Afinidade Detecção de Etiquetagem endógena Receptores de embriões Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é detectar receptores de fator de crescimento de baixa abundância em embriões de peixe-zebra, combinando a seletividade e a sensibilidade da marcação de afinidade do receptor escolhido por seu ligante radioativo. Este método pode ajudar a responder a perguntas nos campos da biologia do desenvolvimento, como níveis de expressão de receptores e suas propriedades bioquímicas. Este método, que apelidamos de AFLIP, estende uma poderosa qualidade descritiva de marcação de afinidade, uma técnica de biologia celular bem estabelecida para estudos de desenvolvimento de peixes-zebra.

Para iniciar este procedimento, colete de 100 a 200 embriões para cada condição e coloque-os em placas de Petri contendo água de peixe. Em seguida, descorione manualmente os embriões usando uma pinça de ponta fina e evite usar pronase ou qualquer outra protease durante todo o protocolo, pois pode digerir os receptores alvo. Em seguida, coloque os embriões em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e lave-os duas vezes com 1X PBS.

Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de desgeming. Libere a maior parte da gema pipetando suavemente os embriões na solução para cima e para baixo cerca de 30 a 40 vezes. Para 72 embriões HPF e 48 HPF, use pontas de pipeta azuis e amarelas, respectivamente.

As pontas amarelas podem precisar ser ligeiramente cortadas para evitar a destruição dos embriões. Uma liberação bem-sucedida da gema pode ser verificada observando os embriões ao microscópio. A remoção da gema deve ser o mais completa possível, pois os lipídios e proteínas da gema podem interferir nas etapas subsequentes de ligação ao ligante ou anticorpo.

Em seguida, coletar os embriões por centrifugação a 600 x g por 15 segundos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta. Em seguida, lave os embriões duas vezes com 500 microlitros de tampão de lavagem, agitando-os suavemente na velocidade mais baixa.

Em seguida, colete os embriões por centrifugação a 600 x g por 15 segundos. A partir daqui, continue o procedimento a quatro graus Celsius. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta.

Em seguida, suspendemos os embriões em 350 microlitros de tampão de lise e os homogeneizamos com um pilão de plástico. Em seguida, incubar os embriões lisados por 30 minutos com agitação em um balancim de tubo de ensaio a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugar os embriões lisados a 11 000 x g durante 15 minutos, a fim de remover os detritos insolúveis.

Em seguida, transferir o sobrenadante limpo para um novo tubo. Determine a proteína total pelo ensaio de proteína de Bradford e curva de calibração plotada. Nesta etapa, coloque 400 a 500 microgramas de proteína embrionária total em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e dilua-o para um micrograma por microlitro com tampão 1.

Em seguida, adicione o estoque de iodo-125 do rótulo TGF-beta II para atingir uma concentração final de 150 picomolares e incube com agitação em um balancim de tubo de ensaio por duas horas a quatro graus Celsius. Depois disso, adicione anticorpo não diluído contra o receptor de interesse para atingir uma diluição de 1:100. Em seguida, continue a incubação a quatro graus Celsius por mais duas horas ou durante a noite.

Após a incubação, adicione 50 microlitros de grânulos de ligação de imunoglobulina adequados e incube por 50 minutos com agitação em um balancim de tubo de ensaio a quatro graus Celsius. Em seguida, recuperar os grânulos por microcentrifugação a 11 000 x g durante 20 segundos e eliminar o sobrenadante num recipiente de lixo radioactivo adequado. Em seguida, lave os grânulos IP três vezes com um mililitro de tampão de lavagem IP por vórtice em microcentrifugação a 11.000 x g por 20 segundos de cada vez.

Em seguida, ressuspenda os grânulos IP em 250 microlitros de tampão de lavagem IP. Prepare uma solução DSS fresca e adicione 1,5 microlitros à amostra. Em seguida, incubar a amostra por 15 minutos a quatro graus Celsius com agitação.

Para extinguir a reação de reticulação, adicione 500 microlitros de tampão de lavagem IP suplementado com estoque de cloreto de triplo suficiente em pH 7,4 para atingir 25 milimolares de cloreto de triplo. Em seguida, centrifugue a 11,00 x g por 20 segundos para coletar os grânulos IP. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda os grânulos IP em 30 microlitros de tampão laemmli redutor.

Em seguida, ferva a amostra a 94 graus Celsius por cinco minutos antes da eletroforese em gel SDS-PAGE e, em seguida, analise os géis secos em um fosforímetro ou por autorradiografia convencional. Esta figura mostra os resultados representativos obtidos com o AFLIP. A proteína total extraída dos embriões a 72 hpf e 48 hpf foi submetida à marcação de afinidade com iodo-125 TGF-beta II seguida de IP com BG anti-zebrafish de coelho ou BG anti-rato de coelho como controle.

Na autorradiografia, a glicemia pode ser detectada sem GAG ou como glicemia modificada por glicosaminoglicanos. Esta figura mostra como o AFLIP pode ser usado para medir os níveis de expressão de um determinado receptor em embriões submetidos a uma manipulação experimental, neste caso, a diminuição de betaglicanos à injeção de morfolino. A pista um mostra o nível do receptor beta III de TGF em um embrião do tipo selvagem de 72 hpf, enquanto a pista dois mostra o efeito da administração de sete nanogramas de um morfolino direcionado ao limite do éxon 2-íntron 2 do transcrito primário do ZFPG. Observe que a regulação negativa do BG obtida com este morfolino não é reproduzida por seu controle incompatível.

Esses resultados confirmaram que o fenótipo obtido com este morfolino foi específico para o knockdown do receptor beta III do TGF, conforme descrito anteriormente. O sucesso do AFLIP na detecção de um fator de crescimento ou receptores de citocinas depende da disponibilidade de um ligante radiomarcado que pode ser ligado e reticulado ao seu receptor. Um bom anticorpo para imunoprecipitação também é necessário.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias se for executada corretamente. Como o AFLIP evita a etapa de transferência do western blot, ele permite uma detecção aprimorada de receptores fortemente glicosilados. E vimos aqui para o betaglicano proteoglicano que se transfere de forma muito ineficiente no western blot Após este procedimento, outros métodos, como a digestão enzimática, podem ser realizados para descrever modificações pós-traducionais adicionais, desde que sejam reveladas por técnicas eletroforéticas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como o AFLIP pode ajudá-lo a detectar receptores de baixa abundância em vários embriões de peixes por meio da marcação de afinidade ligada à imunoprecipitação. Por fim, não se esqueça de que o trabalho com Iodo-125 deve ser feito com cuidado e proteção adequada. Boa sorte com seus experimentos.