A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota

O objetivo geral deste procedimento é combinar um método simples para detectar visualmente polimorfismos multinucleotídeos com uma plataforma pneumática de manipulação de gotículas. A plataforma de detecção de DNA está em uma superfície aberta e é direta para uso por pesquisadores bioquímicos. Investigamos uma ferramenta simples para detectar repetidamente mutações genéticas e doenças genéticas.

Tem maior potencial para nos ajudar a entender como a variação genética leva à doença. Combinamos dois métodos novos e simples. O polimorfismo multinucleotídico pode ser detectado na plataforma de manipulação de gotículas pneumáticas a olho nu e sem nenhum instrumento adicional.

O método para detectar polimorfismo multinucleotídico será demonstrado por Tzu-Ming Wang, o pós-doutor em nosso grupo. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução 100 micromolar de DNA de sonda conforme indicado no protocolo de texto. Em seguida, adicione o DNA da sonda a uma solução de um OD por mililitro de nanopartículas de ouro.

Traga a concentração final de SDS para 0,01% e de PBS para 0,01 molar. Deixe a solução incubar por 20 minutos. Em seguida, aumente a concentração de cloreto de sódio para 0,05 molar adicionando uma solução de cloreto de sódio de dois molares e PBS 0,01 molar.

Manter a concentração de SDS a 0,01% e deixar incubar a solução durante mais 20 minutos. Aumente a concentração de cloreto de sódio em incrementos de 0,1 molar em intervalos de 20 minutos até atingir uma concentração final de um molar. Incube a solução a 23 graus Celsius durante a noite em um rotador.

Depois que as amostras de DNA e as nanopartículas de ouro se conjugarem, centrifugue a solução a 7.000 vezes g por 30 segundos. Remova o sobrenadante. Em seguida, prepare uma solução de sonda de nanopartículas de ouro 25 nanomolares ressuspendendo o pellet em água deionizada.

Prepare amostras de DNA alvo conforme descrito no protocolo de texto. Adicione seis microlitros de solução de sonda de nanopartículas de ouro em cada amostra de DNA com cloreto de sódio. Usando um misturador de vórtice, agite cada sample solução por cinco minutos a 23 graus Celsius.

Em seguida, adicione seis microlitros de hidroxilamina 400 milimolar e seis microlitros de ácido cloroáurico 25,4 milimolar a cada solução de amostra de DNA. Deixe essas amostras de lado, pois uma mudança constante na coloração ocorrerá na próxima hora. o tamanho, propriedades ópticas dependentes da forma da nanopartícula, o número da incompatibilidade em um fragmento de DNA de amostra típico pode ser discernido a olho nu.

Para começar a fabricar a plataforma de manipulação de gotículas, utilize uma máquina controlada numérica computadorizada equipada com uma broca de 0,5 milímetro para produzir moldes mestres à base de PMMA com microestruturas. Para a broca, use uma velocidade de avanço de sete milímetros por segundo e uma taxa de rotação de 26.000 rpm e inspecione os moldes após a perfuração. Use um soprador de ar e água deionizada para limpar a superfície dos moldes mestres e remover qualquer sucata de PMMA.

Em seguida, prepare uma mistura de 10 para um de base PDMS e agente de cura. Desgaseifique a mistura em um dessecador até que todas as bolhas de ar sejam removidas. Em seguida, despeje a mistura PDMS no molde mestre.

Asse por três horas a 60 graus Celsius para obter as microestruturas inversas nas câmaras de ar e canais de ar. Após a conclusão do cozimento, remova a camada PDMS do molde mestre e faça furos nela para as entradas de sucção de ar. Use um sistema de tratamento com plasma de oxigênio para limpar a membrana PDMS e a camada PDMS.

Após o tratamento, cole a membrana PDMS e a camada PDMS e, em seguida, faça furos nesta estrutura conjugada. Em seguida, una o PDMS e o substrato de vidro usando uma placa quente a 90 graus Celsius por 10 minutos. Uma vez que as camadas estejam unidas, coloque a placa composta em uma máquina de corte a laser PDMS com a membrana voltada para cima.

Importe o arquivo dwg para definir a área super hidrofóbica e observe que isso será gravado diretamente na membrana PDMS. Limpe a superfície super-hidrofóbica recém-gravada com água deionizada. Isso removerá quaisquer resíduos carbonizados.

Após a limpeza da superfície, conecte a entrada de sucção de ar e a bomba de vácuo através de uma válvula solenóide. Em seguida, conecte a válvula solenóide a um computador para controlá-la com um módulo USB IO digital. Uma vez configurada a plataforma pneumática de manipulação de gotículas, adicione 10 microlitros de DNA alvo de 0,5 micromolar na área super-hidrofóbica.

Em seguida, adicione 10 microlitros de solução de sonda de nanopartículas de ouro de 25 nanomolares recém-hibridizada ao lado da gota de DNA alvo. Use um programa simples para controlar a sucção de ar para a plataforma através de uma válvula solenóide. Defina a pressão para 80 quilopascais negativos e a frequência de condução para cinco hertz.

Forneça sucção ao longo dos caminhos de vibração da gota, fazendo com que elas colidam e coalescam. Em seguida, misture a gota coalescida manipulando a sucção para rolar a amostra por três minutos. Adicione dois microlitros de hidroxilamina 400 milimolar e dois microlitros de ácido cloroáurico 25,4 milimolar à área super-hidrofóbica da plataforma pneumática de manipulação de gotículas.

Manipule a sucção para que as gotículas colidam e se fundam. Em seguida, misture a gota mesclada rolando-a por um minuto. Observe a cor da gota final a olho nu.

Neste estudo, polimorfismos multinucleotídicos são detectados colorometricamente usando o crescimento mediado por hibridização de DNA de sondas de nanopartículas de ouro. Aqui, as amostras de DNA possuem afinidades diferentes com o DNA da sonda, causando diferenças no crescimento das nanopartículas de ouro, vistas como uma mudança de cor. A amostra de DNA incompatível de três pares de bases tem menos hibridização do que o DNA totalmente complementar, o que pode ser visto como distinções perceptíveis na cor, especialmente em concentrações mais altas.

O DNA incompatível de seis bases tem fraca afinidade de hibridização com a sonda e, portanto, o tamanho de crescimento das nanopartículas de ouro foi pequeno. Esta análise colorométrica mostra-se repetível quando as amostras são manipuladas por meio de uma plataforma de sucção pneumática, pois os resultados da incompatibilidade de DNA são facilmente observáveis a olho nu. Uma vez dominado, todo o procedimento leva menos de cinco minutos desde a adição da amostra e do reagente até o resultado deles, o que é muito mais rápido do que o método tradicional.

O total em cada operação é de apenas 10 microlitros, o que é significativamente menor do que o necessário em um sistema grande. Após este procedimento, uma vez que a variação da sequência do espaço do fragmento de DNA é confirmada como responsável por uma doença específica. O produto especificamente projetado pode ser usado para adquirir uma série de incompatibilidades do DNA da amostra.

A plataforma pneumática de manipulação de gotículas é mais biocompatível do que outros métodos, como ponderação óptica, eletrofluorescência de corante, eletroponderação e atuação capilar do shoomoo. O método de detecção de polimorfismo multinucleotídico proposto foi conduzido sob plataforma de manipulação pneumática de gotículas, o que significa que as amostras e reagentes podem ser carregados e coletados diretamente com pipeta. Após seu desenvolvimento, essa técnica tem um alto potencial para triagem de DNA e outras aplicações químicas e biomáticas.