Name: O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Explore a metabolômica e transcriptômica de bagas de uva Corvina para identificar assinaturas de terroir em diferentes regiões vinícolas. Este estudo utiliza análises estatísticas multivariadas para revelar padrões químicos distintos.

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Este trabalho beneficiou das atividades de ligação em rede coordenadas no âmbito da AÇÃO COST FA1106 financiada pela UE "Uma abordagem de sistemas integrados para determinar os mecanismos de desenvolvimento que controlam a qualidade dos frutos carnudos em tomate e videira". Este trabalho foi apoiado pelo projeto «Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale», financiado pela Fundação CARIVERONA Bank, e pelo projeto «Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)», financiado pelo Ministério das Políticas Agrícolas e Florestais italiano. O SDS foi financiado pelo Ministério Italiano da Universidade e Pesquisa FIRB RBFR13GHC5 projeto "A Plasticidade Epigenômica da Videira no Genótipo por Interações Ambientais".

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<li>Toffali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+aspects+of+grape+berry+ripening+and+post-harvest+withering+revealed+by+untargeted+LC-ESI-MS+metabolomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis.</a> Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).</li>
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<li>Velasco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+quality+draft+consensus+sequence+of+the+genome+of+a+heterozygous+grapevine+variety%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety.</a> Plos One. 2 (12), (2007).</li>
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<li>Berdeja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+limitation+and+rootstock+genotype+interact+to+alter+grape+berry+metabolism+through+transcriptome+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Hort+Res%22%5BJournal%5D)">Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming.</a> Hort Res. 2, 1-13 (2015).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solar+ultraviolet+radiation+is+necessary+to+enhance+grapevine+fruit+ripening+transcriptional+and+phenolic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+sampling+bias+in+molecular+studies+of+grapevine+fruit+ripening%3A+transcriptomic+assessment+of+the+density+sorting+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Exp+Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method.</a> Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).</li>
<li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillatory+transcriptional+programs+in+grapevine+ripening+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).</li>
<li>Cavallini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversification+of+grapevine+MYB5a+and+MYB5b+in+the+control+of+flavonoid+biosynthesis+in+a+petunia+anthocyanin+regulatory+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant.</a> Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).</li>
<li>Cramer, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+the+late+stages+of+grapevine+%28Vitis+vinifera+cv.+Cabernet+Sauvignon%29+berry+ripening+reveals+significant+induction+of+ethylene+signaling+and+flavor+pathways+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+the+grapevine+berry+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">The plasticity of the grapevine berry transcriptome.</a> Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).</li>
<li>Fasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Grapevine+Expression+Atlas+Reveals+a+Deep+Transcriptome+Shift+Driving+the+Entire+Plant+into+a+Maturation+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program.</a> Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).</li>
<li>Gambino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+between+Grapevine+rupestris+stem+pitting-associated+virus+and+Vitis+vinifera+L.+leads+to+decreased+defence+responses+and+increased+transcription+of+genes+related+to+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis.</a> J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).</li>
<li>Ghan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+omic+technologies+are+concordant+in+differentiating+the+biochemical+characteristics+of+the+berries+of+five+grapevine+%28Vitis+vinifera+L.%29+cultivars%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars.</a> BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+defoliation+affects+plant+growth%2C+fruit+transcriptional+ripening+program+and+flavonoid+metabolism+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine.</a> BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).</li>
<li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+source%2Fsink+ratio+in+Vitis+vinifera+%28cv+Sangiovese%29+induces+extensive+transcriptome+reprogramming+and+modifies+berry+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening.</a> BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).</li>
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<li>Royo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental%2C+transcriptome%2C+and+genetic+alterations+associated+with+parthenocarpy+in+the+grapevine+seedless+somatic+variant+Corinto+bianco%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco.</a> J Exp Bot. , 259-273 (2015).</li>
<li>Venturini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+transcriptome+characterization+of+Vitis+vinifera+cv.+Corvina+unveils+varietal+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity.</a> BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).</li>
<li>Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+metabolomics%3A+an+emerging+approach+to+determine+the+composition+of+herbal+products%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Struct+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products.</a> Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+Modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este artigo descreve os metabolômica, transcriptomics e protocolos de análise estatística utilizados para interpretar o conceito de terroir baga da uva. Metabolómica análise por meio de HPLC-ESI-MS é suficientemente sensível para detectar um grande número de metabolitos simultaneamente, mas a quantificação relativa é afectado pelo efeito da matriz e de iões de supressão / realce. No entanto, uma abordagem semelhante já foi usado para descrever o amadurecimento e fulminante pós-colheita de frutos Corvina, e a correção de...

análise de dados em larga escala com base nos genomas, transcriptomes, proteomas e metabolomes de plantas oferece uma visão sem precedentes sobre o comportamento de sistemas complexos, tais como as características terroir do vinho que refletem as interações entre plantas de videira e seu ambiente. Porque o terroir de um vinho pode ser diferente, mesmo quando clones de videira idênticos são cultivadas em vinhedos diferentes, a análise genômica é de pouca utilidade, porque os genomas clonais são idênticos. Em vez disso, é necessário olhar para as correlações entre a expressão do gene e as propriedades metabólicas das bagas, que determinam os traços de vinho de qualidade. A análise da expressão do gene ao nível dos benefícios transcriptoma de as propriedades químicas semelhantes de todos os transcritos, o que facilita a análise quantitativa por exploração das características universais, tais como hibridação com sondas imobilizadas em microarrays. Em contraste, os métodos analíticos universais em proteômica umnd metabolômica são mais difíceis por causa da enorme diversidade física e química de proteínas e metabólitos individuais. No caso de metabolômica esta diversidade é ainda mais extrema, porque metabólitos individuais diferem muito em tamanho, polaridade, abundância e volatilidade, de forma que nenhum processo de extração única ou método analítico oferece uma abordagem holística. Entre as plataformas de análise adequados para os metabolitos não voláteis, os baseados em cromatografia líquida de alto desempenho acoplada a espectrometria de massa (HPLC-MS) são muito mais sensíveis do que as alternativas, tais como a CLER com raios ultravioleta ou de diodos detectores de matriz (HPLC-UV, HPLC-DAD ) ou espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN), mas a análise quantitativa por meio de HPLC-MS pode ser influenciado por fenómenos tais como o efeito da matriz e de supressão de iões / realce 1-3. A investigação de tais efeitos durante a análise dos bagos de uva Corvina por HPLC-MS usando uma fonte de ionização electrospray (HPLC-ESI-MS), mostrou que os açúcares e outras moléculas com as menores tempos de retenção foram fortemente subestimada, provavelmente reflectindo também o grande número de moléculas nesta zona, e que a abundância de outras moléculas pode ser subestimada, excessivas ou afectada pelo efeito matriz , mas a normalização de dados para o efeito de matriz parecia ter impacto limitado sobre o resultado de 4,5 global. O método aqui descrito é otimizado para a análise dos metabolitos média polaridade que se acumulam em níveis elevados em bagos de uva durante a maturação e que são significativamente impactados pelo terroir. Eles incluem antocianinas, flavonóis, flavan-3-ols, procianidinas, outros flavonóides, resveratrol, estilbenos, ácidos hidroxicinâmico e ácidos hidroxibenzóico, que, juntos, determinam a cor, sabor e propriedades relacionadas com a saúde de vinhos. Outros metabolitos, tais como os açúcares e os ácidos orgânicos alifáticos, são ignorados porque a quantificação por meio de HPLC-MS não é fiável devido à matriz effect e supressão de íons fenômenos 5. Dentro da gama de polaridade seleccionada por este método, a abordagem é não segmentado em que visa detectar como muitos metabolitos diferentes quanto possível 6. Transcriptomics métodos que permitem que milhares de transcritos de videira para ser monitorizada simultaneamente são facilitado pela disponibilidade da sequência do genoma completo videira 7,8. métodos transcriptômica início com base em high-throughput seqüenciamento de cDNA evoluíram com o advento do sequenciamento de última geração em um conjunto de procedimentos descritos coletivamente como a tecnologia de RNA-Seq. Esta abordagem está se tornando rapidamente o método de escolha para estudos transcriptômica. No entanto, um grande corpo de literatura com base no micro-arranjo, o que permite milhares de transcritos para ser quantificada em paralelo por hibridização, tem acumulado para vinha. Na verdade, antes de RNA-Seq tornou-se uma tecnologia mainstream, muitas plataformas de microarrays comerciais dedicados tinha sidodesenvolvido permitindo transcriptoma vinha a ser inspeccionado em grande detalhe. Entre a grande variedade de plataformas, apenas dois permitiu a análise do transcriptoma do genoma 9. A matriz mais evoluído permitiu a hibridização de cerca de 12 amostras independentes de um único dispositivo, reduzindo assim os custos de cada experiência. As 12 sub-matrizes cada um composto 135.000 sondas 60-mer representando 29,549 transcrições de videira. Este dispositivo foi usado em um grande número de estudos 10-24. Estas duas plataformas já foram interrompidas, mas um novo microarray personalizado foi recentemente concebido e representa um desenvolvimento mais recente, já que contém um número ainda maior de sondas que representam genes de videira recém-descobertos mais 25. Os conjuntos de dados de grande venda produzidas por transcriptomics e metabolômica análise requer métodos estatísticos adequados para a análise de dados, incluindo técnicas de análise multivariada para determinar correlações entre forma diferentes de dados. As técnicas de análise multivariada mais utilizados são aqueles com base em projeção, e estes podem ser sem supervisão, tais como análise de componentes principais (PCA), ou supervisionado, como projeção ortogonal bidirecional com estruturas latentes análise discriminante (O2PLS-DA) 26. O protocolo apresentado neste artigo utiliza PCA para análise exploratória de dados e O2PLS-DA para identificar diferenças entre grupos de amostras.

<table><tbody><tr><td>Moedor</td><td>de Moinho IKA</td><td>IKA A11 amostrador</td> automático de HPLC básico <td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp;-</td><td>System Gold 508 Autosampler</td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp;-</td><td>System Gold 127 Módulo de Solvente HPLC</td></tr><tr><td>C18 Guard Column</td><td>Grace</td><td>&nbsp;-</td><td>Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 &mu; m) Coluna de Guarda</td></tr><tr><td>C18 Coluna</td><td>Grace</td><td>&nbsp;-</td><td>Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 &mu; m)</td></tr><tr><td>Espectômetro de Massa em Coluna</td><td>Bruker Daltonics</td><td>&nbsp;-</td><td>Bruker Esquire 6000; O espectômetro de massa foi equipado com uma fonte ESI e o analisador era uma armadilha de íons.</td></tr><tr><td>Solventes de extração e tampões de HPLC</td><td>Sigma</td><td>34966</td><td>Metanol LC-MS grau</td></tr><tr><td>Sigma</td><td>94318</td><td>Ácido fórmico LC-MS grau</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>34967</td><td>Acetonitrila LC-MS grau</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>39253</td><td>Água&nbsp; Filtros de</td> seringa Minisart RC 4 de grau <td></td>LC-MS</tr><tr><td>(0,2 &mu; m)</td> <td>Sartorius</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>Softwares para coleta de dados (a) e processamento (b)</td> <td>Bruker Daltonics-Bruker</td><td></td> <td>Daltonics Esquire 5.2 Controle (a); Esquire 3.2 Análise de Dados e MzMine 2.2 softwares (b)</td></tr> <tr><td>Spectrum Plant Total RNA kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN250-1KT</td><td>Para extrato total de RNA de pericarpos de uva</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939A</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Reagentes</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Chips de RNA</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Tampão de Lavagem de Expressão Gênica 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Lavagem de Expressão Gênica Agilent 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Rotulagem QuickAmp de Baixa Entrada One-Color</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2305</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNA Spike In - One-Color</td><td>Agilent Tecnologias</td><td>5188-5282</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Hibridização de Expressão Gênica</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5242</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Para Purificação de cRNA</td></tr><tr><td>Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F-048771&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>eArray</td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td><a href="https://earray.chem.agilent.com/earray/">https://earray.chem.agilent.com/earray/</a></td></tr><tr><td>Lâminas de junta</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2534-60012</td><td>Habilitar Agilent SurePrint Microarray 4-array Hibridização</td></tr><tr><td>Banho Termostático</td><td>Câmara de Hibridização Julabo-Hybridization</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>G2534-60001</td><td></td></tr><tr><td>Forno de Hibridização de Microarray</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2545A</td><td></td></tr><tr><td>Rack de Rotador de Forno de Hibridização</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2530-60029</td><td></td></tr><tr><td>Haste de Conversão de Rack de Rotador</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2530-60030</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloração</td><td>Bio-Optica</td><td>10-2000</td><td>Prato de coloração deslizante e rack de slides</td></tr><tr><td>Dispositivo de agitador magnético</td><td>AREX Aquecedor Magnético Agitador Magnético</td><td>F20540163&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Forno termostático</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus - 6030</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Microarray Scanner</td> Carrossel <td>de scanner de G2565CA</td><td></td><td>de Agilent Technologies</td></tr><tr><td>, 48 posições</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2505-60502</td><td></td></tr><tr><td>Suportes de slides</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2505-60525</td><td></td></tr><tr><td>Software de extração de recursos v11.5</td><td>Agilent Tecnologias</td><td></td> <td>dentro do scanner de microarray Agilent G2565CA</td></tr><tr><td>SIMCA + V13 Software</td><td>Umetrics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o conceito terroir interpretado através da baga da uva metabolomics e transcriptómica

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

Terroir refere-se à combinação de fatores ambientais que afetam as características das culturas como videira (Vitis vinifera) de acordo com determinados habitats e práticas de gestão. Este artigo mostra como certos assinaturas terroir pode ser detectado no metaboloma baga e transcriptoma do Corvina videira cultivar utilizando análise estatística multivariada. O método requer primeiro um plano de amostragem adequada. Neste estudo de caso, um clone específico da cultivar Corvina foi selecionado para minimizar as diferenças genéticas, e amostras foram coletadas em sete vinhas representando três diferentes macro-regiões durante as três estações de crescimento diferentes. Uma abordagem não segmentados metabolômica LC-MS é recomendado devido à sua alta sensibilidade, acompanhado de processamento de dados eficiente usando software MZmine e uma estratégia de identificação metabólito com base na análise da árvore de fragmentação. análise de transcriptoma global pode ser conseguido usando microarrayscontendo sondas cobrindo ~ 99% de todos os genes de videira preditos, permitindo a análise simultânea de todos os genes expressos diferencialmente no contexto de diferentes terrenos de. Finalmente, a análise de dados multivariados com base em métodos de projecção pode ser utilizado para ultrapassar o efeito forte específico da vindima, permitindo que os dados e metabolômicas transcriptômica a ser integrados e analisados ​​em pormenor, para identificar as correlações informativos.

O estudo de caso descrito neste artigo resultou em uma matriz de dados final com 552 sinais (m / z recursos), incluindo iões moleculares mais seus isótopos, adutos e alguns fragmentos, relativamente quantificados entre 189 amostras (7 vinhas x 3 estádios de maturação x 3 períodos de crescimento x 3 repetições biológicas). O número total de pontos de dados foi, portanto, 104.328. A análise da árvore fragmentação resultou na anotação de 282 características m / z, correspo...

Este artigo descreve a aplicação de metabolômica irrelevantes, transcriptomics e análise estatística multivariada para transcrições baga da uva e metabolitos, a fim de ter uma visão sobre o conceito terroir, ou seja, o impacto do meio ambiente sobre características de qualidade de baga.

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

O objetivo geral desses procedimentos experimentais é observar as diferentes assinaturas de terroir no metaboloma e transcriptoma da baga da cultivar de videira Corvina. O estudo de caso descrito aqui envolveu a coleta e análise de amostras em três estádios de maturação provenientes de sete vinhas em três zonas macroclimáticas ao longo de três safras. As técnicas descritas revelam o efeito predominante da safra sobre o metaboloma da baga.Assinaturas químicas específicas representando as três macrozonas também foram identificadas nas bagas maduras. A assinatura do terroir no nível da macrozona foi revelada por meio de técnicas estatísticas adequadas, como a ACP, que é a análise de componentes principais, e a auto BLSDA, que é a projeção ortogonal bidirecional para estruturas plúmbeas, análise discreta, para analisar tanto a matriz de dados de transcriptômica quanto de metabolômica. Por outro lado, as diferenças entre vinhas individuais são mais sutis e também exigem abordagens estatísticas mais sofisticadas e sensíveis.Inicie o experimento elaborando um plano de amostragem apropriado. Certifique-se de que o plano de amostragem indique os locais e horários de coleta, bem como o procedimento de amostragem preciso. Após colher 30 cachos de diferentes posições ao longo de duas fileiras de videira, selecione aleatoriamente três bagas de cada cacho, evitando aquelas com danos visíveis ou sinais de infecção.Repita este processo para obter três pools independentes para cada estágio de amadurecimento. Remova as sementes das bagas e congele imediatamente o pericarpo em nitrogênio líquido. Triture todas as bagas congeladas de cada pool com um moedor automático.Divida cada amostra em pó em duas partes iguais, uma para análise de transcriptômica e outra para análise de metabolômica. Em seguida, feche e remova o duer e armazene os pós a menos 80 graus Celsius. Prepare os extratos metabólicos das amostras de bagas à temperatura ambiente em três volumes de metanol, acidificados com 0,1% de ácido fórmico, em banho ultrassônico a 40 quilohertz por 15 minutos.Centrifugue os extratos a 16.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Dilua o sobrenadante em dois volumes de água deionizada e filtre através de um filtro de 0,2 mícron. Prepare a cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada à espectrometria de massas, utilizando uma fonte de ionização por eletrosspray ou sistema HPLC-ESI-MS, conforme descrito no protocolo do texto.Realize a separação por CLAE com um gradiente linear dos solventes A e B a uma taxa de fluxo constante de 0,2 mililitros por minuto, utilizando um volume de injeção da amostra de 30 microlitros. Adquira espectros de massa em modos de ionização negativo e positivo alternados, com os parâmetros listados no protocolo textual. Para processar os dados de CLAE-EM, implemente os procedimentos de detecção de picos, alinhamento, preenchimento de lacunas e filtragem de picos utilizando um software adequado, como o software de código aberto M Zeta Mine, versão 2.14.Importe os arquivos de texto resultantes para uma planilha. Isso produz uma matriz de dados na qual todos os metabólitos detectados, reconhecidos por um número de identificação, valor da razão massa/carga e tempo de retenção, são quantificados em todas as amostras em termos dos valores de suas áreas de pico. Prepare a montagem de hibridização com base nas especificações do formato de quatro pacotes, colocando 1,65 microgramas de RNA complementar marcado com cianina, em um volume final de 41,8 microlitros de água livre de RNAse e desionizada.Adicione 11 microlitros de agente bloqueador 10X e 2,2 microlitros de tampão de fragmentação 25X. Incube a 60 graus Celsius por 30 minutos em banho termostático para fragmentar o RNA. Após 30 minutos, resfrie imediatamente em gelo por um minuto.Finalmente, adicione 55 microlitros de tampão de hibridização 2X e misture bem por pipetagem. Após centrifugar por um minuto a 15.500 ×g em temperatura ambiente, coloque imediatamente o tubo de microcentrifugação no gelo. Para carregar o microarranjo personalizado, insira uma lâmina com vedação, com o rótulo voltado para cima, na base de uma câmara de hibridização.Carregue lentamente 100 microlitros da amostra de hibridização em cada poço da junta, dispensando o líquido com a ponta de uma pipeta, evitando bolhas. Coloque lentamente o micro-arranjo personalizado com a face voltada para baixo, garantindo que o código de barras numérico esteja voltado para cima. Certifique-se de que o par em sanduíche esteja adequadamente alinhado.Por fim, coloque a tampa da câmara de hibridização sobre as lâminas empilhadas e aperte manualmente o grampo na câmara. Gire a câmara montada para avaliar a mobilidade das bolhas. Coloque a câmara com as lâminas montada em uma rotisserie balanceada, dentro de uma estufa de hibridização ajustada a 65 graus celsius.Configure o rotador para girar a 10 RPM. Deixe a hibridização prosseguir por 17 horas. Para prosseguir com a lavagem da lâmina de microarranjo, prepare três recipientes para coloração de lâminas e preencha-os com os tampões de lavagem apropriados.Encha dois recipientes com o tampão de lavagem um, um à temperatura ambiente e outro com o tampão de lavagem dois pré-aquecido. Desmonte a câmara de hibridização e remova o sanduíche. Com o código de barras numérico do lâmina de microarranjo voltado para cima, submerja o sanduíche no primeiro recipiente para coloração preenchido com o tampão de lavagem um à temperatura ambiente e, com a ajuda de pinças limpas, separe a junta da lâmina de microarranjo.Transfira rapidamente a lâmina de microarranjo para uma grade de lâminas e coloque-a na segunda cuba de coloração preenchida com tampão de lavagem um, à temperatura ambiente. Coloque a cuba de coloração sobre um agitador magnético e lave por um minuto com agitação moderada. Transfira rapidamente a grade de lâminas para a terceira cuba de coloração, preenchida com tampão de lavagem dois pré-aquecido, e lave por um minuto com agitação moderada.Remova lentamente o suporte do recipiente de coloração de lâminas e retire cuidadosamente a lâmina do suporte, evitando gotículas. Coloque a lâmina de microarranjo em um escâner apropriado e escaneie cada arranjo utilizando as configurações de parâmetros recomendadas no manual de instruções do fabricante do microarranjo. Para preparar o software de análise estatística, primeiro importe os dados de metabolômica e transcriptômica.Vá para Arquivo, Novo Projeto Regular, Novo Projeto Regular, para importar a matriz de dados obtida. Em seguida, clique em Editar. Transponha toda a matriz, início, e atribua o ID primário e secundário apropriados. E finalize.Para realizar a análise estatística multivariada, acesse a janela Workset, selecione PCAX como o tipo de modelo e clique em AutoFit. Selecione Scores e, em seguida, Scatter, para visualizar o gráfico que mostra o agrupamento possível das amostras. Examine o gráfico de escores da PCA.Se um bom modelo for obtido, utilize as mesmas classes de amostras para construir um modelo de análise discriminante O2PLS. Para construir dois modelos de análise discriminante O2PLS utilizando as amostras classificadas por MacroZone, atribua as classes acessando a janela Home, New As, M1 e Observations. Defina as classes desejadas.Em seguida, altere o tipo de modelo de PCAX para análise discriminante O2PLS. Pressione Autofit. Prossiga para selecionar M2 na janela do Projeto e clique em Scores e depois em Scatter para visualizar o gráfico e a posição das classes das amostras.Vá para Selecionar Tipo de Dados e selecione Observações e Cargas. Em seguida, clique em Adicionar Série e selecione os itens correlação PQ um e correlação PQ dois, ou outros componentes quando presentes. Com o botão direito do mouse pressionado sobre o gráfico, vá até Propriedade, selecione Cor e depois selecione Por Termos, para distinguir os símbolos do gráfico entre moléculas e classes.Vá para Layout, Formatar Plotagem, Acesso e/ou Estilos para modificar o gráfico com as características desejadas. Para observar quais metabólitos caracterizam uma ou mais classes específicas, vá para Lista de Gráficos e, em seguida, Dispersão. A análise exploratória da matriz completa de dados por PCA mostrou que as amostras se agruparam de acordo com o estágio de amadurecimento, incluindo veraisão, amadurecimento médio e maduro, ao longo dos dois primeiros componentes principais.As amostras agruparam-se de acordo com a estação de crescimento ao longo do terceiro componente principal. A análise discriminante O2PLS de bagas maduras permite a identificação de assinaturas específicas de terroir, representando as três macrozonas: Valpolicella, Lago de Garda e Soave. Os gráficos de cargas desses modelos são expressos como correlação PQ, a correlação entre P, a classe das amostras, e Q, os metabólitos.Nos gráficos de carregamento, os quadrados vermelhos representam a classe de amostras ou macrozonas, e os triângulos coloridos representam os metabólitos individuais. Os metabólitos são codificados por cores de acordo com sua classe química, e a distância entre os metabólitos e as amostras reflete suas relações. A macrozona do Lago Garda foi caracterizada por estilbenos, enquanto Soave e Valpolicella foram marcados por flavonoides.Dentre as antocianinas, a peonidina e seus derivados foram mais prevalentes na macrozona do Lago Garda, enquanto as demais antocianinas foram mais prevalentes na macrozona de Valpolicella. Além disso, as antocianinas três-O-glicosídeos foram mais prevalentes na macrozona de Valpolicella, enquanto derivados acilados e cumarilados foram mais prevalentes na macrozona de Soave. Métodos de transcriptômica, RA e RNA sig permitem monitorar simultaneamente milhares de transcritos da videira.Um novo microarranjo personalizado foi recentemente desenvolvido e representa um número ainda maior de sondas, incluindo espécies adicionais recém-descobertas do gênero *Vitis*. Dada a rápida obsolescência das plataformas transcriptômicas, descrevemos um procedimento alternativo utilizando uma nova plataforma que contém mais sondas do que a anterior, incluindo 249 transcritos preditos de *peno* a mais, para 1392 locos de *peno* recentemente identificados, e 179 genes de *corvina prava*. A análise de metabolômica por CLAE-EMI-MS é sensível o suficiente para detectar simultaneamente um grande número de metabólitos.A capacidade de criar um plano de amostragem é fundamental. A escolha de um único clone para minimizar as diferenças genéticas, juntamente com a realização de amostragens em múltiplas épocas, permitiu a identificação das diferenças reais entre os terroirs. Seria interessante comparar o mesmo cultivar cultivado em zonas menos ideais, mas, infelizmente, esses vinhedos não estavam disponíveis.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

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