O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

O objetivo geral desses procedimentos experimentais é observar as diferentes assinaturas de terroir no metaboloma e transcriptoma da baga da cultivar de videira Corvina. O estudo de caso descrito aqui envolveu a coleta e análise de amostras em três estádios de maturação provenientes de sete vinhas em três zonas macroclimáticas ao longo de três safras. As técnicas descritas revelam o efeito predominante da safra sobre o metaboloma da baga.

Assinaturas químicas específicas representando as três macrozonas também foram identificadas nas bagas maduras. A assinatura do terroir no nível da macrozona foi revelada por meio de técnicas estatísticas adequadas, como a ACP, que é a análise de componentes principais, e a auto BLSDA, que é a projeção ortogonal bidirecional para estruturas plúmbeas, análise discreta, para analisar tanto a matriz de dados de transcriptômica quanto de metabolômica. Por outro lado, as diferenças entre vinhas individuais são mais sutis e também exigem abordagens estatísticas mais sofisticadas e sensíveis.

Inicie o experimento elaborando um plano de amostragem apropriado. Certifique-se de que o plano de amostragem indique os locais e horários de coleta, bem como o procedimento de amostragem preciso. Após colher 30 cachos de diferentes posições ao longo de duas fileiras de videira, selecione aleatoriamente três bagas de cada cacho, evitando aquelas com danos visíveis ou sinais de infecção.

Repita este processo para obter três pools independentes para cada estágio de amadurecimento. Remova as sementes das bagas e congele imediatamente o pericarpo em nitrogênio líquido. Triture todas as bagas congeladas de cada pool com um moedor automático.

Divida cada amostra em pó em duas partes iguais, uma para análise de transcriptômica e outra para análise de metabolômica. Em seguida, feche e remova o duer e armazene os pós a menos 80 graus Celsius. Prepare os extratos metabólicos das amostras de bagas à temperatura ambiente em três volumes de metanol, acidificados com 0,1% de ácido fórmico, em banho ultrassônico a 40 quilohertz por 15 minutos.

Centrifugue os extratos a 16.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Dilua o sobrenadante em dois volumes de água deionizada e filtre através de um filtro de 0,2 mícron. Prepare a cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada à espectrometria de massas, utilizando uma fonte de ionização por eletrosspray ou sistema HPLC-ESI-MS, conforme descrito no protocolo do texto.

Realize a separação por CLAE com um gradiente linear dos solventes A e B a uma taxa de fluxo constante de 0,2 mililitros por minuto, utilizando um volume de injeção da amostra de 30 microlitros. Adquira espectros de massa em modos de ionização negativo e positivo alternados, com os parâmetros listados no protocolo textual. Para processar os dados de CLAE-EM, implemente os procedimentos de detecção de picos, alinhamento, preenchimento de lacunas e filtragem de picos utilizando um software adequado, como o software de código aberto M Zeta Mine, versão 2.14.

Importe os arquivos de texto resultantes para uma planilha. Isso produz uma matriz de dados na qual todos os metabólitos detectados, reconhecidos por um número de identificação, valor da razão massa/carga e tempo de retenção, são quantificados em todas as amostras em termos dos valores de suas áreas de pico. Prepare a montagem de hibridização com base nas especificações do formato de quatro pacotes, colocando 1,65 microgramas de RNA complementar marcado com cianina, em um volume final de 41,8 microlitros de água livre de RNAse e desionizada.

Adicione 11 microlitros de agente bloqueador 10X e 2,2 microlitros de tampão de fragmentação 25X. Incube a 60 graus Celsius por 30 minutos em banho termostático para fragmentar o RNA. Após 30 minutos, resfrie imediatamente em gelo por um minuto.

Finalmente, adicione 55 microlitros de tampão de hibridização 2X e misture bem por pipetagem. Após centrifugar por um minuto a 15.500 ×g em temperatura ambiente, coloque imediatamente o tubo de microcentrifugação no gelo. Para carregar o microarranjo personalizado, insira uma lâmina com vedação, com o rótulo voltado para cima, na base de uma câmara de hibridização.

Carregue lentamente 100 microlitros da amostra de hibridização em cada poço da junta, dispensando o líquido com a ponta de uma pipeta, evitando bolhas. Coloque lentamente o micro-arranjo personalizado com a face voltada para baixo, garantindo que o código de barras numérico esteja voltado para cima. Certifique-se de que o par em sanduíche esteja adequadamente alinhado.

Por fim, coloque a tampa da câmara de hibridização sobre as lâminas empilhadas e aperte manualmente o grampo na câmara. Gire a câmara montada para avaliar a mobilidade das bolhas. Coloque a câmara com as lâminas montada em uma rotisserie balanceada, dentro de uma estufa de hibridização ajustada a 65 graus celsius.

Configure o rotador para girar a 10 RPM. Deixe a hibridização prosseguir por 17 horas. Para prosseguir com a lavagem da lâmina de microarranjo, prepare três recipientes para coloração de lâminas e preencha-os com os tampões de lavagem apropriados.

Encha dois recipientes com o tampão de lavagem um, um à temperatura ambiente e outro com o tampão de lavagem dois pré-aquecido. Desmonte a câmara de hibridização e remova o sanduíche. Com o código de barras numérico do lâmina de microarranjo voltado para cima, submerja o sanduíche no primeiro recipiente para coloração preenchido com o tampão de lavagem um à temperatura ambiente e, com a ajuda de pinças limpas, separe a junta da lâmina de microarranjo.

Transfira rapidamente a lâmina de microarranjo para uma grade de lâminas e coloque-a na segunda cuba de coloração preenchida com tampão de lavagem um, à temperatura ambiente. Coloque a cuba de coloração sobre um agitador magnético e lave por um minuto com agitação moderada. Transfira rapidamente a grade de lâminas para a terceira cuba de coloração, preenchida com tampão de lavagem dois pré-aquecido, e lave por um minuto com agitação moderada.

Remova lentamente o suporte do recipiente de coloração de lâminas e retire cuidadosamente a lâmina do suporte, evitando gotículas. Coloque a lâmina de microarranjo em um escâner apropriado e escaneie cada arranjo utilizando as configurações de parâmetros recomendadas no manual de instruções do fabricante do microarranjo. Para preparar o software de análise estatística, primeiro importe os dados de metabolômica e transcriptômica.

Vá para Arquivo, Novo Projeto Regular, Novo Projeto Regular, para importar a matriz de dados obtida. Em seguida, clique em Editar. Transponha toda a matriz, início, e atribua o ID primário e secundário apropriados. E finalize.

Para realizar a análise estatística multivariada, acesse a janela Workset, selecione PCAX como o tipo de modelo e clique em AutoFit. Selecione Scores e, em seguida, Scatter, para visualizar o gráfico que mostra o agrupamento possível das amostras. Examine o gráfico de escores da PCA.

Se um bom modelo for obtido, utilize as mesmas classes de amostras para construir um modelo de análise discriminante O2PLS. Para construir dois modelos de análise discriminante O2PLS utilizando as amostras classificadas por MacroZone, atribua as classes acessando a janela Home, New As, M1 e Observations. Defina as classes desejadas.

Em seguida, altere o tipo de modelo de PCAX para análise discriminante O2PLS. Pressione Autofit. Prossiga para selecionar M2 na janela do Projeto e clique em Scores e depois em Scatter para visualizar o gráfico e a posição das classes das amostras.

Vá para Selecionar Tipo de Dados e selecione Observações e Cargas. Em seguida, clique em Adicionar Série e selecione os itens correlação PQ um e correlação PQ dois, ou outros componentes quando presentes. Com o botão direito do mouse pressionado sobre o gráfico, vá até Propriedade, selecione Cor e depois selecione Por Termos, para distinguir os símbolos do gráfico entre moléculas e classes.

Vá para Layout, Formatar Plotagem, Acesso e/ou Estilos para modificar o gráfico com as características desejadas. Para observar quais metabólitos caracterizam uma ou mais classes específicas, vá para Lista de Gráficos e, em seguida, Dispersão. A análise exploratória da matriz completa de dados por PCA mostrou que as amostras se agruparam de acordo com o estágio de amadurecimento, incluindo veraisão, amadurecimento médio e maduro, ao longo dos dois primeiros componentes principais.

As amostras agruparam-se de acordo com a estação de crescimento ao longo do terceiro componente principal. A análise discriminante O2PLS de bagas maduras permite a identificação de assinaturas específicas de terroir, representando as três macrozonas: Valpolicella, Lago de Garda e Soave. Os gráficos de cargas desses modelos são expressos como correlação PQ, a correlação entre P, a classe das amostras, e Q, os metabólitos.

Nos gráficos de carregamento, os quadrados vermelhos representam a classe de amostras ou macrozonas, e os triângulos coloridos representam os metabólitos individuais. Os metabólitos são codificados por cores de acordo com sua classe química, e a distância entre os metabólitos e as amostras reflete suas relações. A macrozona do Lago Garda foi caracterizada por estilbenos, enquanto Soave e Valpolicella foram marcados por flavonoides.

Dentre as antocianinas, a peonidina e seus derivados foram mais prevalentes na macrozona do Lago Garda, enquanto as demais antocianinas foram mais prevalentes na macrozona de Valpolicella. Além disso, as antocianinas três-O-glicosídeos foram mais prevalentes na macrozona de Valpolicella, enquanto derivados acilados e cumarilados foram mais prevalentes na macrozona de Soave. Métodos de transcriptômica, RA e RNA sig permitem monitorar simultaneamente milhares de transcritos da videira.

Um novo microarranjo personalizado foi recentemente desenvolvido e representa um número ainda maior de sondas, incluindo espécies adicionais recém-descobertas do gênero *Vitis*. Dada a rápida obsolescência das plataformas transcriptômicas, descrevemos um procedimento alternativo utilizando uma nova plataforma que contém mais sondas do que a anterior, incluindo 249 transcritos preditos de *peno* a mais, para 1392 locos de *peno* recentemente identificados, e 179 genes de *corvina prava*. A análise de metabolômica por CLAE-EMI-MS é sensível o suficiente para detectar simultaneamente um grande número de metabólitos.

A capacidade de criar um plano de amostragem é fundamental. A escolha de um único clone para minimizar as diferenças genéticas, juntamente com a realização de amostragens em múltiplas épocas, permitiu a identificação das diferenças reais entre os terroirs. Seria interessante comparar o mesmo cultivar cultivado em zonas menos ideais, mas, infelizmente, esses vinhedos não estavam disponíveis.