Name: O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a desenvolver um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares para medir a exposição humana a patógenos ambientais simultaneamente. Esta técnica acelera pesquisas em ciências da exposição.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Clarissa Curioso foi apoiada por meio de uma nomeação para o Programa de Participação em Pesquisa da Agência de Proteção Ambiental dos EUA, administrado pelo Instituto Oak Ridge de Ciência e Educação por meio de um acordo interagências entre o Departamento de Energia dos EUA e a EPA dos EUA.

A aprovação foi obtida a partir do Institutional Review Board (IRB # 08-1844, da Universidade da Carolina do Norte, Chapel Hill, NC, EUA) para a recolha de amostras de saliva crevicular estimulados de banhistas em Boquerón Beach, Puerto Rico, como parte dos Estados Unidos Environmental Protection Agency (EPA) epidemiológica Nacional e Avaliação ambiental de recreio (neear) Estudo de água 23 para avaliar as exposições e doenças de natação associado. Os sujeitos do estudo forneceu consentimento informado e foram instruídos sobre o uso do dispositivo de recolha de saliva por empreiteiros USEPA treinados. As amostras de saliva foram enviadas em gelo e, após a recepção, eles foram centrifugadas e armazenadas a -80 ° C como descrito 4. 1. A activação do grânulo <ol><li> Conjunto de esferas stocks Ressuspender por vórtex e ultrassons durante 20 segundos e transferência de aproximadamente 5,0 x 10 6 dos grânulos Stock (400 ul) a tubos de microcentrífuga. Nota: Tele grânulos são fornecidos a uma concentração de 12,5 x 10 6 contas / ml. </li><li> Sedimentar as pérolas de banco por centrifugação a 10000 xg durante 2 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas peletizadas em 100 ul de água destilada (dH2O) por vórtice e ultra-sons durante 20 seg. Repita o passo 1.2. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as esferas lavadas em 80 ul de 100 mM de fosfato de sódio monobásico, pH 6,2 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg. </li><li> Imediatamente antes da utilização, fazer uma solução 50 mg / ml de N -hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) por adição de 200 uL de dH2O de 10 mg, Sulfo-NHS alíquota. Misture por vórtice. </li><li> Adicionar 10 ul de 50 mg / ml de sulfo-NHS para os grânulos. Misture por vórtice. </li><li> Imediatamente antes da utilização, fazer uma de 50 mg / mL de 1-etil- [3dimethylaminopropyl] carbodiimida solução (EDC) de cloridrato por adição de 200 ul de água destilada (dH2O) para os 10 mg de EDC alíquota. Misture por vórtice. </li><li> Adicionar 10 ul de 50mg / ml solução EDC para os grânulos. Misture por vórtice. Incubar as contas durante 20 min à temperatura ambiente, no escuro, com agitação por vortex em intervalos de 10 min. Agregar as esferas activadas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 250 ul de ácido 2- 50 mM de [N-morfolino] etanossulfónico (MES), pH 5,0 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg. </li><li> Agregar as esferas activadas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min. </li><li> Repita os passos 1.9 e 1.10. Nota: Isto proporciona um total de duas lavagens com 50 mM de MES, pH 5,0. </li><li> Ressuspender as pérolas em 100 ul de 50 mM de MES, pH 5,0 por vórtice e ultra-sons durante 20 seg. </li></ol> 2. Bead Coupling <ol><li> Par os antigénios para os conjuntos de esferas usando as concentrações apresentadas na Tabela 1. </li><li> Adicionar cada antigénio para as esferas activadas e levar o volume total a 500 mL em MES 50 mM, pH 5,0. Misturar os antigénios umd grânulos por vortex. </li><li> Incubar os antigénios e os grânulos durante 2 horas, com mistura por rotação (~ 15 rpm) à temperatura ambiente no escuro. Agregar as esferas acopladas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as pérolas em 500 ul de salina tamponada com fosfato (PBS), albumina de soro -bovine (BSA) monolaurato -polyoxyethylenesorbitan (Tween-20) de sódio a azida (PBS-TBN) pH 7,4 por vórtice e sonicação. Sedimentar as pérolas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min e remove-se o sobrenadante. Cuidado: A azida de sódio é um produto químico altamente tóxico. É fatal se ingerido ou entra em contato com a pele. Não respirar as poeiras / fumos / gases / névoas / vapores ou spray. Use equipamento de proteção pessoal adequado (do PPE) ao manusear e descartar de acordo com as leis apropriadas. </li><li> Ressuspender as pérolas em 1 ml de PBS-TBN por vórtice e ultra-sons durante 20 seg. </li><li> Sedimentar as pérolas por microcentrifugação a 10000 xg durante 2 min. </li><li>Repita os passos 2.5 e 2.6. Nota: Isto proporciona um total de duas lavagens com PBS-TBN. </li><li> Ressuspender as esferas acopladas e lavadas em 1 ml de PBS, 1% BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Armazenar as esferas acopladas num refrigerador entre 2-8 ° C no escuro. </li></ol> 3. Contagem Bead <ol><li> Prepara-se uma diluição das pérolas acopladas em água ou tampão PBS 1:10. </li><li> Carga de 10 ul da diluição o grânulo em um hemocitómetro no ponto de introdução da amostra. </li><li> Contar as esferas visto em um dos 4 x 4 grelhas de canto. Calcular o número total de pérolas acoplado usando a seguinte fórmula: Contagem (uma esquina da grade 4 x 4) x (1 x 10 4) x (factor de diluição) x volume de ressuspensão em ml. </li></ol> 4. Confirmação do Antigen Coupling <ol><li> Ressuspender a mistura estoque de esferas acopladas a antígenos de interesse pelo vórtice e sonicação por 20 s. </li><li> Prepare uma mistura de pérolas para trabalhar diluindo os estoques talão acoplados a uma finalconcentração de 100 esferas / mL de cada grânulo único situado em tampão PBS-BSA a 1% (PBS-BSA a 1%, pH 7,4). </li><li> Preparar pelo menos duas 7 diluições em série de anti-IgG de espécies de anticorpo primário de acordo com as recomendações do fabricante em placa de 96 poços de fundo redondo com tampão PBS-BSA a 1%. </li><li> Pré-molhou uma coluna de oito poços separada (8 linhas) de uma placa de fundo de filtro de 96 poços para cada teste de confirmação de ligação de antigénio com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Adicionar 50 ul de mistura de pérolas para trabalhar (grânulos acoplado-antigénio) aos poços pré-molhado. </li><li> Adicionar 50 ul de diluições de anticorpos de linhas 1-7 de cada coluna da placa de filtro de 96 poços e 50 ul de tampão BSA a 1%, PBS a linha 8 no lugar de anticorpo diluído para servir como poços de fundo. Misture com uma pipeta multi-canal pipetando cima e para baixo 5 vezes. Execute o mesmo procedimento para cada conjunto de esferas acopladas-antigénio a ser confirmada. </li><li> Tampa e deixa-se incubar no escuro à tempratura durante 1 h num agitador de microplacas a 500 rpm. Remover o sobrenadante por aspiração. </li><li> Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repetir 1x. Ressuspender as esferas em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal. </li><li> Diluir biotinilados anti-espécies anticorpo de detecção secundário IgG específica para 16 ug / ml em PBS-BSA a 1%. </li><li> Adicionar 50 uL de anticorpo secundário diluído a cada poço, pipetando para cima e para baixo 5 vezes. </li><li> Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x. </li><li> Ressuspender as esferas em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal. </li><li> Diluir repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 ug / ml em PBS-BSA a 1%. </li><li> Adicionar 50 ul de repórter para cada poço e misture pipetando cima e para baixo 5 vezes. </li><li> Csobre a placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x. </li><li> Ressuspender as pérolas em 100 ul de PBS-BSA a 1% e analisar 50 ul usando o analisador 29. Nota: Os resultados do imunoensaio multiplex com base em grânulo são medidas de intensidade de fluorescência média (IFM). Sempre consulte a versão mais recente do manual do software, se disponível para evitar erros. </li></ol> 5. salivar Multiplex Immunoassay <ol><li> Remover saliva da -80 ° C congelador e deixa-se descongelar à temperatura ambiente. </li><li> antígeno Ressuspenda acoplado stocks talão por vórtice e sonicação por 20 s. </li><li> Prepara-se uma mistura de pérolas de trabalho por diluição das existências grânulo acoplados a uma concentração final de 100 esferas / mL de cada conjunto de esferas original em PBS-1% de BSA tampão. </li><li> Prepara-se uma diluição de 1: 4 de saliva Wom PBS-1 de tampão BSA% em um 96 bem, placa poço profundo. </li><li> placa de filtro pré-molhado com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. </li><li> Adicionar 50 ul de uma mistura de pérolas de trabalho e um volume igual de saliva diluída a 95 poços das placas de filtro de 96 poços para uma diluição de 1: 8 definitiva. Misture reacções com uma pipeta multi-canal. Para o controlo de uma cavidade, adicionar 50 grânulos acoplado-antigénio ul, mais 50 ul de PBS-1% BSA (tampão como um substituto para a saliva). </li><li> Tampa e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 1 h num agitador de microplacas a 500 rpm. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x. </li><li> grânulos Ressuspender em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal. </li><li> Dilui-se o anticorpo de detecção secundário anti-IgG humano de cabra biotinilado a 16 ug / ml em PBS-BSA a 1%. </li><li> Adicionar 50 ul de anticorpo secundário diluído a cada poço e misturar o conteúdo comuma pipeta multi-canal. </li><li> Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x. </li><li> grânulos Ressuspender em 50 ul de PBS-BSA a 1% com uma pipeta de multi-canal. </li><li> Diluir repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 ug / ml em PBS-BSA a 1%. </li><li> Adicionar 50 ul repórter a cada poço e misture com uma pipeta multi-canal. </li><li> Cubra placa de filtro e deixa-se incubar no escuro à temperatura ambiente durante 30 min num agitador de placas. Remover o sobrenadante por aspiração. Lavar os poços com 100 ul de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por aspiração. Repita lavagem 1x. </li><li> Ressuspender as pérolas em 100 ul de PBS-BSA a 1% e analisar 50 ul usando o analisador 29. Nota: Os resultados do imunoensaio multiplex são medidos em unidades Mediana intensidade de fluorescência (MFI). Consulte sempre oa versão mais recente do manual de software, se disponível para evitar erros. </li></ol>

<ol><li>Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPr%C3%BCss-%C3%9Cst%C3%BCn%2C+A+%22Safer+water%2C+better+health%3A+costs%2C+benefits+and+sustainability+of+interventions+to+protect+and+promote+health%22">Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health</a>. , World Health Organization. Geneva. (2008).</li>
<li>Augustine, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+approaches+to+developing+a+multiplex+immunoassay+for+determining+human+exposure+to+environmental+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical approaches to developing a multiplex immunoassay for determining human exposure to environmental pathogens.</a> J Immunol Methods. 425, 1-9 (2015).</li>
<li>Griffin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+salivary+antibody+immunoassays+for+the+detection+of+incident+infections+with+Norwalk+virus+in+a+group+of+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of salivary antibody immunoassays for the detection of incident infections with Norwalk virus in a group of volunteers.</a> J Immunol Methods. 424, 53-63 (2015).</li>
<li>Griffin, S., Chen, I., Fout, G., Wade, T., Egorov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multiplex+microsphere+immunoassay+for+the+quantitation+of+salivary+antibody+responses+to+selected+waterborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a multiplex microsphere immunoassay for the quantitation of salivary antibody responses to selected waterborne pathogens.</a> J Immunol Methods. 364 (1-2), 83-93 (2011).</li>
<li>Ferguson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Current diagnostic uses of saliva.</a> J Dent Res. 66, 420-424 (1987).</li>
<li>Mandel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+uses+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Pathol+Med%22%5BJournal%5D)">The diagnostic uses of saliva.</a> J Oral Pathol Med. 19, 119-125 (1990).</li>
<li>Malamud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+as+a+Diagnostic+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+J%22%5BJournal%5D)">Saliva as a Diagnostic Fluid.</a> Brit Med J. 305, 207-208 (1992).</li>
<li>Ballam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+is+useful+in+the+salivary+diagnosis+of+Helicobacter+pylori+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Western blotting is useful in the salivary diagnosis of Helicobacter pylori infection.</a> J Clin Pathol. 53, 314-317 (2000).</li>
<li>Estevez, P., Satoguina, J., Nwakanma, D., West, S., Conway, D., Drakeley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva+as+a+source+of+anti-malarial+antibodies+to+examine+population+exposure+to+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Human saliva as a source of anti-malarial antibodies to examine population exposure to Plasmodium falciparum.</a> Malar J. 10, 104(2011).</li>
<li>Abd-Alla, M., Jackson, T., Reddy, S., Ravdin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+invasive+amebiasis+by+enzyme-linked+immunosorbent+assay+of+saliva+to+detect+amebic+lectin+antigen+and+anti-lectin+immunoglobulin+G+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of invasive amebiasis by enzyme-linked immunosorbent assay of saliva to detect amebic lectin antigen and anti-lectin immunoglobulin G antibodies.</a> J Clin Microbiol. 38 (6), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Toyoguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reactivity+to+Cryptosporidium+parvum+in+saliva+of+calves+after+experimental+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody reactivity to Cryptosporidium parvum in saliva of calves after experimental infection.</a> J Vet Med Sci. 62 (11), 1231-1234 (2000).</li>
<li>Choo, S., Zhang, Q., Seymour, L., Akhtar, S., Finn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+and+booster+salivary+antibody+responses+to+a+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+infants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Primary and booster salivary antibody responses to a 7-valent pneumococcal conjugate vaccine in infants.</a> J Infect Dis. 182 (4), 1260-1263 (2000).</li>
<li>Tourinho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+cutoff+ratio+for+detecting+antibodies+against+hepatitis+A+virus+in+oral+fluids+by+enzyme+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Importance of the cutoff ratio for detecting antibodies against hepatitis A virus in oral fluids by enzyme immunoassay.</a> J Virol Methods. 173 (2), 169-174 (2011).</li>
<li>Moorthy, M., Daniel, H., Kurian, G., Abraham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+saliva+as+an+alternative+to+plasma+for+the+detection+of+hepatitis+C+virus+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An evaluation of saliva as an alternative to plasma for the detection of hepatitis C virus antibodies.</a> Indian J Med Microbiol. 26 (4), 327-332 (2008).</li>
<li>Moe, C., Sair, A., Lindesmith, L., Estes, M., Jaykus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+norwalk+virus+infection+by+indirect+enzyme+immunoassay+detection+of+salivary+antibodies+to+recombinant+norwalk+virus+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of norwalk virus infection by indirect enzyme immunoassay detection of salivary antibodies to recombinant norwalk virus antigen.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1028-1034 (2004).</li>
<li>Yap, G., Sil, B., Ng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+saliva+for+early+dengue+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Use of saliva for early dengue diagnosis.</a> PLoS Negl Trop Dis. 5 (5), e1046(2011).</li>
<li>Schramm, W., Angulo, G., Torres, P., Burgess-Cassler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+saliva-based+test+for+detecting+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simple saliva-based test for detecting antibodies to human immunodeficiency virus.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 6 (4), 577-580 (1999).</li>
<li>Chart, H., Perry, N., Willshaw, G., Cheasty, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+saliva+for+antibodies+to+the+LPS+of+Escherichia+coli+O157+in+patients+with+serum+antibodies+to+E.+coli+O157+LPS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of saliva for antibodies to the LPS of Escherichia coli O157 in patients with serum antibodies to E. coli O157 LPS.</a> J Med Microbiol. 52 (Pt 7), 569-572 (2003).</li>
<li>Ashbolt, N., Bruno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+and+refinement+of+the+WHO+risk+framework+for+recreational+waters+in+Sydney%2C+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Application and refinement of the WHO risk framework for recreational waters in Sydney, Australia.</a> J Water Health. 1 (3), 125-131 (2003).</li>
<li>Westrell, T., Schonning, C., Stenstrom, T., Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QMRA+%28quantitative+microbial+risk+assessment%29+and+HACCP+%28hazard+analysis+and+critical+control+points%29+for+management+of+pathogens+in+wastewater+and+sewage+sludge+treatment+and+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">QMRA (quantitative microbial risk assessment) and HACCP (hazard analysis and critical control points) for management of pathogens in wastewater and sewage sludge treatment and reuse.</a> Water Sci Technol. 50 (2), 23-30 (2004).</li>
<li>Ashbolt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+drinking+water+and+disease+outcomes+in+developing+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions.</a> Toxicology. 198 (1-3), 229-238 (2004).</li>
<li>Eisenberg, J., Soller, J., Scott, J., Eisenberg, D., Colford, J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+model+to+assess+microbial+health+risks+associated+with+beneficial+uses+of+biosolids%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">A dynamic model to assess microbial health risks associated with beneficial uses of biosolids.</a> Risk Anal. 24, 221-236 (2004).</li>
<li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWade%2C+TJ+%22Report+on+2009+National+Epidemiologic+and+Environmental+Assessment+of+Recreational+Water+Epidemiology+Studies%2C+US+EPA.+US+EPA+Report+Number%3A+EPA%2F600%2FR-10%2F168%3A+US+EPA2011%22">Report on 2009 National Epidemiologic and Environmental Assessment of Recreational Water Epidemiology Studies, US EPA. US EPA Report Number: EPA/600/R-10/168: US EPA2011</a>. , (2011).</li>
<li>Fujii, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+surveillance+development+for+tropical+infectious+diseases+using+simultaneous+microsphere-based+multiplex+assays+and+finite+mixture+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Serological surveillance development for tropical infectious diseases using simultaneous microsphere-based multiplex assays and finite mixture models.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8, e3040(2014).</li>
<li>Rota, M., Massari, M., Gabutti, G., Guido, M., De Donno, A., Ciofi degli Atti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measles+serological+survey+in+the+Italian+population%3A+interpretation+of+results+using+mixture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Measles serological survey in the Italian population: interpretation of results using mixture model.</a> Vaccine. 26 (34), 4403-4409 (2008).</li>
<li>Vyse, A., Gay, N., Hesketh, L., Pebody, R., Morgan-Capner, P., Miller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+serological+surveys+using+mixture+models%3A+the+seroepidemiology+of+measles%2C+mumps+and+rubella+in+England+and+Wales+at+the+beginning+of+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Interpreting serological surveys using mixture models: the seroepidemiology of measles, mumps and rubella in England and Wales at the beginning of the 21st century.</a> Epidemiol Infect. 134 (6), 1303-1312 (2006).</li>
<li>Baughman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+diagnostic+cutoff+points+for+levels+of+serum+antibodies+to+pertussis+toxin%2C+filamentous+hemagglutinin%2C+and+fimbriae+in+adolescents+and+adults+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 11 (6), 1045-1053 (2004).</li>
<li>Clotilde, L., Bernard, C. IV, Hartman, G., Lau, D., Carter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbead-based+immunoassay+for+simultaneous+detection+of+Shiga+toxins+and+isolation+of+Escherichia+coli+O157+in+foods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation of Escherichia coli O157 in foods.</a> J Food Prot. 74 (3), 373-379 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Luminex+User+Software+Manual+%28RUO%29+xPONENT+3.1+Rev.+2%22">Luminex User Software Manual (RUO) xPONENT 3.1 Rev. 2</a>. 3, 6-102 (2014).</li>
<li>Waterboer, T., Sehr, P., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+non-specific+binding+in+serological+Luminex+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Suppression of non-specific binding in serological Luminex assays.</a> J Immunol Methods. 309 (1-2), 200-204 (2006).</li>
</ol>

A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos através do seu Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento financiada e gerida a pesquisa descrita aqui. Ele foi submetido a revisão administrativa da Agência e aprovado para publicação. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais não constitui endosso ou recomendação para o uso.

Estes resultados indicam que o método de imunoensaio em multiplex é útil para discriminar entre amostras de saliva que são imunopositivos ou immunonegative. Para determinar imunopositividade, um único ponto de corte foi desenvolvido através do cálculo da média mais três desvios-padrão do log transformado respostas IFM dos cordões desacoplados de controle testados com todas as amostras de saliva. O ponto de corte proporcionou a capacidade de avaliar a exposição e immunoprevalence a qualquer um único ou vários patógenos. ...

Oitenta e oito por cento das doenças relacionadas com a diarreia em todo o mundo está associada à exposição humana à água contaminada, alimentos não seguros, e falta de saneamento / higiene, causando cerca de 1,5 milhões de mortes, a maioria dos quais são crianças 1. Esta é uma das principais causas de preocupação para os funcionários de saúde pública e os decisores políticos. Em um esforço para investigar exposições e doenças associadas à base de água e de outros patógenos ambientais, foi desenvolvido um imunoensaio multiplex para medir anticorpos em amostras humanas 2-4. Este método pode ser aplicado a estudos epidemiológicos para determinar a exposição humana para estes agentes patogénicos e para melhor definir e infecções immunoprevalence incidentes. Saliva é uma promessa considerável como uma alternativa ao soro para pesquisa com biomarcadores humano. Entre as vantagens da utilização de saliva são os não-invasivo e facilidade de recolha de amostras, de baixo custo, e as amostras podem ser facilmente obtidas de crianças 5-7 &lt;/ Sup&gt;. As amostras de soro e saliva foram estudados extensivamente para anticorpos contra H. pylori 2,3,8, Plasmodium falciparum 9, Entamoeba histolytica 10, Cryptosporidium parvum 3,11, Streptococcus pneumonia 12, vírus da hepatite A e C 13-14, noroviruses 2-4,15, T. gondii 2-4, vírus da dengue 16, o vírus da imunodeficiência humana (VIH) 17, e Escherichia coli O157: H7 18. Um imunoensaio em multiplex permite a análise de múltiplos analitos em simultâneo dentro de um único volume de amostra e dentro de um único ciclo ou correr. Antígenos multiplexados de C. jejuni, T. gondii, H. pylori, vírus da hepatite A, e duas noroviruses foram usadas para medir humano IgG salivar 4/2 e IgA IgG no plasma 3,4 e 2,3 respostas de anticorpos para estes agentes patogénicos usando um-Grânulo baseado imunoensaio multiplexação. Quando usado em conjunto com estudos epidemiológicos de exposição a micróbios em água, solo e dos alimentos, do tipo de ensaio descrito neste estudo pode fornecer informação valiosa para melhorar a compreensão de infecções causadas por agentes patogénicos ambientais. Além disso, os dados obtidos a partir de anticorpos salivares tais estudos pode ser usada para melhorar os modelos de avaliação do risco 19-22.

<table><tbody><tr><td>Equipamento e Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>75002446</td><td>Utilizado para centrifugar amostras</td></tr><tr><td>Misturador de vórtices</td><td>VWR</td><td>G560</td><td>Utilizado para misturar amostras</td></tr><tr><td>Sonicator (mini)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-337-22</td><td>Utilizado para separar esferas</td></tr><tr><td>Pipetadores P10, P20, P100, P1000, 8 ch. </td><td>Capp</td><td>Vários</td><td></td></tr><tr><td>Hemacitômetros (Linha Brilhante)</td><td>Housser Scientific&nbsp;</td><td>3200</td><td>Usado para contar contas acopladas</td></tr><tr><td>Coletor de vácuo multitela</td><td>Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Usado em etapas de lavagem para remover o sobrenadante</td></tr><tr><td>MicroShaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td>Usado para agitar contas durante incubações</td></tr><tr><td>Suporte para tubos (1,5 ml e 0,5 ml) (sortido)</td><td>VWR</td><td>30128-346</td><td></td></tr><tr><td>Balança</td><td>Mettler ou outro</td><td></td><td>Usado para medir reagentes de lavagem para fazer tampões</td></tr><tr><td>Misturador de amostras Dynabead</td><td>Invitrogen</td><td>947-01</td><td>Usado durante a etapa de incubação do acoplamento</td></tr><tr><td>MatLab (R2014b)</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td></td><td>Usado para analisar dados de resposta de anticorpos</td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2014</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>Usado para analisar dados de resposta de anticorpos</td></tr><tr><td>Luminex Analyzer com software xPonent 3.1</td><td>Luminex Corporation</td><td>LX200-XPON3.1</td><td>Instrumento e software usados para executar</td></tr> <tr><td>ensaiosAntigens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GI.1 Vírus Norwalk: partícula p</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>GII.4 Norovírus VA387: partícula p</td><td>Xi Jiang (CCHMC)*</td><td>NA</td><td>*Hospital Infantil de Cincinnati. Conc. final 5 &micro;g.</td></tr><tr><td>Vírus da hepatite A: concentrado de grau II de cultura de células</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>8505</td><td>Antígeno acoplado a 100 &micro; g</td></tr><tr><td>Helicobacter pylori: lisado</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R14101</td><td>Antígeno acoplado a 25 &micro; g</td></tr><tr><td>Toxoplasma gondii: p30 recombinante (SAG1)</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>R18426</td><td>Antígeno acoplado a 25 &micro; g</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni: células inteiras mortas pelo calor</td><td>KPL</td><td>50-92-93</td><td>Antígeno acoplado a 50 &micro; g</td></tr><tr><td>Anticorpos primários</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guinea pig anti-Norovirus</td><td>(CCHMC)*</td><td>NA</td><td>Usado para confirmação de acoplamento</td></tr><tr><td>Camundongo anti-hepatite A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Usado para confirmação de acoplamento</td></tr><tr><td>Camundongo anti-hepatite A IgG</td><td>Meridian Life Sciences</td><td>C65885M</td><td>Usado para confirmação de acoplamento</td></tr><tr><td>Anticorpo purificado BacTraceAffinity para Helicobacter pylori</td><td>KPL</td><td>01-93-94</td><td>Usado para confirmação de acoplamento</td></tr><tr><td>PAb de cabra para Toxoplasma gondii</td><td>Abcam</td><td>Ab23507</td><td>Usado para confirmação de acoplamento</td></tr><tr><td>BacTrace Cabra anti-Campylobacter espécie</td><td>KPL</td><td>01-92-93</td><td>Usado para confirmação</td></tr> <tr><td>de acoplamento<forte>Secundário&nbsp; Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP-Conjugado AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>705-065-149</td><td>Usado para confirmação de acoplamento</td></tr><tr><td>Coelho biotinilado anti-Goat IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-13-06</td><td>Usado para confirmação de acoplamento</td></tr><tr><td>Cabra biotinilada anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>16-18-06</td><td>Usado para confirmação</td></tr> <tr><td>de acoplamentoAfinidade Purificada Anticorpo Biotina Rotulado Cabra anti-Coelho IgG (H+L)</td><td>KPL</td><td>176-1506</td><td>Usado para confirmação de acoplamento</td></tr><tr><td><forte>Consumíveis</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de copolímero de 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>Usado como tubos de microcentrífuga de baixa ligação</td></tr><tr><td>10 &micro; l recargas de ponteira de pipeta</td><td>BioVentures</td><td>5030050C</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l recargas de ponteira de pipeta</td><td>BioVentures</td><td>5030080C</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &micro; l recargas de ponta de pipeta</td><td>BioVentures</td><td>5130140C</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Vários fornecedores</td><td></td><td>Usado manter as contas no escuro durante as incubações</td></tr><tr><td>Placas de poços profundos</td><td>VWR</td><td>40002-009</td><td>Usado para diluir amostras de saliva</td></tr><tr><td>Placas de filtro multitela</td><td>Millipore</td><td>MABVN1250</td><td>Usado para executar ensaios</td></tr><tr><td>Sistema de coleta de saliva Oracol</td><td>Malvern Medical Desenvolvimentos Limitados</td><td></td><td>Usado para coleta</td></tr> <tr><td>de saliva<forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microesferas carboxiladas (grânulos)</td><td>Luminex Corporation</td><td>Dependente do conjunto de grânulos</td> Os <td>antígenos são acoplados às microesferas</td></tr><tr><td>EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida)</td><td>Pierce</td><td>77149 ou 22980</td><td>Usado na ativação</td></tr> <tr><td>do grânuloSulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)</td><td>Pierce</td><td>24510</td><td>Usado na ativação do grânulo</td></tr><tr><td>Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml)</td><td>Sondas Moleculares</td><td>S-866</td><td>Usado como repórter</td></tr><tr><td>MES (ácido 2-[N-Morpholino]etanossulfônico)</td><td>Sigma</td><td>M-2933</td><td>Usado para acoplamento</td></tr><tr><td>Tween-20 (monolaurato de polioxietilenoorbitano)</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>Usado no tampão de lavagem para remover tampões de <> ligação não específicos</td></tr><tr><td>< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< forte > PBS-TBN Buffer de bloqueio / armazenamento (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azida, pH 7,4) < / forte > **</td><td></td><td></td> <td>Filtro Esterilize e armazene a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3813</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-7888</td><td>0,1% (p/v)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P-9416</td><td>0,2% (v/v)</td></tr><tr><td>Azida de sódio (0,05% azida)**</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td>**<forte>Cuidado</forte>: A azida de sódio é agudamente tóxica. Evite o contato com a pele e os olhos. Use EPIs apropriados. Descarte de acordo com as leis aplicáveis.</td></tr><tr><td>MES/Tampão de acoplamento (0.05 M MES, pH 5.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES (2-[N-Morpholino]ácido etanossulfônico)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de ensaio (PBS, 1% BSA, pH 7.4)&nbsp; < / forte ></td><td></td><td></td> <td>Filtro Esterilize e armazene a 4 graus; C</td></tr><tr><td>PBS, 1% BSA, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3688</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA</td></tr><tr><td>Activation Buffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2) < / forte ></td><td></td><td></td> <td>Filtro Esterilize e armazene a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (fosfato de sódio, anidro monobásico)</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td>0,1 M NaH2PO4</td></tr><tr><td>5 N NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>Filter Esterilize e armazene a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>P-3563</td><td>138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN</td></tr></tbody></table>

o desenvolvimento de uma salivar antibody multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

A etiologia e os impactos da exposição humana aos patógenos ambientais são uma grande preocupação no mundo inteiro e, assim, a capacidade de avaliar a exposição e infecções usando rentáveis, abordagens de alto rendimento seria indispensável. Este manuscrito descreve o desenvolvimento e análise de um imunoensaio baseado em multiplex-grânulo capaz de medir a presença de anticorpos na saliva humana a vários patógenos simultaneamente. Saliva é particularmente atraente nesta aplicação porque é não-invasivo, mais barato e mais fácil de recolher além do soro. Os antigénios de agentes patogénicos ambientais foram acoplados a microesferas carboxiladas (grânulos) e utilizado para medir os anticorpos em volumes muito pequenos de amostras de saliva humana utilizando um ensaio solução-fase à base de grânulo. As esferas foram acoplados com antígenos de Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovírus (G I.1 e G II.4) e vírus da hepatite A. Para assegurar que os antigénios foram suficientemente acoplado aas contas, o acoplamento foi confirmada usando, anticorpos de captura primária de origem animal espécie-específicos, seguido de incubação com biotinilados anti-espécies anticorpos de detecção secundárias e repórter estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE). Como um controlo para medir a ligação não específica, um conjunto de esferas foi tratada de forma idêntica aos outros, excepto que não foi acoplado a qualquer antigénio. As esferas juntamente com antigénio e de controlo foram então incubados com amostras de saliva humana prospectivamente-recolhidos, medido num analisador de alto rendimento com base nos princípios de citometria de fluxo, e a presença de anticorpos para cada antigénio foi medida em unidades de intensidade média de fluorescência (IMF) . Este imunoensaio multiplex tem um número de vantagens, incluindo mais dados com menos de amostra; redução de custos e de trabalho; e a capacidade de personalizar o ensaio para muitos alvos de interesse. Os resultados indicam que o imunoensaio multiplex salivar pode ser capaz de identificar as exposições e infecções anteriores, que pode ser especially útil em estudos de vigilância envolvendo grandes populações humanas.

Um conjunto de esferas original foi utilizado como um controlo para medir a ligação não específica e amostra para amostra variabilidade. Estas esferas foram tratadas de forma idêntica ao antigénio esferas acopladas com a excepção de que não foram incubadas com qualquer antigénio no passo de acoplamento. IFM valores&gt; 500 obtidos a partir das esferas de controlo incubadas com todas as amostras de saliva foram retirados da análise ainda mais devido à suspeita de contaminação do soro e as...

No atual clima de escassez de recursos, estão surgindo novas tecnologias que permitem aos pesquisadores realizar estudos de forma mais barata, rápida e precisa. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares baseado em esferas para medir a exposição humana a vários patógenos ambientais simultaneamente.

O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

O objetivo geral deste ensaio imunológico multiplex baseado em microesferas para anticorpos salivares é identificar os agentes etiológicos responsáveis por doenças sintomáticas e assintomáticas associadas ao meio ambiente, mediante a medição simultânea das respostas de anticorpos IGG contra múltiplos patógenos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da ciência da exposição. Por exemplo, quais patógenos são responsáveis por causar doenças em populações específicas.A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para medir rapidamente e de forma econômica anticorpos contra múltiplas análises ao mesmo tempo, utilizando volumes de amostra muito pequenos. Este método pode fornecer informações sobre agentes etiológicos e suas fontes de exposição, incluindo vias transmitidas por alimentos, água e pelo ar. A demonstração oficial deste procedimento é fundamental, pois, se ele não for configurado corretamente, os resultados podem ser pouco confiáveis.Inicie agitando em vórtex e sonicando as misturas estoque de microesferas conjugadas aos antígenos de interesse por 20 segundos de cada vez, a fim de gerar suspensões homogêneas de microesferas. Em seguida, dilua os estoques de microesferas conjugadas para uma concentração final de 100 microesferas por microlitro de cada conjunto distinto de microesferas em PBS, suplementado com 1% de BSA. A seguir, prepare pelo menos sete diluições seriadas em duplicata do anticorpo primário anti-IgG da espécie, em PBS acrescido de BSA, em uma placa de fundo redondo com 96 poços, conforme as recomendações do fabricante.Umedeça previamente uma coluna separada de oito por 12 de uma placa de filtro de 96 poços para cada teste de confirmação de acoplamento de antígeno com 100 microlitros de tampão de lavagem e remova o sobrenadante por vácuo. Em seguida, adicione 50 microlitros das microesferas conjugadas ao antígeno aos poços previamente umedecidos, juntamente com 50 microlitros do anticorpo diluído em série nas linhas um a sete da placa de filtro de 96 poços, e adicione 50 microlitros de PBS com BSA na linha oito como controle de fundo do anticorpo diluído. Utilize uma pipeta multicanal para misturar o conteúdo de cada poço para cima e para baixo cinco vezes.Em seguida, cubra a placa e incube os anticorpos com as microesferas conjugadas ao antígeno no escuro, à temperatura ambiente, em um agitador para microplacas a 500 rpm. Após uma hora, aspire o sobrenatante e lave as cavidades com duas alíquotas de 100 microlitros de tampão de lavagem. Após a segunda lavagem, substitua o tampão por 50 microlitros de PBS contendo BSA.Agora dilua o anticorpo secundário de detecção anti-IgG específica da espécie biotinilado a 16 microgramas por mililitro em PBS com BSA e adicione 50 microlitros do anticorpo secundário diluído em cada linha. Incube as microesferas e os anticorpos à temperatura ambiente, no escuro, durante 30 minutos em um agitador de placas. Ao final da incubação, aspire o sobrenadante e lave as microesferas com duas alíquotas de 100 microlitros de tampão de lavagem.Após a segunda lavagem, re-suspenda as microesferas em 50 microlitros de PBS com BSA e dilua o marcador estreptavidina r-ficoeritrina a 24 microgramas por mililitro em PBS com BSA. Adicione 50 microlitros do marcador a cada poço e misture por pipetagem. Incube a placa no escuro durante 30 minutos à temperatura ambiente em agitador, seguido de duas lavagens com 100 microlitros de tampão de lavagem, conforme demonstrado.Em seguida, re-suspenda as microesferas em 100 microlitros de PBS com BSA e avalie as microesferas conjugadas com antígeno no analisador. Após re-suspender os estoques de microesferas conjugadas por vortex e sonicação por 20 segundos, dilua os estoques de microesferas conjugadas para uma concentração final de 100 microesferas por microlitro de cada conjunto distinto de microesferas em PBS com BSA. Em seguida, prepare uma diluição de um para quatro de saliva à temperatura ambiente em PBS com BSA em uma placa de 96 poços com fundo profundo.Umedeça previamente uma placa de filtro com 100 microlitros de solução de lavagem e aspire o sobrenadante. Em seguida, adicione 50 microlitros de microesferas conjugadas ao antígeno e um volume igual de saliva diluída a 95 poços de uma placa de filtro de 96 poços, para uma diluição final de um a oito. Ao mesmo tempo, adicione 50 microlitros de microesferas conjugadas ao antígeno e 50 microlitros de PBS com BSA apenas ao poço controle.Incube as microesferas no escuro, em temperatura ambiente, durante uma hora no agitador de microplacas a 500 rpm. Em seguida, aspire o sobrenadante e lave as cavidades duas vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem. Após a segunda lavagem, re-suspenda as microesferas em 50 microlitros de PBS com BSA.Dilua o anticorpo secundário e adicione 50 microlitros dele em cada poço. Após misturar o conteúdo dos poços com uma pipeta multicanal, incube a placa no agitador no escuro por 30 minutos à temperatura ambiente, depois lave os poços duas vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem e re-suspenda os marcadores em 50 microlitros de PBS fresco mais BSA. Agora dilua o marcador e adicione 50 microlitros em cada poço.Misture bem com uma pipeta multicanal. Após 30 minutos em temperatura ambiente sob agitação e no escuro, lave as placas duas vezes conforme demonstrado, depois re-suspenda as microesferas em 100 microlitros de PBS com BSA e avalie as amostras no analisador. Para garantir que as microesferas conjugadas ao antígeno sejam capazes de atingir a faixa dinâmica do ensaio, o conjugado adequado é definido como uma intensidade de fluorescência média maior ou igual a 18.000.Como demonstrado nessas confirmações representativas do acoplamento dos antígenos no ensaio para C.jejuni e T.gondii. Com base no ponto de corte estabelecido, as taxas de imunoprevalência para as amostras variaram de cerca de 2% para T.gondii a quase 50% para o genogrupo 1.1 do Norovírus, indicando que a taxa de imunoprevalência foi mais alta para os Norovírus, seguida pela Hepatite A e H. pylori. Enquanto 32% das amostras foram imunonegativas para todos os patógenos no ensaio, 68% foram imunopositivas para um ou mais patógenos.Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em cerca de quatro horas, se realizado corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante manter as esferas no escuro para evitar o clareamento fotônico. Após este procedimento, outros métodos como ELISAs e Western Blotting podem ser utilizados para responder perguntas adicionais sobre sensibilidade e especificidade.Além da reatividade cruzada dos anticorpos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de epidemiologia, ciência da exposição e microbiologia clínica explorarem os riscos para humanos decorrentes de exposições ambientais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão muito clara de como desenvolver, analisar e interpretar os resultados de um ensaio imunológico multiplex, que mede anticorpos contra múltiplos patógenos simultaneamente.Não se esqueça de que trabalhar com fluidos corporais e azida de sódio pode ser extremamente perigoso, e que precauções, como o uso de equipamento de proteção individual apropriado e a correta eliminação dos reagentes, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

developing-salivary-antibody-multiplex-immunoassay-to-measure-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

Este vídeo demonstra uma técnica de imunoensaio multiplex baseada em esferas para detectar simultaneamente anticorpos para vários patógenos ambientais na saliva humana. Grânulos fluorescentes foram acoplados a antígenos de diferentes patógenos, que foram capturados usando anticorpos na amostra de saliva humana. Ao marcar os anticorpos usando um repórter fluorescente, as esferas foram analisadas usando citometria de fluxo para avaliar a presença de diferentes anticorpos específicos do patógeno...

Um imunoensaio multiplex baseado em esferas para identificar anticorpos específicos de patógenos na saliva

Nós descrevemos um procedimento para perfilar proteínas salivares usando multiplexados matrizes à base de microesferas de anticorpos. Os anticorpos monoclonais foram covalentemente ligados para 4,5 mM microesferas fluorescentes polímero codificado-dye usando química carbodiimida. As microesferas modificadas foram depositados em micropoços de fibra óptica para medir os níveis de proteína na saliva usando imunoensaios sanduíche de fluorescência.

Multiplexado fluorescente Microarray para análise de proteína salivar humana Usando Polymer Microesferas e Pacotes de fibra óptica

Este protocolo descreve uma técnica não-invasiva para a amostragem de líquido imperturbado mucosa das vias aéreas superiores. Ele pode ser usado para realizar a quantificação dos níveis na vivo de mediadores de proteína, tais como citocinas e quimiocinas, em indivíduos de todas as idades.

Amostragem não-invasiva de mucosa líquido para a quantificação dos níveis de imune-mediador na Vivo das vias aéreas superiores

Aqui nós apresentamos um protocolo para descrever o desenvolvimento e validação de uma única molécula matriz digital ensaio de ELISA, que permite a detecção de ultra sensível de todos os subtipos de IFN-α em amostras humanas.

Desenvolvimento e validação de uma única molécula ultra-sensível de matriz Digital ensaio imunossorvente ligado à enzima para humana Interferon-α

Este trabalho apresenta um protocolo para a detecção de imunoglobulina soro específico E com um sistema de cartucho-baseado da quimioluminescência microfluídicos e a avaliação de sua utilidade no diagnóstico de alergia.

Aplicação da tecnologia de Microfluidic Biochip para detectar soro alérgeno-específicas E de imunoglobulina (sIgE)

Nós apresentamos um protocolo para usar um microarray da proteína construído imprimindo antígenos da gripe em corrediças nitrocelulose-revestidas para sonda simultaneamente o soro para isotipos múltiplos do anticorpo de encontro a mais de 250 antígenos das tensões diferentes do vírus, assim permitindo a medida da amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus.

Uso de um microarray do antígeno da gripe para medir a amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus

Um sistema de análise de fluxo para ensaios multiplexados baseados em contas que fornece uma leitura de dois repórteres foi usado para o desenvolvimento de ensaios sorológicos e de neutralização de anticorpos multiplex que podem medir simultaneamente anticorpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Um teste de neutralização rápido e multiplex dual reporter IgG e IgM SARS-CoV-2 para um sistema de análise de fluxo baseado em contas multiplexadas

Este artigo descreve um método conveniente para monitorar mudanças dinâmicas em tituladores de anticorpos para dois isótipos de imunoglobulina simultaneamente (IgA, IgM ou IgG) resultante de uma resposta imune à infecção ou vacinação SARS-CoV-2. Este 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' emprega três imunoensaias indiretas baseadas em microesferas codificadas que são lidas usando um leitor multiplex baseado em fluxo com capacidade de 'canal duplo'.

Monitoramento Dinâmico da Soroconversão usando um Ensaio de Imunobead Multianalyte para Covid-19

Um sistema de análise de fluxo de fluorescência de três canais de duplo repórter foi usado para desenvolver um imunoensaio multiplex baseado em esferas que avalia simultaneamente amostras de soro para IgG e IgM eliciadas contra múltiplos antígenos de diferentes espécies de Borrelia que causam borreliose de Lyme na Europa e América do Norte.

Detecção Simultânea de Diferentes Classes de Anticorpos em um Teste Sorológico Multiplexado

Os imunoensaios de fluorescência multiplex estão se tornando uma referência para testes sorológicos. Sua aplicação, no entanto, é limitada pela complexidade e pelos demorados processos de acoplamento de analitos de esferas. Este relatório apresenta um protocolo de acoplamento de esferas de microesferas multiplex semiautomatizado e reprodutível que é comparável ao método padrão, reduzindo consideravelmente o tempo de resultados.

Um ensaio sorológico multiplex para a detecção de respostas de anticorpos a arbovírus

Aprenda a desenvolver um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares para medir a exposição humana a patógenos ambientais simultaneamente. Esta técnica acelera pesquisas em ciências da exposição.

O desenvolvimento de uma salivar Antibody Multiplex imunoensaio para medir a exposição humana a patógenos ambientais

Explorar mais vídeos