Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

O objetivo geral deste experimento é caracterizar a trajetória evolutiva da resistência a antibióticos utilizando um morbidostato que monitora continuamente o crescimento bacteriano e ajusta dinamicamente a concentração do antibiótico à medida que as bactérias adquirem resistência ao fármaco. A principal vantagem desta técnica é que o equipamento é composto por componentes eletrônicos de baixo custo e facilmente disponíveis, podendo ser facilmente reconfigurado para fins específicos. Os procedimentos serão demonstrados por Po Cheng Liu e Yi Tai Lee, ambos alunos de pós-graduação do meu laboratório.

Para montar o Morbidostato, comece usando uma agulha de 18 gauge para furar três orifícios na tampa do frasco de cultura. Corte três pedaços de tubo de polietileno com aproximadamente sete centímetros de comprimento e insira-os nos orifícios da tampa. Use fita adesiva para envolver a borda da tampa, servindo como molde para a mistura de polidimetilsiloxano, ou PDMS.

Em seguida, adicione cinco gramas do componente A e 0,5 gramas do componente B da PDMS em um recipiente plástico de 150 mililitros e use um palito de dente para misturar manualmente. Carregue a mistura em uma seringa de 10 mililitros. Depois, com a seringa, injete a mistura de PDMS na tampa.

Asse toda a tampa a 70 graus Celsius por oito horas para curar o PDMS. Em seguida, usando um ferro de solda, solde o ânodo do LED com o fio de bitola 24 e o cátodo do LED com o resistor de carbono. Depois, solde um resistor de carbono de 680 Ohm com um fio de bitola 24.

Use fita isolante para isolar a conexão do fio. Solde o coletor do fotodetector com o fio de bitola 24 e o emissor do fotodetector com um resistor de carbono de 100 Ohm. Em seguida, use fita isolante para isolar a conexão do fio.

Coloque o diodo emissor de luz no suporte do frasco de cultura. Seguindo o diagrama do circuito mostrado aqui, conecte o diodo emissor de luz e utilize uma fonte de alimentação de cinco volts para ativá-lo. Verifique se o LED está funcionando utilizando uma câmera digital que possa detectar infravermelho. Agora, coloque o fotodetector no suporte do frasco de cultura.

Em seguida, seguindo o diagrama, conecte o fotodetector e utilize uma fonte de alimentação de cinco volts para alimentá-lo. Conecte o fio em ambos os lados dos resistores do fotodetector para medir a tensão através da placa de controle eletrônico. Cole um ímã no eixo do ventilador de refrigeração, que serve como unidade de agitação magnética.

Como a unidade de agitação magnética é formada pelo ímã e pelo ventilador de refrigeração, é fundamental alinhar a prateleira do ventilador ao frasco de cultura. Além disso, a distância entre o frasco de cultura e o ímã é muito crítica para garantir o funcionamento estável. Conecte cada peça de tubo de polietileno do frasco de cultura à peça correspondente de tubo de silicone das microbombas, frascos de meio e frasco de resíduos.

Ligue a bomba por uma hora e meça o volume total bombeado do frasco de meio para o frasco de cultura para determinar a taxa de bombeamento. A taxa de bombeamento típica deve ser de aproximadamente quatro mililitros por hora, o que corresponde à taxa de diluição de D igual a 0,33 por hora para um volume de trabalho de 12 mililitros no frasco de cultura. Quando a montagem estiver concluída, coloque todo o conjunto em um incubador agitador de tamanho médio.

Para testar previamente o Morbidostato, ajuste a tensão da fonte de alimentação do ventilador de refrigeração para cinco volts para acionar seu motor e testar a barra de agitação magnética. Após preparar uma série de amostras de E. coli e traçar uma curva de calibração de acordo com o protocolo descrito, prepare o frasco de cultura com três comprimentos de sete centímetros de tubo Tygon ultra resistente a produtos químicos, com diâmetro interno de 1/32 de polegada e diâmetro externo de 3/32 de polegada, para as entradas que formarão o dispositivo. Prepare o meio mínimo M9 com 0,2% de glicose e o meio M9 contendo a droga Trimetoprima ou TMP.

Em seguida, esterilize o meio, o frasco do meio, o frasco do meio com fármaco, o frasco de resíduos e o frasco de cultura em autoclave a 121 graus Celsius. No primeiro dia do experimento, descongele um mililitro de células congeladas de E-coli selvagem MG1655 à temperatura ambiente por cinco minutos e transfira 120 microlitros das células para um frasco de cultura contendo aproximadamente 12 mililitros de meio de crescimento M9. Ligue o incubador com agitação e ajuste a temperatura para 30 graus Celsius sem agitação.

Inicie a operação do Morbidostato ligando a microbomba, a unidade de agitação magnética e a medição da densidade óptica. Após aproximadamente 23 horas, pare a microbomba desligando sua tensão de alimentação e retire o frasco de cultura. Adicione glicerol a 15% ao frasco de cultura e congele as amostras a menos 80 graus Celsius para armazenamento.

É importante também trocar para um novo frasco de cultura no início de cada um desses experimentos para evitar formações de biotina. Caso contrário, a formação de biotina pode ocorrer em dois ou três dias. Após descongelar a amostra congelada diariamente à temperatura ambiente por cinco minutos, inocular um novo tubo de ensaio com meio M9 fresco.

Coloque a amostra em um incubador com agitação a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use o meio M9 para diluir a amostra microbiana dez vezes e carregue-a no dispositivo microfluídico pressionizando o recipiente da amostra microbiana a cinco PSI. Em seguida, carregue o meio contendo TMP no chip pressionizando o recipiente de M9 com TMP a cinco PSI.

Realize a mistura entre o microrganismo e a droga acionando a válvula micro-mecânica entre as duas câmaras no chip microfluídico por 15 minutos. Por fim, coloque o chip microfluídico no incubador do microscópio montado no microscópio invertido. Com uma câmera CCD, adquira imagens das células na câmara de crescimento a cada hora durante oito horas.

Calcule os dados de número de células de acordo com o protocolo descrito no texto. As operações comuns do Morbidostato, incluindo evolução experimental, teste de suscetibilidade a antibióticos e verificação da morfologia celular, foram realizadas utilizando um cultivo de E-coli MG1655 exposto ao antibiótico TMP, o qual induz um aumento distintivo em etapas na resistência ao fármaco, com mutações agrupadas ao redor do gene da di-hidrofolato redutase, ou DHFR. A cada dia, espera-se que o microrganismo cresça acima do limite pré-definido de densidade óptica e acione a injeção do fármaco, conforme mostrado aqui.

Espera-se que a injeção do fármaco iniba o crescimento e, como resultado, reduza a densidade óptica. Este gráfico mostra o aumento temporal da resistência a antibióticos em um experimento para determinar a CI50. A resistência ao fármaco aumentou aproximadamente 1500 vezes, atingindo 1.000 microgramas por mililitro em cerca de 12 dias.

Conforme observado anteriormente. As mutações pontuais no DHFR no mutante do último dia foram medidas por sequenciamento Sanger e estão listadas nesta tabela. A aquisição de resistência ao fármaco com múltiplas mutações comprova a utilidade do Morbidostato.

Como a seleção em placas de ágar contendo drogas tende a conferir apenas uma única mutação, esta figura exibe as curvas de crescimento em chip em várias concentrações de TMP. As amostras mutantes mostram um aumento significativo na resistência ao antibiótico.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que os pesquisadores estudassem a posição da resistência bacteriana a antibióticos em um ambiente de laboratório com controle real. Após este procedimento, outras medidas, como a análise microfluídica de célula única, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como se a morfologia ainda muda devido à exposição a medicamentos antibióticos. Uma vez dominado, este dispositivo pode ser facilmente reconfigurado para todos os experimentos de cultura bacteriana, como o cultivo de um sinal de bactérias ou o aumento do nível de tolerância a custos de uma linhagem bacteriana.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a aquisição de resistência a antibióticos em um experimento real de evolução adaptativa em laboratório com controle. Não se esqueça de manipular as bactérias resistentes aos fármacos de acordo com as regras de biossegurança para a prática microbiológica. Pode ser necessária permissão especial para um experimento envolvendo o treinamento básico de bactérias.