Name: Preparação de Amostras de MALDI homogênea para Aplicações quantitativas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a preparar amostras homogêneas para espectrometria de massa MALDI, controlando temperatura e fluxos hidrodinâmicos durante a secagem. Este método reduz a heterogeneidade espacial dos sinais de íons e melhora a confiabilidade dos resultados analíticos.

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Este trabalho é apoiado pelo Centro de Pesquisa Genômica, Academia Sinica e pelo Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan, República da China (Contrato nº 104-2119-M-001-014).

NOTA: Este protocolo é desenvolvido para reduzir a heterogeneidade espacial do fragmento maltotriose e bradicinina (1-7) preparado com o método da gota seco. O protocolo consiste em três etapas principais, incluindo a preparação e pré-condicionamento, a deposição de amostra e de secagem e análise de dados de espectrometria de massa. Os procedimentos são descritos e descritos com mais detalhe a seguir: 1. Preparação e pré-condicionamento <ol><li> Limpeza da placa de amostra <ol><li> Usar luvas de borracha nitrílica e mão-lavar a placa de amostra suavemente com detergente e destilada-água deionizada (DDW). </li><li> Lavar a placa de amostra com metanol (MeOH) e DDW. </li><li> Insira a placa de amostra num copo de 600 ml e encher com DDW. </li><li> Sonicar a amostra na placa de DDW durante 15 minutos num banho de ultra-sons (200 W, 40 kHz). </li><li> Remover DDW a partir do recipiente e encher a proveta com MeOH. </li><li> Sonicar a placa de amostra em MeOH durante 15 min no banho de ultra-sons (200 W, 40 kHz). </li><li> Blow off as gotas de solvente na placa com azoto gasoso e manter a placa de amostra seca, antes da deposição da amostra. </li></ol></li><li> Regulação da temperatura de secagem Câmara NOTA:. A câmara de secagem é de 35 x 20 x 45 cm3 (W x D x H) câmara de acrílico Figura 1 mostra a imagem deste sistema de secagem. A câmara é purgado com gás azoto a temperatura ambiente através de um medidor de fluxo de gás a uma velocidade de fluxo constante para manter uma condição de baixa humidade relativa controlada por um higrómetro calibrado instalado no interior da câmara de secagem. Um bloco de base de cobre na câmara de secagem equipada com uma constante circulação de água de temperatura programado é utilizado para acomodar placas de amostra de aço inoxidável. O bloco de base de cobre é capaz de regular a temperatura da placa de amostra de 5 a 25 ° C. As temperaturas do ar, do bloco da base de cobre, e a placa de amostra são monitoradas por termopares tipo K. <ol><li> Abra a porta e colocar rapidamente a placa de amostra sobre o cobrebloco da base, em seguida, fechar a porta. </li><li> ajustar manualmente o medidor de vazão de gás para definir a taxa de fluxo de azoto a 10 pés cúbicos padrão por hora (scfh). </li><li> Monitorar a umidade relativa do ar na câmara de secagem pelo higrômetro e afinar o medidor de vazão de gás para garantir a umidade relativa do ar é sempre inferior a 25%. </li><li> Monitorar a temperatura da placa amostra por termopares tipo K e ajustar a temperatura da água de circulação manualmente até que o prato da amostra atinge 5 ° C durante experimento ou à temperatura ambiente (25 ° C) para o controlo. NOTA: De modo a estabilizar a placa de amostra a uma temperatura concebido, a temperatura de circulação de água é tipicamente definido de 0 a 5 ° C mais baixa do que a amostra concebido. Por exemplo, para manter a 5 ° C na placa de amostra, o ajuste da temperatura da bomba de circulação de água está compreendida no intervalo de 0 a 2 ° C; para manter a placa de amostras a 25 ° C, a regulação da temperatura da bomba de circulação de água é na gama de 23 a 25 ° C. </li><li> Assegurar que as temperaturas exigidas e a humidade relativa são atingidos (Tabela 1), antes da deposição da amostra. NOTA: Todos os parâmetros, bem como os seus valores de ajuste para os processos de secagem com temperaturas de chapa de amostra diferentes estão apresentados na Tabela 1. NOTA: a uma temperatura baixa placa de amostra, a condensação de água na chapa de amostra, pode ocorrer se a porta da câmara é aberta para um longo período de tempo. Se ocorrer condensação de água, fechar a porta e não depositar qualquer amostra nele até a condensação da água é seco. </li></ol></li><li> Preparação da matriz e do analito Soluções <ol><li> Preparação de soluções de matriz <ol><li> Preparar solução 0,1 M THAP com 50% de acetonitrilo (ACN): 50% solução aquosa de DDW. </li></ol></li><li> Preparação de analitos <ol><li> Prepare 10 -4 solução maltotriose M com DDW. </li><li> Preparar 10 -5 M fragmento bradicinina (1-7) em solução a 50% de acetonitrilo(ACN): 50% solução aquosa de DDW. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. A deposição da amostra e Secagem <ol><li> Pré-mistura de 0,25 ml de solução 0,1 M THAP e 0,25 ul de 10 -4 M de maltotriose ou soluções em um tubo de microcentrífuga de 10 -5 M fragmento bradicinina (1-7). </li><li> Vortex a solução misturada por 3 s. </li><li> Centrifugar a solução mista de 2 seg (2000 xg) para recolher a solução no fundo do tubo de centrifugação. </li><li> Abrir a porta da câmara de secagem, cuidadosamente depositar 0,1 ul da solução na placa de amostra com uma pipeta e fechar a porta imediatamente. </li><li> Aguarde até que a gota de amostra a secar. . NOTA: Os tempos de secagem tipicamente observada com temperaturas de chapa de amostra diferentes estão listados na Tabela 1 para a temperatura da placa de amostra de 5 ° C, o tempo médio de secagem é de 800 a 1000 seg; para temperatura da placa de amostra de 25 ° C, o tempo médio de secagem é de 100 a 150 sec. </li><li> Após a secagem, abrir a porta da câmara de secagem. </li><li> Ajustar a temperatura da água de circulação até à temperatura ambiente (25 ° C). NOTA: Ignore este passo se a placa de amostra é mantida constantemente à temperatura ambiente (25 ° C) durante o processo de secagem. </li><li> Depois da amostra de temperatura da placa de voltar à temperatura ambiente (25 ° C), remover o prato da amostra a partir da câmara de secagem. </li><li> Examinar a morfologia da amostra sob um microscópio estereoscópico de 5x e tomar imagem de campo brilhante um instantâneo. NOTA: Se as morfologias de cristal não são como esperado, é necessário preparar uma nova amostra com o mesmo procedimento. Morfologias cristalinas típicas são apresentadas nos painéis superior da Figura 2. NOTA: Nos casos com temperaturas de chapa de amostra baixa, tal como 5 ° C, é importante para aquecer a placa de amostra para a temperatura ambiente antes de o levar para fora da câmara de secagem. Ao depositar as amostras, não mantenha o solutio pré-misturadon na ponta da pipeta ao longo de 10 seg. NÃO usar a solução pré-misturada de novo depois de depositar as amostras. Os painéis superior da Figura 2 mostrar as imagens de campo brilhante de amostras preparadas com temperaturas de chapa de amostra diferentes. </li></ol> Análise 3. Espectrometria de Massa de dados <ol><li> Dados de espectrometria de massa Aquisição NOTA: Após a preparação, a amostra pode ser analisada utilizando espectrometria de massa de imagem. No presente estudo, as experiências de imagiologia MS são realizados utilizando um sincronizado TOF dupla polaridade construído em laboratório (DP-TOF) espectrómetro de massa de imagiologia. 15 espectrómetros de massa MALDI-TOF comercial com capacidade de imagiologia também são adequados para tais experiências. O espectrómetro de massa é operado na extração linear e modos de iões positivos com atrasos de extração otimizados. A energia cinética dos iões é de 20 kV. O tamanho do feixe de laser é de 35 um de diâmetro sobre a superfície da amostra, e o espectro de cada ponto representa a avraiva de 5 disparos de laser. <ol><li> Insira a placa de amostra para o espectrómetro de massa MALDI. </li><li> Realizar imagem análise de espectrometria de massa para a amostra preparada em passos 2.1-2.9. </li><li> Selecione um pico de massa característica da lista de massa mostrado na janela de resultados e clique em &quot;2D&quot; para traçar uma imagem ion bidimensional. NOTA: Para maltotriose misturado com THAP, os picos característicos são sodiated maltotriose, THAP protonada e sodiated THAP. Por fragmento de bradicinina (1-7) misturado com THAP, os picos característicos incluem protonado fragmento bradicinina (1-7), THAP protonado, e sodiated THAP. </li><li> Clique nos botões de ajuste na janela de pop-up para determinar os limites superior e inferior da intensidade do sinal e clique em &quot;salvar uma imagem&quot;. Esta configuração define o contraste das imagens íon. NOTA: Em cada conjunto individual de dados, as regiões rachados e os pontos nulos mostrando baixa luminosidade são eliminados. </li><li> Observar e comparar o íonimagem com a imagem de campo brilhante que foi tomada no passo 2.9. NOTA: Geração de espectrometria de massa e produção de imagens de iões específicos pode ser conseguida com instrumentos comerciais. Devido à variedade de aquisição de dados e software de análise, os usuários devem seguir as instruções de software fornecidas pelo fornecedor do instrumento para obter imagens de alta qualidade. </li></ol></li><li> Análise de dados NOTA: A heterogeneidade das amostras é analisado quantitativamente. Nesta demonstração, cada amostra é dividida em várias áreas concêntricas por software desenvolvido in-house para analisar a distribuição espacial dos íons. A análise pode também ser realizada usando software de análise de dados independente. <ol><li> Clique os pontos nulos e as regiões rachados na imagem ion mostrado na janela de resultado para remover as áreas sem importância. NOTA: Este procedimento define a área essencial imagem de iões de. </li><li> Clique em &quot;encontrar edge&quot; botão para encontrar a camada mais externa da imagem de ion. </li><li> Clique em &quot;deduzir&quot; para salvar as informações abundância de íons da camada mais externa em um banco de dados e remover esta camada a partir da imagem de íon simultaneamente. Uma caixa de seleção que representa esta camada mais externa aparecerá na lista &quot;de dados de saída&quot; da janela de resultados. </li><li> Repita os passos 3.2.2 e 3.2.3 até que o centro da imagem de iões é definido. </li><li> Clique e selecione todas as caixas de seleção na lista de &quot;dados de saída&quot; e clique em &quot;Exportar&quot; para exportar os dados. </li><li> Abrir os dados exportados usando o software de planilha para calcular a abundância média de iões de cada camada para obter as informações de distribuição espacial de íons. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Desorption+Ionization+of+Proteins+with+Molecular+Masses+Exceeding+10000+Daltons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Laser Desorption Ionization of Proteins with Molecular Masses Exceeding 10000 Daltons.</a> Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988).</li>
<li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Velocity+Distributions+of+Intact+High+Mass+Polypeptide+Molecule+Ions+Produced+by+Matrix+Assisted+Laser+Desorption%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Velocity Distributions of Intact High Mass Polypeptide Molecule Ions Produced by Matrix Assisted Laser Desorption.</a> Chem. Phys. Lett. 181, 479-484 (1991).</li>
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<li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Tissue+Analysis+Using+Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Mass+Spectrometry%3A+Practical+Aspects+of+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct Tissue Analysis Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry: Practical Aspects of Sample Preparation.</a> J. Mass Spectrom. 38, 699-708 (2003).</li>
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<li>Bhardwaj, R., Fang, X., Attinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+Formation+During+the+Evaporation+of+a+Colloidal+Nanoliter+Drop%3A+A+Numerical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22New+J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Pattern Formation During the Evaporation of a Colloidal Nanoliter Drop: A Numerical and Experimental Study.</a> New J. Phys. 11, 075020(2009).</li>
<li>Savino, R., Paterna, D., Favaloro, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy+and+Marangoni+Effects+in+an+Evaporating+Drop%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thermophys+Heat+Tr%22%5BJournal%5D)">Buoyancy and Marangoni Effects in an Evaporating Drop.</a> J Thermophys Heat Tr. 16, 562-574 (2002).</li>
<li>Probstein, R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aProbstein%2C+RF+%22Surface+Tension.+in+Physicochemical+Hydrodynamics+%3A+An+Introduction%22">Surface Tension. in Physicochemical Hydrodynamics : An Introduction</a>. , John Wiley & Sons. Ch. 10 305-361 (1994).</li>
<li>Lai, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27, 1314-1321 (2016).</li>
<li>Hsiao, C. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Molecular+Imaging+of+Photolabile+Surface+Samples+with+Synchronized+Dual-Polarity+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Molecular Imaging of Photolabile Surface Samples with Synchronized Dual-Polarity Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 834-842 (2011).</li>
<li>Vorm, O., Roepstorff, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Resolution+and+Very+High-Sensitivity+in+MALDI+TOF+of+Matrix+Surfaces+Made+by+Fast+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Improved Resolution and Very High-Sensitivity in MALDI TOF of Matrix Surfaces Made by Fast Evaporation.</a> Anal. Chem. 66, 3281-3287 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. J., Schwarzinger, C., Schwarzinger, B., Panne, U., Weidner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Segregation+as+the+Major+Cause+for+Sample+Inhomogeneity+in+MALDI+Dried+Droplet+Spots%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix Segregation as the Major Cause for Sample Inhomogeneity in MALDI Dried Droplet Spots.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 1356-1363 (2014).</li>
<li>Mampallil, D., Eral, H. B., van den Ende, D., Mugele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Evaporating+Complex+Fluids+through+Electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Control of Evaporating Complex Fluids through Electrowetting.</a> Soft Matter. 8, 10614-10617 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesse financeiro conflitante.

Com base em previsões teóricas anteriores, fluxos hidrodinâmicos induzidas pela temperatura dentro de gotículas pode ultrapassar para fora fluxos capilares induzidas por evaporação do solvente. A eficiência de tais moléculas de recirculação interna é aumentada quando a gradientes de temperatura dentro de um aumento de gotícula. De acordo com os resultados previstos, ao manter a temperatura da placa de amostra abaixo de 5 ° C, mantendo a sua envolvente, à temperatura ambiente, a velocidade média de fluxo de recirculação ...

A espectrometria de massa (MS) é uma das técnicas analíticas mais importantes para analisar as composições moleculares de amostras complexas. Dentre todos os métodos de ionização utilizados na EM, a dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI) é o método mais sensível e amplamente utilizado em aplicações bioanalíticas. 1 Em comparação com outras técnicas de ionização, o MALDI tem a mais alta sensibilidade e alta tolerância a contaminantes de sal. Tais propriedades analíticas tornam o MALDI a primeira escolha para análise de carboidratos e muitas aplicações proteômicas. No entanto, a preparação da amostra é uma etapa crucial para a obtenção de dados de alta qualidade no MALDI-MS.
O método de preparação de amostras mais comumente usado para MALDI-MS é o método de gotículas secas, no qual as gotículas de amostra são depositadas em uma superfície e secas em condições ambientais. Este método de secagem é simples e geralmente eficaz. 2-5 No entanto, um problema comum no método de gotículas secas é que os cristais de analito / matriz resultantes normalmente se distribuem irregularmente. Em muitos casos, os cristais se agregam na periferia das áreas de amostra, resultando na chamada formação de manchas em anel. 6-8 As morfologias cristalinas heterogêneas afetam a distribuição espacial das moléculas do analito, o que resulta em flutuação severa no sinal de íons nas áreas de amostra. Essas flutuações severas de sinal e baixa reprodutibilidade de dados são conhecidas como o problema do "ponto ideal" no MALDI-MS. 9 Assim, há uma grande necessidade de reduzir as heterogeneidades espaciais nas aplicações de gotículas secas MALDI-MS.
Os fluxos hidrodinâmicos na gota da amostra desempenham um papel importante na determinação da distribuição espacial das amostras preparadas com o método da gota seca. 10-12 Verificou-se que a evaporação do solvente induz fluxos capilares externos dentro das gotículas, que são responsáveis pela formação da mancha do anel. 7,10 Em contraste, os fluxos de recirculação induzidos por gradientes tangenciais de tensão superficial podem contrabalançar os fluxos capilares externos. 13 Se as velocidades do fluxo de recirculação forem maiores do que as dos fluxos capilares externos, as amostras podem ser redistribuídas com eficiência para reduzir o problema da heterogeneidade. 14
Neste trabalho, demonstramos um protocolo detalhado para preparação de amostras com uma câmara de secagem simples para induzir fluxos de recirculação eficientes durante os processos de secagem de gotículas. As condições de secagem por gotículas são controladas com precisão, incluindo as temperaturas da placa de amostra e seus arredores e a umidade relativa dentro da câmara. Os analitos modelo incluem maltotriose e cadeia de bradicinina (1-7). A matriz utilizada para a demonstração é a 2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP). As amostras são examinadas com MS de tempo de voo (TOF) e os dados são analisados quantitativamente para mostrar a redução da heterogeneidade.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detergente em pó</td><td>Alconox</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T64602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fragmento de bradicinina (1-7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1651</td><td></td></tr><tr><td>Maltotriose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47884</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta</td><td>Mettler Toledo</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q purificação de água sistema</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo sem pó</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>Copo de 600 ml</td><td>Duran</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>Delta</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>Higrômetro</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de vazão de gás nitrogênio</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>K-type termopares</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de secagem controlável por temperatura</td><td>neste laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massa de imagem de tempo de voo de dupla polaridade sincronizada (DP-TOF IMS)</td> <td>este laboratório</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF amostra de aço inoxidável alvo</td><td>deste laboratório</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de amostras de maldi homogênea para aplicações quantitativas

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Este protocolo demonstra uma preparação simples de amostra para reduzir a heterogeneidade espacial em sinais de íons durante a espectrometria de massa de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI). A heterogeneidade dos sinais de íons é um problema grave no MALDI, o que resulta em baixa reprodutibilidade dos dados e torna o MALDI inadequado para análise quantitativa. Ao regular a temperatura da placa de amostra durante a preparação da amostra, os fluxos hidrodinâmicos induzidos termicamente dentro das gotículas da solução da amostra são capazes de reduzir o problema de heterogeneidade. Uma câmara de preparação de amostras à temperatura ambiente equipada com um bloco de base de cobre regulado por temperatura que contém placas de amostra MALDI facilita o controle preciso da condição de secagem da amostra. Após a secagem das gotículas de amostra, a temperatura das placas de amostra é devolvida à temperatura ambiente e removida da câmara para posterior análise espectrométrica de massa. As áreas das amostras são examinadas com espectrometria de massa de imagem MALDI para obter a distribuição espacial de todos os componentes da amostra. Em comparação com o método convencional de gotículas secas que prepara amostras em condições ambientais sem controle de temperatura, as amostras preparadas com o método aqui demonstrado apresentam distribuição espacial e intensidade de sinal significativamente melhores. De acordo com observações usando amostras de carboidratos e peptídeos, diminuir a temperatura do substrato e manter o ambiente à temperatura ambiente durante o processo de secagem pode efetivamente reduzir a heterogeneidade dos sinais de íons. Este método é geralmente aplicável a várias combinações de amostras e matrizes.

As imagens de campo brilhante, bem como as imagens de MS fragmento maltotriose e bradicinina (1-7) preparado, com a temperatura da placa de amostra de 5 e 25 ° C são apresentados na Figura 1. No caso de maltotriose sodiated, o sinal de iões principalmente povoa na periferia da área de amostra quando é preparado com uma temperatura de placa de amostra de 25 ° C. Diminuindo a temperatura da placa de amostra a 5 ° C, o sinal preenche de forma homogénea sobre toda a área da ...

Um protocolo para reduzir as heterogeneidades espaciais dos sinais de iões em espectrometria de massa MALDI por regulação da temperatura do substrato durante o processo de secagem da amostra é demonstrada.

Preparação de Amostras de MALDI homogênea para Aplicações quantitativas

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

O objetivo geral deste método de preparação de amostras para espectrometria de massas por dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI MS) é reduzir a heterogeneidade espacial nos sinais iônicos durante a MALDI MS. Um ambiente de secagem bem controlado foi criado para otimizar o método convencional de gota seca, manipulando os fluxos hidrodinâmicos no interior da gota da amostra durante o processo de secagem. A principal vantagem dessa técnica é que a heterogeneidade espacial dos sinais iônicos para as amostras preparadas pelo método de gota seca otimizado pode ser efetivamente reduzida. Embora este método possa fornecer amostras homogêneas para o Sistema Métrico THAP.Ele também pode ser aplicado a outros sistemas métricos, como o ácido alfa-Ciano-4-hidroxiciânico. Geralmente, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque controlar a condição de secagem não é fácil. Para iniciar este procedimento, abra a porta de uma câmara de secagem e coloque imediatamente uma placa de amostra previamente limpa sobre o bloco baseado em cobre.Em seguida, feche a porta. Ajuste manualmente o medidor de fluxo de gás para definir a vazão de nitrogênio em 10 pés cúbicos padrão por hora. Após isso, refine o ajuste do medidor de fluxo de gás para garantir que a umidade relativa permaneça sempre abaixo de 25% na câmara de secagem, conforme medido por um higrômetro.Usando termopares do tipo K para monitorar a temperatura, ajuste manualmente a temperatura do circulador de água até que a placa da amostra atinja 5 graus Celsius para o experimento. Certifique-se de que as temperaturas exigidas e a umidade relativa sejam atingidas antes da deposição da amostra. Misture 0,25 µL de solução de THAP 0,1 Molar com 0,25 µL do analito desejado em um tubo de microcentrífuga.Vortex a amostra por três segundos. Em seguida, centrifugue a amostra por dois segundos para recolher a solução na parte inferior do tubo de microcentrífuga. Após a centrifugação, abra a porta da câmara de secagem e deposite cuidadosamente 0,1 microlitros da solução na placa de amostra com uma pipeta.Feche a porta imediatamente e aguarde a gota da amostra secar completamente. Quando a temperatura da placa de amostra é mantida mais baixa do que a do ambiente, a velocidade média dos fluxos de recirculação dentro da gota aumenta significativamente, promovendo a redistribuição de moléculas. A deposição da amostra é a etapa mais crítica, que determina a qualidade e a reprodutibilidade dos dados.A solução da amostra pré-misturada precisa ser depositada imediatamente na placa de amostra para garantir que a amostra seja cristalizada em condições controladas. Após a secagem, abra a porta da câmara de secagem.Em seguida, ajuste a temperatura do circulador de água para 25 graus Celsius. Quando a temperatura da placa de amostra retornar a 25 graus Celsius, remova a placa de amostra da câmara de secagem. Examine a morfologia da amostra em um microscópio estereoscópico com aumento de cinco vezes e capture uma imagem em campo claro.Neste momento, insira a placa de amostras em um espectrômetro de massas MALDI. Em seguida, realize a análise de espectrometria de massas por imagem. Selecione um pico de massa característico da lista de massas exibida na janela de resultados e clique em 2D para gerar uma imagem iônica bidimensional.Em seguida, clique nos botões de ajuste na janela pop-up para determinar os limites superior e inferior da intensidade do sinal, aumentar a resolução da imagem e clique em salvar uma imagem. Observe e compare a imagem de íons com a imagem de campo claro previamente adquirida para obter a região essencial da amostra. Agora, clique nos pontos nulos e nas regiões rachadas na imagem de íons mostrada na janela de resultados para ajustar com precisão a região a ser analisada.Clique no botão encontrar borda para identificar a camada mais externa da imagem iônica. Em seguida, clique em deduzir para salvar as informações de abundância iônica da camada mais externa em um banco de dados e remover essa camada da imagem iônica simultaneamente. Após repetir os passos anteriores até que o centro da imagem iônica seja definido, clique e selecione todas as caixas de seleção na lista de dados de saída e clique em exportar para exportar os dados.Por fim, abra os dados exportados utilizando um software de planilha eletrônica para calcular a abundância média de íons de cada camada, a fim de obter as informações de distribuição espacial dos íons. Nas imagens em campo claro e MALDI da maltotriose, o sinal iônico da forma sodiada concentra-se principalmente na periferia da área da amostra quando esta é preparada com uma temperatura da placa de amostra de 25 graus Celsius. Ao reduzir a temperatura para cinco graus Celsius, o sinal distribui-se homogeneamente por toda a área da amostra, sugerindo que a preparação de amostras em uma temperatura mais baixa da placa de amostra pode redistribuir significativamente as moléculas e reduzir a heterogeneidade.A imagem do íon fragmento da bradicinina protonada mostra uma tendência semelhante à da maltotriose sodiada. As análises estatísticas mostram que a heterogeneidade dos sinais iônicos obtidos com uma temperatura da placa de amostra de 5 graus Celsius reduz em 60 a 80 por cento, em relação àquela com 25 graus Celsius. No caso da maltotriose sodiada, com uma temperatura da placa de amostra de 25 graus Celsius, as intensidades do sinal nos centros são muito menores do que aquelas com a temperatura de 5 graus Celsius.O fragmento protonado da bradicinina apresenta menor variação ao reduzir a temperatura da placa de amostras de 25 para 5 graus Celsius. Ao tentar este método de secagem, é necessário controlar e monitorar cuidadosamente as temperaturas e a umidade relativa na câmara de secagem. Uma vez dominado, uma amostra preparada por esta técnica pode ser realizada em 30 minutos, se for executada corretamente.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da espectrometria de massas MALDI explorarem a análise quantitativa de amostras em gota seca. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar amostras homogêneas em gota seca para análise por espectrometria de massas MALDI.

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

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