas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como a AFLIP pode ajudá-lo a detectar receptores pouco abundantes em vários embriões de peixe por meio de marcação por afinidade associada à imunoprecipitação. Por fim, não se esqueça de que o trabalho com iodo-125 deve ser feito com cuidado e proteção adequada. Boa sorte em seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Chave para a compreensão dos processos morfogenéticos que forma o embrião precoce é a capacidade de células de imagem em alta resolução. Descrevemos aqui uma técnica para a rotulagem células isoladas ou pequenos aglomerados de células em embriões de peixe-zebra inteira com membrana-alvo Proteína Fluorescente Verde.

Rotulagem e Células de imagem no rombencéfalo Zebrafish

Este protocolo delineia uma forma de rótulo e traçar o destino de pequenos grupos de células de embriões zebrafish utilizando UV-uncaging de fluoresceína enjaulado, seguido por montar todo imunomarcação para amplificar o sinal da fluoresceína uncaged.

Rotulagem de linhagem de células Zebrafish com Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

Este vídeo demonstra um ensaio de captação de anticorpos para obter imagens da sinalização Notch/DeltaD em progenitores da glia radial do peixe-zebra. Envolve a montagem de embriões de peixe-zebra descorionados embebidos em agarose, a injeção de uma solução de corante direcionada a ligantes DeltaD em RGPs e imagens sob um microscópio de fluorescência para divisão celular assimétrica, confirmando a ativação da sinalização Notch / DeltaD.

Um ensaio de captação de anticorpos para sinalização de entalhe / DeltaD de imagem em progenitores de glia radial de peixe-zebra

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Este protocolo descreve como obter imagens combinando hibridização in situ e imunohistoquímica de cortes embrionários de zebrafish. A hibridização in situ foi realizada antes da criossecção, seguida da coloração de anticorpos. É útil detectar os padrões de expressão de dois genes em peixes-zebra se houver escassez de anticorpos.

In situ Hibridização Combinada com Imunohistoquímica em Embriões de Zebrafish Crioseccionados

Este trabalho desenvolve um ensaio de captação de anticorpos para obtenção de imagens da sinalização Notch/DeltaD intra-linhagem na divisão de progenitores radiais da glia do cérebro embrionário do peixe-zebra.

Ensaio de Captação de Anticorpos para Rastreamento de Endocitose Notch/Delta Durante a Divisão Assimétrica de Progenitores da Glia Radial de Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para marcar proteínas com uma etiqueta de proteína de fluorescência em larvas de peixe-zebra, um sistema in vivo recém-desenvolvido e modificado especialmente útil para visualizar proteínas de baixa abundância em peixe-zebra.

Marcação de fluorescência para visualizar proteínas de baixa expressão em peixe-zebra

Aprenda a técnica AFLIP para detectar receptores de fatores de crescimento de baixa abundância em embriões de zebrafish. Este método combina marcação por afinidade com imunoprecipitação para estudos de biologia do desenvolvimento.

Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

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