Preparação de Amostras de MALDI homogênea para Aplicações quantitativas

O objetivo geral deste método de preparação de amostras para espectrometria de massas por dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI MS) é reduzir a heterogeneidade espacial nos sinais iônicos durante a MALDI MS. Um ambiente de secagem bem controlado foi criado para otimizar o método convencional de gota seca, manipulando os fluxos hidrodinâmicos no interior da gota da amostra durante o processo de secagem. A principal vantagem dessa técnica é que a heterogeneidade espacial dos sinais iônicos para as amostras preparadas pelo método de gota seca otimizado pode ser efetivamente reduzida. Embora este método possa fornecer amostras homogêneas para o Sistema Métrico THAP.

Ele também pode ser aplicado a outros sistemas métricos, como o ácido alfa-Ciano-4-hidroxiciânico. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque controlar a condição de secagem não é fácil. Para iniciar este procedimento, abra a porta de uma câmara de secagem e coloque imediatamente uma placa de amostra previamente limpa sobre o bloco baseado em cobre.

Em seguida, feche a porta. Ajuste manualmente o medidor de fluxo de gás para definir a vazão de nitrogênio em 10 pés cúbicos padrão por hora. Após isso, refine o ajuste do medidor de fluxo de gás para garantir que a umidade relativa permaneça sempre abaixo de 25% na câmara de secagem, conforme medido por um higrômetro.

Usando termopares do tipo K para monitorar a temperatura, ajuste manualmente a temperatura do circulador de água até que a placa da amostra atinja 5 graus Celsius para o experimento. Certifique-se de que as temperaturas exigidas e a umidade relativa sejam atingidas antes da deposição da amostra. Misture 0,25 µL de solução de THAP 0,1 Molar com 0,25 µL do analito desejado em um tubo de microcentrífuga.

Vortex a amostra por três segundos. Em seguida, centrifugue a amostra por dois segundos para recolher a solução na parte inferior do tubo de microcentrífuga. Após a centrifugação, abra a porta da câmara de secagem e deposite cuidadosamente 0,1 microlitros da solução na placa de amostra com uma pipeta.

Feche a porta imediatamente e aguarde a gota da amostra secar completamente. Quando a temperatura da placa de amostra é mantida mais baixa do que a do ambiente, a velocidade média dos fluxos de recirculação dentro da gota aumenta significativamente, promovendo a redistribuição de moléculas. A deposição da amostra é a etapa mais crítica, que determina a qualidade e a reprodutibilidade dos dados.

A solução da amostra pré-misturada precisa ser depositada imediatamente na placa de amostra para garantir que a amostra seja cristalizada em condições controladas. Após a secagem, abra a porta da câmara de secagem.

Em seguida, ajuste a temperatura do circulador de água para 25 graus Celsius. Quando a temperatura da placa de amostra retornar a 25 graus Celsius, remova a placa de amostra da câmara de secagem. Examine a morfologia da amostra em um microscópio estereoscópico com aumento de cinco vezes e capture uma imagem em campo claro.

Neste momento, insira a placa de amostras em um espectrômetro de massas MALDI. Em seguida, realize a análise de espectrometria de massas por imagem. Selecione um pico de massa característico da lista de massas exibida na janela de resultados e clique em 2D para gerar uma imagem iônica bidimensional.

Em seguida, clique nos botões de ajuste na janela pop-up para determinar os limites superior e inferior da intensidade do sinal, aumentar a resolução da imagem e clique em salvar uma imagem. Observe e compare a imagem de íons com a imagem de campo claro previamente adquirida para obter a região essencial da amostra. Agora, clique nos pontos nulos e nas regiões rachadas na imagem de íons mostrada na janela de resultados para ajustar com precisão a região a ser analisada.

Clique no botão encontrar borda para identificar a camada mais externa da imagem iônica. Em seguida, clique em deduzir para salvar as informações de abundância iônica da camada mais externa em um banco de dados e remover essa camada da imagem iônica simultaneamente. Após repetir os passos anteriores até que o centro da imagem iônica seja definido, clique e selecione todas as caixas de seleção na lista de dados de saída e clique em exportar para exportar os dados.

Por fim, abra os dados exportados utilizando um software de planilha eletrônica para calcular a abundância média de íons de cada camada, a fim de obter as informações de distribuição espacial dos íons. Nas imagens em campo claro e MALDI da maltotriose, o sinal iônico da forma sodiada concentra-se principalmente na periferia da área da amostra quando esta é preparada com uma temperatura da placa de amostra de 25 graus Celsius. Ao reduzir a temperatura para cinco graus Celsius, o sinal distribui-se homogeneamente por toda a área da amostra, sugerindo que a preparação de amostras em uma temperatura mais baixa da placa de amostra pode redistribuir significativamente as moléculas e reduzir a heterogeneidade.

A imagem do íon fragmento da bradicinina protonada mostra uma tendência semelhante à da maltotriose sodiada. As análises estatísticas mostram que a heterogeneidade dos sinais iônicos obtidos com uma temperatura da placa de amostra de 5 graus Celsius reduz em 60 a 80 por cento, em relação àquela com 25 graus Celsius. No caso da maltotriose sodiada, com uma temperatura da placa de amostra de 25 graus Celsius, as intensidades do sinal nos centros são muito menores do que aquelas com a temperatura de 5 graus Celsius.

O fragmento protonado da bradicinina apresenta menor variação ao reduzir a temperatura da placa de amostras de 25 para 5 graus Celsius. Ao tentar este método de secagem, é necessário controlar e monitorar cuidadosamente as temperaturas e a umidade relativa na câmara de secagem. Uma vez dominado, uma amostra preparada por esta técnica pode ser realizada em 30 minutos, se for executada corretamente.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da espectrometria de massas MALDI explorarem a análise quantitativa de amostras em gota seca. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras homogêneas em gota seca para análise por espectrometria de massas MALDI.