Name: A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprenda a detectar polimorfismos multi-nucleotídicos visualmente usando uma plataforma de manipulação de gotas pneumática. Este método simples permite identificar mutações genéticas sem instrumentos avançados.

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Ministério da Ciência e Tecnologia de Taiwan forneceu apoio financeiro a esta pesquisa sob os contratos MOST-103-2221-E-002 -097 -MY3.

1. Método para Detectar MNP Nota: Esta secção descreve o procedimento para detectar a MNP com base no crescimento mediada por hibridação de nanopartículas de ouro. <ol><li> Prepara-se o ADN da sonda (5&#39;-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 &#39;) solução a uma concentração de 100 uM. </li><li> Prepare o partículas AUNP sonda de DNA modificado (sonda AUNP). 21 Nota: O volume utilizado aqui depende da exigência de AUNP sonda de DNA modificado (sonda AUNP) partículas. É, por conseguinte, dependente do número de experiências para ser realizado. Nós normalmente preparar partículas da sonda AUNP excesso como peças de reposição. O volume utilizado nestes passos é ajustável e flexível. <ol><li> Adicionar ADN sonda (100 pM, preparada no passo 1.1) a uma solução de nanopartículas de ouro (13 nM, 17 nM) a uma concentração de DO / ml. </li><li> Traga as concentrações finais de sulfato de dodecilo de sódio (NAC 12 H 25 SO 4, SDS) e tampão de fosfato (PBS) a 0,01% e 0,01 M, respectively. </li><li> Após 20 minutos, trazer a concentração de cloreto de sódio (NaCl) a 0,05 M com uma solução de cloreto de sódio (2 M) e PBS (0,01 M), mantendo a SDS a 0,01% e incubar durante 20 min. </li><li> Aumentar a concentração de NaCl em incrementos de 0,1 M para uma concentração final de 1 M de mais de 20 intervalos mínimo. </li><li> Incubar durante a noite com agitação num misturador de vortex a 23 ° C. A velocidade de agitação não afecta a experiência, enquanto as amostras de ADN e sondas AUNP tornar hibridada. </li><li> Centrifugar as nanopartículas de ouro a 7.000 xg durante 30 segundos e remover o sobrenadante. </li></ol></li><li> Adicionar partículas sonda AUNP em água desionizada (água Dl) a uma concentração de 25 nM (solução de sonda AUNP). </li><li> Preparar as amostras de ADN alvo totalmente complementares (: 5&#39;-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 &#39;; três pares de bases incompatíveis: 5&#39;-TTT CTTGCCTAC ACCAGCTC-3&#39;; seis pares de bases incompatíveis: 5&#39;-TTTTTT CTTGCCT CCAGCTC-3 &#39;) em concentraçõesde 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respectivamente. </li><li> Adicionar solução de sonda AUNP (6 ul, 25 nM) nas amostras de ADN (350 ul) com NaCl (14 uM). </li><li> Agitar a mistura de amostras de ADN e sondas AUNP com um misturador de vórtice a 23 ° C durante 5 min para hibridação de ADN. </li><li> Para o crescimento AUNP, adicionar NH 2 OH (6 mL, 400 mM) e HAuCl 4 (6 mL, 25,4 mM) à solução de (a mistura de amostras de ADN e sondas AUNP). O crescimento de AUNP leva cerca de 30 seg para conclusão. A mudança constante de coloração mantém mais do que 1 h. CUIDADO: O contato da pele com HAuCl 4 pode produzir efeitos tóxicos graves. Por favor, consulte as folhas de dados de segurança de material (MSDS) antes do uso. Por favor, use luvas e utilizar um exaustor quando se utiliza HAuCl 4. </li></ol> 2. Fabricação de uma plataforma de Manipulação pneumática Gota Nota: A plataforma de manipulação gota PDMS baseada compreende duas componentes: a Pmembrana de DMS (100 um) com uma superfície super-hidrófoba e uma camada de ar do canal (5 mm). Sem um processo de MEMS, os processos de maquinagem comuns foram utilizados para fabricar este dispositivo, que inclui o controlo por computador numérico micromaquinagem (CNC), para fazer um molde, a carcaça de PDMS e de replicação para prototipagem rápida dos componentes de microfluidos, e micromaquinação por laser para a fabricação de uma superfície super-hidrófoba (ver Figura 3). <ol><li> Use a máquina de CNC equipado com uma broca (0,5 mm) para produzir moldes de mestre à base de PMMA (ver Figura 3) com microestruturas. Use uma velocidade de alimentação da broca bit 7 mm / seg e uma velocidade de rotação de 26.000 rpm. Usar um ventilador de ar e água desionizada para remover a sucata de PMMA e para limpar a superfície dos moldes mestres. </li><li> Prepara-se uma mistura da base de PDMS e o agente de cura na proporção de 10: 1. Desgaseificar a mistura no interior de um exsicador durante 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar são removidas. </li><li> Despeje o PDMS em the mestre de molde e assar o PDMS durante 3 horas a 60 ° C no forno para se obter as microstruturas inversas das câmaras de ar (membrana PDMS) e os canais de ar (camada de PDMS). </li><li> Retirar a camada de PDMS do molde mestre (à mão). Faça furos na camada de PDMS para entradas de ar de sucção. </li><li> Colocar a membrana PDMS, a camada de PDMS e o substrato de vidro dentro da câmara do sistema de tratamento de plasma de oxigénio. Após o tratamento por plasma de oxigénio, ligar-se a membrana de PDMS, a camada de PDMS e o substrato de vidro em conjunto numa placa de aquecimento (90 ° C) durante 10 min. </li><li> Coloque o chip compósitos para a máquina de corte a laser (PDMS lado da membrana para cima). Importar o arquivo .dwg para definir a área hidrofóbicas (15 mm × 12 mm). Veja a Figura 3. Diretamente gravar a membrana PDMS com uma máquina -Laser CO 2 para criar a área hidrofóbicas na membrana PDMS (potência de 12 W, velocidade de varredura 106,68 mm / seg). </li><li> Limpe a superfície hidrofóbicas com água DI para lavardistância os resíduos carbonizados na superfície. </li><li> Ligue a entrada de ar de sucção e a bomba de vácuo através de uma válvula de solenóide (ver Figura 4). Conectar-se a válvula solenóide para o computador e controle com um módulo USB I / O digital. </li></ol> 3. Operação para a detecção de MNP na Plataforma Pneumática Nota: Esta secção descreve a operação para identificar rapidamente o colorimetricamente e MNP na plataforma de manipulação gota pneumático (consulte a Figura 5). Todos os passos de ter lugar a 23 ° C (temperatura ambiente) e humidade relativa de 85%. <ol><li> Coloque a gota de amostra de ADN alvo (10 ul, 0,5 uM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático. </li><li> Coloque a gota AUNP sonda (10 ul, 25 nM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático. </li><li> Controlar a sucção de ar para fazer com que a deflexão da membrana PDMS com uma válvula solenóide e uma Siprograma mple (por exemplo, o LabVIEW). Fornecer de sucção de ar em cada câmara de ar ao longo do caminho de migração das gotículas (contendo DNA alvo e as sondas AUNP respectivamente) sobre a membrana de PDMS de tal modo que as gotículas colidem uns com os outros e coalescer. Usar uma pressão de funcionamento da bomba de vácuo de -80 kPa (pressão manométrica). <ol><li> Em alternativa, controlar a sucção de ar manualmente, desde que a gotícula é completamente misturado. Ao lado, ligar ou desligar a bomba de vácuo e entradas de câmara de ar com tubos nas fases iniciais de testes. </li></ol></li><li> Controlar o rolo de sucção de ar para a gotícula coalescida frente e para trás para aumentar a eficácia da mistura durante 3 min utilizando o sistema de controlo da válvula de solenóide. O DNA alvo e as sondas AUNP tornar-se bem misturados e hibridizados dentro de 3 min. Utilize uma frequência de condução e uma pressão de trabalho de 5 Hz e -80 kPa (pressão manométrica), respectivamente. </li><li> Coloque uma gota contendo NH 2 OH (2 mL, 400 mM) e HAuCl4 (2 mL, 25,4 mM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático. </li><li> Controlar a sucção de ar (-80 kPa pressão gauge) para permitir que as gotículas colidem uns com os outros e se aglutinam. Em seguida, controlar a sucção de ar (5 Hz e -80 kPa de pressão) para permitir que o rolo coalescida gota a frente e para trás para aumentar a eficiência de mistura durante 1 min. </li><li> Meça e registre a cor da gota coalesceram com o olho nu. </li></ol>

<ol><li>Chorley, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+verification+of+functional+single+nucleotide+polymorphisms+in+regulatory+genomic+regions%3A+current+and+developing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.+Rev.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Discovery and verification of functional single nucleotide polymorphisms in regulatory genomic regions: current and developing technologies.</a> Mutat. Res. Rev. Mutat. 659 (1), 147-157 (2008).</li>
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<li>Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-based+method+for+rationally+assembling+nanoparticles+into+macroscopic+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials.</a> Nature. 382 (6592), 607-609 (1996).</li>
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<li>Lee, J., Kim, C. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-tension-driven+microactuation+based+on+continuous+electrowetting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microelectromech.+S%22%5BJournal%5D)">Surface-tension-driven microactuation based on continuous electrowetting.</a> J. Microelectromech. S. 9 (2), 171-180 (2000).</li>
<li>Daniel, S., Chaudhury, M. K., De Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration-actuated+drop+motion+on+surfaces+for+batch+microfluidic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Vibration-actuated drop motion on surfaces for batch microfluidic processes.</a> Langmuir. 21 (9), 4240-4248 (2005).</li>
<li>Darhuber, A. A., Valentino, J. P., Davis, J. M., Troian, S. M., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+actuation+by+modulation+of+surface+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Microfluidic actuation by modulation of surface stresses.</a> Appl. Phys. Lett. 82 (4), 657-659 (2003).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Neste protocolo, um método colorimétrico simples para detectar MNP pode ser implementado em concentrações que variam de 0.11-0.50 uM em tubos de microcentrífuga. Além disso, o método de detecção MNP proposto é conduzida sobre uma plataforma de manipulação gota pneumático que tem um elevado potencial para o rastreio de ADN e outras aplicações biomédicas. Na prática, o intervalo da concentração detectável de ADN da amostra depende da eficiência de mistura dos plataformas operacionais. Para assegurar que a gota de coalesce...

-polimorfismo de um único nucleótido (SNP), que é uma única diferença de par de bases numa sequência de ADN, é uma das variações genéticas mais comuns. Estudos atuais relatam que SNPs estão associados com o risco de doença, a eficácia da droga e os efeitos colaterais dos indivíduos por afetar a função do gene. 1,2 Estudos recentes também revelou que as mutações de dois ou multi-ponto (polimorfismo multi-nucleotídeo) causam doenças específicas e individuais diferenças nos efeitos da doença 3,4 A detecção de polimorfismo de nucleotídeo. é, portanto, imperativo prescreening doença. Métodos simples e eficientes para a detecção rápida de oligonucleotídeos específicos de sequência foram altamente desenvolvido nas últimas duas décadas. 1,5 As abordagens atuais para identificar mutações no DNA tipicamente procedimentos, incluindo a imobilização da sonda, rotulagem de fluorescência, eletroforese em gel, etc. envolvem, 6,7 mas estes métodos requerem geralmente um processo analítico de comprimento, expenequipamentos sive, os técnicos bem treinados e consumo significativo de amostras e reagentes. Uma nanopartícula com uma grande proporção de área de superfície para volume e propriedades físico-químicas únicas é um material ideal como uma plataforma de detecção altamente sensível e barato para biomarcadores específicos. As nanopartículas de ouro (AUNP) são amplamente utilizados para a detecção de DNA devido à sua grande capacidade de ser modificado com sondas de oligonucleotídeos. 8-10 técnicas de detecção de SNP também foram desenvolvidos usando AUNP. 11-13 Neste trabalho adotamos uma nova abordagem colorimétrico para detectar a polimorfismo multi-nucleótido (MNP) através do DNA crescimento mediada por hibridação de sondas AUNP. 14 Este método de sondagem simples e rápida é baseada na teoria de que os comprimentos variados de ADN de cadeia simples (ssDNA) ou de ADN de cadeia dupla (dsDNA), conjugada com AUNP influenciar o crescimento do tamanho e forma do AUNP (ver Figura 1). 15 Este método de detecção de ADNapresenta um pequeno consumo de reagentes, um ensaio de duração pequena (alguns minutos), e um processo simples, sem controlo térmico que é aplicável prospectivamente para o diagnóstico clínico e um exame médico interno. Vários sistemas de microfluido para detectar a sequência de ADN ter sido desenvolvido; 16 Estes sistemas de microfluidos, evoluíram a partir de protocolos experimentais tradicionais, necessária menos peças de equipamento de grandes dimensões e simplificada os protocolos experimentais, de modo a melhorar a sensibilidade, limite de detecção e especificidade do ADN biossensor. Métodos de detecção de DNA nos sistemas microfluídicos ainda exigem, no entanto, instrumentos de um processo subsequente, como a PCR (reação em cadeia da polimerase) máquinas para a amplificação de sinal e um leitor de fluorescência para uma única leitura para identificar o SNP heterogêneo. 17,18 Desenvolvimento de uma simples plataforma sem o processamento subsequente para ler diretamente os resultados de polimorfismo multi-nucleotídeoé altamente desejável. Comparado ao bem utilizado, convencional, fechou sistemas microfluídicos, o open-superfície dispositivos microfluídicos oferecem promissora várias vantagens, tais como um caminho óptico claro, uma maneira fácil de acessar a amostra, a acessibilidade ambiental direta e cavitação não facilmente formadas ou obstrução interfacial em o canal. 19 o nosso trabalho anterior apresentou uma plataforma pneumático simples para a manipulação da superfície aberta gotícula (ver Figura 2). 20 Nesta plataforma, as gotas podem ser simultaneamente transportadas e manipulado sem interferência a partir de uma energia motriz usando uma força de sucção, que tem um grande potencial em aplicações biológicas e químicas. Esta plataforma pneumático foi assim utilizada para executar a manipulação de amostras de ADN para a detecção de MNP em combinação com a abordagem colorimétrico utilizando o conceito de ADN crescimento mediada por hibridação de sondas AUNP. O protocolo apresentado neste artigo descreveuma detecção visual simples de polimorfismos multi-nucleotídeos na plataforma manipulação gota pneumático em uma superfície aberta. Este trabalho confirma que o polimorfismo multi-nucleotídeo é detectável a olho nu; a plataforma pneumático proposto é adequado para aplicações biológicas e químicas.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>gravadores de bancada</td><td>Roland DG</td><td>EGX-400</td><td></td></tr><tr><td>máquina de corte a laser</td><td>Universal Laser Systems, Inc.</td><td>VLS 3.50</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de tratamento de plasma de oxigênio</td><td>Femto Science Inc. Coréia</td><td>CUTE-MPR</td><td></td></tr><tr><td>válvula</td><td></td><td></td> solenóide <td>bomba de vácuo construída em casa</td></tr><tr><td></td><td>ULVAC KIKO, Inc.</td><td>DA-30D</td><td></td></tr><tr><td>13-nm AuNP solução</td><td>TAN Bead Inc., Taiwan</td><td>NG-13</td><td></td></tr><tr><td>DNA (com tiol marcado com 5'-end)</td> <td>MDBio, Inc., Taiwan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>UniRegion&nbsp; Biotecnologia,. Taiwan</td><td>PBS001-1L</td><td></td></tr><tr><td>dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>J. T. baker</td><td>4095-04</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidroxilamina (NH2OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cloroáurico (HAuCl4)</td><td>Misturador</td><td></td> de vórtice de cloreto de sódio (NaCl)Sigma-Aldrich G4022 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Digisystem Instrumentos de Laboratório Inc.</td><td>Centrífuga VM-2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hermle Labortechnik GmbH.</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr></tbody></table>

a detecção visual colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

Um método simples e visual para detectar polimorfismo de multi-nucleótido (MNP) foi realizada sobre uma plataforma de manipulação gota pneumática sobre uma superfície aberta. Esta abordagem para a detecção de ADN foi colorimétrico baseado no crescimento mediada por hibridação de sondas de nanopartulas de ouro (sondas AUNP). O tamanho e a configuração do crescimento do AUNP são dominadas pelo número de amostras de DNA hibridaram com as sondas. Com base nas propriedades ópticas e SIZE- dependente da forma específica das nanopartículas, o número de desemparelhamentos de um fragmento de ADN da amostra com as sondas é capaz de ser discriminado. Os testes foram realizados através de gotículas contendo os reagentes e as amostras de ADN, respectivamente, e foram transportadas e misturado na plataforma pneumática com a sucção pneumática controlada da membrana hidrofóbicas à base de PDMS flexíveis. Gotículas podem ser entregues simultaneamente e, precisamente, numa superfície aberta na plataforma pneumática proposta que é altamente biocompatível sem FEP ladoect de amostras de ADN no interior das gotas. A combinação dos dois métodos propostos, o polimorfismo de multi-nucleótido pode ser detectada à vista sobre a plataforma de manipulação gota pneumático; nenhum instrumento adicional é necessária. O procedimento de instalação das gotas na plataforma para o resultado final leva menos de cinco minutos, muito menos do que os métodos existentes. Além disso, esta abordagem combinada de detecção MNP exige um volume de amostra de apenas 10 ul em cada operação, o que é notavelmente menos do que a de um sistema de macro.

Neste trabalho, três amostras de DNA foram testadas utilizando um método simples e inovador de detecção através do crescimento de DNA mediada por hibridação das sondas AUNP. As sequências de DNA sonda e amostras de DNA de três tipos, especificamente, o cDNA (totalmente complementar à sonda de DNA), TMDNA (três pares de bases de DNA incompatíveis) e SixMDNA (seis pares de bases de DNA incompatíveis) estão listados no Protocolo etapa 1. os desemparelhamentos para a sonda de ADN das amostra...

Este trabalho apresenta um método simples e visual para detectar polimorfismos multi-nucleotídeos em uma plataforma de manipulação gota pneumático. Com o método proposto, toda a experiência, incluindo gota de manipulação e de detecção de polimorfismos de vários nucleótidos, pode ser realizada próximo de 23 ° C, sem o auxílio de instrumentos avançados.

A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

O objetivo geral deste procedimento é combinar um método simples para detecção visual de polimorfismos de múltiplos nucleotídeos com uma plataforma pneumática de manipulação de gotas. A plataforma de detecção de DNA está em uma superfície aberta e é de uso direto para pesquisadores bioquímicos. Investigamos uma ferramenta simples para detecção repetida de mutações genéticas e doenças genéticas.Tem um potencial maior para nos ajudar a compreender como a variação genética leva à doença. Combinamos dois métodos novos e simples. O polimorfismo de múltiplos nucleotídeos pode ser detectado na plataforma pneumática de manipulação de gotas a olho nu e sem qualquer instrumento adicional.O método para detecção de polimorfismo multinucleotídico será demonstrado por Tzu-Ming Wang, o pós-doutor do nosso grupo. Para iniciar este procedimento, prepare uma solução de DNA da sonda a 100 micromolar, conforme indicado no protocolo textual. Em seguida, adicione o DNA da sonda a uma solução de nanopartículas de ouro a um OD por mililitro.Eleve a concentração final de SDS para 0,01% e de PBS para 0,01 molar. Deixe a solução incubando por 20 minutos. Em seguida, aumente a concentração de cloreto de sódio

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Gota plataformas baseadas microfluídicos são candidatos promissores para a experimentação de alto rendimento, uma vez que são capazes de gerar picolitros, auto-compartimentada vasos barata a taxas kHz. Através da integração com rápido, sensível e de alta resolução de fluorescência métodos espectroscópicos, a grande quantidade de informações geradas nesses sistemas podem ser eficientemente extraído, aproveitada e utilizada.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Neste vídeo, apresentamos um procedimento passo a passo para gerar nanogotículas emulsionadas para detectar ácidos nucléicos alvo por reação em cadeia da polimerase digital ou dPCR.

Reação em cadeia da polimerase digital de gotículas: um método para gerar reações de PCR de nanogotículas para detectar mutações tumorais raras

Este vídeo demonstra o papel da reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais na identificação da mutação indel em uma amostra de DNA. A alta precisão e sensibilidade do ddPCR permitem a detecção precisa e consistente de mutações raras presentes em uma amostra, mesmo em níveis baixos. Ele pode identificar e quantificar mutações indel em diferentes regiões do genoma, fornecendo informações valiosas sobre os mecanismos de mutação e as consequências funcionais dessas mutações.

Reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais para detecção de mutação Indel em genes-alvo

Este vídeo demonstra a técnica de reação em cadeia da polimerase por gotículas multiplex para a quantificação simultânea de regiões de DNA metilado em diferentes populações de glóbulos brancos como um biomarcador precoce para diagnóstico clínico e prognóstico.

Reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex para detectar metilação do DNA em leucócitos

Este vídeo demonstra a utilidade da PCR digital em um formato chip-in-a-tube para a detecção de variações de nucleotídeo único em amostras de DNA. Uma única reação de PCR é particionada em câmaras que atuam como reações de PCR independentes, e a detecção de sinais de fluorescência dos alvos amplificados nas câmaras é usada para calcular a frequência do alelo variante na amostra.

PCR digital baseado em chip em tubo para quantificação de variantes de nucleotídeo único

O objetivo deste vídeo é para demonstrar como executar extração de DNA automatizado a partir de linhas fixas em formalina e embebidos em parafina (FFPE) de referência padrão de células e de gotículas digital de análise de PCR (ddPCR) para detectar mutações raras em um ambiente clínico. Detecção de mutações em amostras de FFPE demonstra a utilidade clínica de ddPCR em amostras FFPE.

Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina

A detecção de fluorescência multicolorida em microfluídica de gotículas normalmente envolve sistemas de detecção baseados em microscópio de epifluorescência volumosos e complexos. Aqui descrevemos um esquema de detecção multicolorido compacto e modular que utiliza uma matriz de fibras ópticas para codificar temporariamente dados multicoloridos coletados por um único fotodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

Este protocolo descreve a fabricação de uma gaveta pequena, ready-to-use que pode ser aplicada para a detecção visual de vários ácidos nucleicos em um teste único, que é fácil de operar. Nesta abordagem, uma matriz capilar foi usado para multiplex e altamente eficiente detecção de alvos de OGM.

Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Marcadores epigenéticos são usados para subtipagem de glóbulos brancos (WBC) através da quantificação dos padrões de metilação de DNA. Este protocolo apresenta um método de reação em cadeia de polimerase de gotícula multiplex (mdPCR) usando um dispositivo microfluido baseado em elastômero termoplástico (TPE) para geração de gotículas permitindo quantificação de alvo específica e multiplex específica da contagem diferencial WBC.

Methylation Specific Multiplex Droplet PCR usando dispositivo gerador de gotícula de polímero para diagnósticos hematológicos

Este protocolo fornece os passos desde a extração de DNA até a configuração experimental para PCR de gotícula digital (ddPCR), incluindo análise para identificação e quantificação de eventos não homólogos de junção final (NHEJ) em locais-alvo após o decote Cas9 induzido pelo GRNA e reparação de DNA. Outros usos deste método incluem aplicações como detecção de polimorfismo e verificação de variantes de edição de genes.

PCR de gotícula digital para detectar mutações indelés em populações de mosquitos anofelinos geneticamente modificados

Aprenda a detectar polimorfismos multi-nucleotídicos visualmente usando uma plataforma de manipulação de gotas pneumática. Este método simples permite identificar mutações genéticas sem instrumentos avançados.

A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota

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