Determinação das espécies e quantificação de misturas utilizando MRM Espectrometria de Massa de peptídeos Aplicada à autenticação Meat

O objetivo geral deste método é usar espectrometria de massa de monitoramento de reação múltipla para identificar e quantificar as espécies presentes em misturas de carne crua para uso como uma ferramenta para detecção de fraude alimentar. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da integridade alimentar, como confirmar as espécies presentes em produtos como salsichas ou hambúrgueres. Nossa abordagem é baseada em espectrometria de massa do componente proteico.

A principal vantagem dessa técnica é que ela pode fornecer um resultado rápido e quantitativo. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando notamos que as proteínas conhecidas pelo mesmo nome e espécies diferentes são realmente diferentes o suficiente para fornecer a identificação das espécies, mas semelhantes o suficiente para permitir a quantificação. Desnaturar termicamente as mioglobinas de referência purificadas aquecendo a amostra em um bloco quente a 95 graus Celsius por 30 minutos.

Resfrie a amostra por aproximadamente 15 minutos até atingir a temperatura ambiente. Em seguida, adicione 30 miligramas de uréia para melhorar a digestão e misture. Adicionar uma solução de tripsina à amostra numa proporção ponderal de uma para 30 enzimas e substratos.

Em seguida, misture por vórtice suave e deixe proteolizar durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, dessalinize a amostra pós-proteólise, diluindo primeiro a amostra um a dois volume a volume com água. Ative um cartucho polimérico de fase reversa cheio de 30 miligramas de material de fase reversa adicionando um mililitro de metanol.

Em seguida, equilibre o cartucho adicionando um mililitro de ácido fórmico a um por cento. Carregue a amostra no cartucho sob gravidade. Agora lave com um mililitro de cinco por cento de metanol contendo um por cento de ácido fórmico.

Eluir os peptídeos com um mililitro de água acetonitrila em dois tubos de microcentrófugo de mililitro pré-preenchidos com cinco microlitros de DMSO. Em seguida, remova o solvente sob vácuo a 50 graus Celsius usando um evaporador centrífugo por 120 minutos. Em seguida, dissolva novamente o resíduo em 250 microlitros de água acetonitrila.

Transfira a solução para um frasco para injetáveis com amostrador automático de baixo volume. Localize as sequências de mioglobina para os diferentes encontros no banco de dados UniProt. Insira as sequências de mioglobina na caixa de destino do software de previsão de peptídeos e transição.

Se necessário, passe o mouse sobre um peptídeo para revelar sua lista de fragmentos. Depois de inserir as preferências conforme descrito no protocolo de texto, clique em Exportar e selecione Lista de Transição para criar uma planilha contendo as transições e parâmetros MRM gerados. Configurar um sistema de cromatografia líquida ou HPLC de alto desempenho de gradiente binário com um amostrador automático e uma coluna de HPLC de casca de núcleo C18 conectada a um espectrômetro de massa quadrupolo triplo operado em modo de eletrospray positivo com detecção de MRM.

Na seção de edição de parâmetros do software de coleta de dados de espectrometria de massa de cromatografia líquida, selecione o tipo de varredura como MRM e a polaridade como positiva. Insira os valores Q1, Q3, time, ID, DP e CE para as transições criadas na planilha e salve o método de aquisição. Depois de configurar os parâmetros do método conforme descrito no protocolo de texto, navegue até o software de coleta de dados, clique em Adquirir e selecione Equilibrar.

Na caixa que se abre, selecione o método de aquisição necessário para iniciar a qualificação do instrumento. Em seguida, coloque os frascos de amostra em um rack no amostrador automático. Clique em Arquivo e selecione Novo, seguido de Lote de aquisição.

Em nome da amostra insira a identidade de cada uma das amostras a serem analisadas. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre como visualizar os dados adquiridos. Use uma carne previamente congelada e depois moída em pó.

Prepare uma variedade de misturas de carne pesando as respectivas quantidades de carne em tubos de centrífuga de plástico de 15 mililitros. Adicione quatro mililitros de tampão de extração ao pó de carne. Após o vórtice por 30 segundos, extraia em um agitador de laboratório em temperatura ambiente por duas horas a 250 ciclos por minuto.

Transferir dois mililitros do extracto para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e centrifugar durante cinco minutos a quatro graus Celsius e 17 000 G. Transferir alíquotas de 200 microlitros do sobrenadante para tubos de centrifugação de dois mililitros. Secar as amostras utilizando um evaporador centrífugo antes de determinar a concentração de proteínas das amostras, tal como descrito no protocolo de texto. Para realizar a proteólise de misturas de carne, dissolva novamente o resíduo seco em um mililitro de solução de bicarbonato de amônio 25 milimolar.

Misture bem por vórtice e execute a proteoloysis como antes. Em seguida, configure e execute o LCMS de maneira semelhante usando o MRM programado. Exibir o cromatograma completo no software de visualização de dados.

Exiba os íons extraídos para cada conjunto de transição. Confirme visualmente se cada cluster contém o número necessário de picos em forma de sino no tempo de retenção esperado. Confirmando assim a existência do peptídeo selecionado.

Em seguida, clique duas vezes em Assistente de quantificação na barra de navegação. Na janela Selecionar amostras, crie um conjunto de quantificação selecionando um único arquivo de dados. Em seguida, selecione uma ou mais amostras disponíveis.

Selecione Avançar para exibir as configurações selecionadas e a caixa de consulta. Deixe as configurações padrão e selecione Avançar para exibir Selecionar método. Na caixa suspensa Método, selecione o arquivo do método de integração e, por fim, selecione Concluir.

Salve a tabela de resultados, exporte como um arquivo de texto e abra-a em uma planilha para revisar os dados conforme descrito no protocolo de texto. Esta figura mostra as transições MRM mais intensas para cavalos obtidas a partir de uma mistura de um por cento de peso por peso com carne bovina. Em contraste, a linha vermelha mostra a transição da carne bovina quando não há cavalo presente.

Este é um gráfico da quantidade medida versus a quantidade preparada de cavalo na carne bovina, expressa em proporções. O gráfico mostra claramente como o método pode ser usado para fazer medições quantitativas. Uma vez dominado e ao usar o processamento em lote, o rendimento por esse método pode chegar a até 20 amostras por 24 horas.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de selecionar uma proteína adequada para análise de extração. A mioglobina é uma boa candidata para examinar espécies de carne vermelha porque é abundante, solúvel em água e estável ao calor. Este procedimento pode ser alargado de modo a incluir outras espécies a identificar e quantificar simultaneamente.

O número máximo é limitado apenas pela velocidade de varredura por espectrometria de massa. Essa técnica está abrindo caminho para os pesquisadores usarem a impressão digital pepto em áreas como proteção ao consumidor e à marca.