Name: Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a usar um morbidostat de baixo custo para estudar a evolução adaptativa de bactérias sob seleção de antibióticos. Este método permite monitorar o crescimento bacteriano em tempo real e ajustar dinamicamente as concentrações de drogas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Sze-Bi Hsu e à Sra. Zhenzhen pelas discussões úteis e ajuda na análise teórica e simulação numérica. Y. T. Y. gostaria de agradecer o apoio financeiro do Ministério da Ciência e Tecnologia sob os números de concessão MOST 103-2220-E-007-026 e MOST 104-2220-E-007-011, e da Universidade Nacional Tsing Hua sob os números de concessão 103N2042E1, 104N2042E1 e 105N518CE1.

1. Montagem e pré-teste do dispositivo Morbidostat <ol><li> Assembleia da Morbidostat <ol><li> Soco 3 furos na tampa do frasco de cultura com uma agulha de seringa 18 G. Corte três peças de tubagem de polietileno ~ 7 cm de comprimento. Inserir essas três pedaços de tubos de polietileno na tampa. </li><li> Use fita para envolver a borda da tampa para servir como o elenco para a mistura de polidimetilsiloxano (PDMS). Dissolvem-se 5 g de componente A e 0,5 g de componente B de o PDMS em um recipiente de plástico de 150 ml por agitação manualmente com um palito. Carregar a mistura em uma seringa de 10 ml. <ol><li> Despeje a mistura de PDMS na tampa com a seringa. Asse toda a tampa para curar o PDMS durante 8 horas na estufa a 70 ° C. </li></ol></li><li> Soldar o ânodo LED com o fio de calibre 24 e catodo LED com o resistor de carbono com um ferro de solda. Solde um resistor de 680 Ω de carbono com um fio de 24 g. Isolar a ligação do fio usando fita isolante. </li><li> assimlder no colector do fotodetector com o G fio 24 e o emissor da célula fotoeléctrica com uma resistência de 100 kQ carbono. Isolar a ligação do fio usando fita isolante. </li><li> Coloque o diodo emissor de luz no suporte de cultura do frasco. Seguindo o esquema de circuitos na Suplementar Figura 2, conecte o diodo emissor de luz e ligá-lo com uma fonte de alimentação de 5 V. Verifique se o LED funciona usando uma câmera digital que pode detectar IR (por exemplo, uma câmera de telefone celular). </li><li> Colocar o fotodetector no suporte do frasco de cultura. Seguindo o esquema de circuitos na Suplementar Figura 2, conecte o fotodetector e ligá-lo com uma fonte de alimentação de 5 V. Ligue o fio de ambos os lados das resistências de fotodetectores para medir a tensão através da placa de controle eletrônico. </li><li> Cole um íman sobre o veio da ventoinha de arrefecimento, o qual serve como unidade de agitador magnético. Note-se que o alignmENT do eixo do ventilador para o frasco de cultura, e o espaçamento entre o frasco de cultura e o íman é muito crítica para a função adequada da unidade de agitação magnética. </li><li> Ligue cada pedaço de tubo de polietileno do frasco de cultura para a parte correspondente de tubo de silicone para os micro-bombas, garrafas médias e frasco de resíduos. Ligar a bomba durante 1 hora e medir o volume total a ser bombeado a partir da garrafa de forma para o frasco de cultura para determinar a taxa de bombagem. Note-se que a taxa de bombeamento típico deve ser ~ 4 ml / h, o que corresponde à taxa de diluição de D = 0,33 h -1 para a 12 ml de volume do frasco de cultura de trabalho. </li><li> Coloque todo o conjunto em uma incubadora shaker médio porte (34 cm x 34 cm x 43,5 cm). </li></ol></li><li> O pré-teste do Morbidostat <ol><li> Set tensão de alimentação do ventilador de fresco a 5 V para iniciar o seu motor para testar a barra de agitação magnética. Note-se que a ação de agitação pode ser inspeccionados visualmente. A tensão que conduzirs o motor do ventilador de arrefecimento é precisamente controlado por modulação de largura de pulso (PWM). </li><li> Preparar uma série de tipo selvagem E. Amostras de E. coli com as densidades ópticas a 600 nm, tipicamente variando 0,07-0,3 para a calibração. Coloque um teste E. amostra coli no frasco de cultura e registar a tensão fotodetector. <ol><li> Ponto ~ 100 uL da mesma amostra no leitor de placas e gravar a densidade óptica. Use a tensão fotodetector em função dos dados de densidade óptica para traçar a curva de calibração. Note-se que tipicamente, uma unidade de variação na densidade óptica corresponde a 7,6 V ~ mudança no fotodetector com o esquema de polarização utilizado aqui. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. A execução do Morbidostat <ol><li> Preparação Antes de começar a experiência diária <ol><li> Prepara-se o frasco de cultura com três ultra-resistentes a substâncias químicas tubos Tygon com diâmetro interior de 1/32 polegadas e diâmetro externo de 3/32 de polegada para entradas para formar o dispositivo como na secção1.1 e na Figura Suplementar 1. </li><li> Preparar o meio M9 mínimo (0,2% de glicose) e trimetoprim (TMP) de drogas contendo meio. Esteriliza-se o meio, o meio de garrafa, a garrafa forma de droga, o frasco de resíduos, e o frasco de cultura num autoclave a 121 ° C. NOTA: O TMP é uma solução de reserva que é utilizado para alcançar as concentrações mais tarde no Quadro 1 e a droga TMP contendo meio não é autoclavado. </li></ol></li><li> Executando o Morbidostat <ol><li> No primeiro dia do experimento, descongelar 1 ml de tipo selvagem congelado E. coli MG1655 durante 5 min à temperatura ambiente e a transferência de 120 ul das células para o frasco de cultura contendo ~ 12 mL de meio de crescimento M9. Após o primeiro dia, descongelar 1 ml de E. congelado coli células a partir do dia anterior durante 5 min e transferência de 120 uL de células para um novo frasco de cultura contendo ~ 12 mL de meio de crescimento M9. </li><li> Ligue a incubadora shaker e definir a tempe<html> ratura de 30 ° C sem agitação. </li><li> Inicie a operação morbidostat girando sobre o micro-bomba, a unidade de agitação magnética, e a medição da densidade óptica. Nota: Durante a operação, um algoritmo de limiar de realimentação é utilizado para controlar a injecção de drogas. Quando a densidade óptica medida exceder um limite pré-definido, a bomba de injecção de drogas seria ligado e a bomba médio seria desligado. Caso contrário, a bomba de injecção de drogas permanece desligado ea bomba médio está ligado. </li><li> Monitorar a tensão ao longo do tempo para assegurar que não é o crescimento microbiano. Nota: Devido à congelação e descongelação ciclo, E. coli células apresentam um atraso de ~ 4 horas durante o crescimento de cada dia. </li><li> Depois de ~ 23 h, parar a micro-bomba desligando a tensão de alimentação e retire o frasco de cultura. Adiciona-se 15% de glicerol no frasco de cultura e congelar a amostra a -80 ° C durante o armazenamento. </li><li> Repita os passos 2.2.1 a 2.2.5. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. Antibiótico Susceptibilidade Medição em 96 Bem Format NOTA: Executar a medição da taxa de crescimento em um leitor de placas com um formato de 96 poços para determinar o nível de resistência a antibióticos. <ol><li> Descongelar a amostra congelada diária à temperatura ambiente durante 5 min e transferir 15 ul da célula para o frasco de cultura contendo ~ 15 mL de meio M9. Permitir-lhes crescer até a densidade óptica a 600 nm atingir ~ 0,1. Dividir as 15 ml em frascos de 1 ml e adicionar o fármaco TMP nesta etapa para se obter as concentrações de droga desejadas, como mostrado na Tabela 1. </li><li> Tome 200 ul da amostra a partir do passo 3.1 e local para cada poço na placa de leitor e permitir-lhes crescer durante 12 horas 5. A densidade óptica no comprimento de onda de 600 nm é registado automaticamente durante a medição. NOTA: Para cada ponto de dados, as medições triplicadas são registrados e em média para garantir a consistência dos dados. Os dados sobre a densidade óptica em função do tempo pode be utilizado para obter a taxa de crescimento. </li><li> Plotar os dados da taxa de crescimento em comparação com a concentração da droga para obter IC50. Note-se que IC50 é definido como a concentração de fármaco à qual a taxa de crescimento é de cinquenta por cento da taxa de crescimento máxima 5. </li></ol> 4. única célula Morfologia e Antibiótico Susceptibilidade Medição em microcanais <ol><li> Realizar a fabricação dos dispositivos microfluídicos via litografia macia multicamadas de PDMS conforme já descrito 15. <ol><li> Use fotolitografia para fazer o molde fotorresistente para os níveis de controlo e de fluxo. Note-se que para a camada de controlo, utilizar fotorresistente negativa (~ 15? M de altura) e fotorresistente positivo (~ 8 uM altura) para produzir um molde sobre uma bolacha de silício nu. </li><li> Preparar misturas de PDMS com rácios de reticulação de 5: 1 e 20: 1 para a camada de controlo e camada de fluxo, respectivamente. Coloque as misturas em um exsicador sob vácuo para remover quaisquer bolhas, Durante 1 h. </li><li> Exponha o controlo moldes camada fotossensível em bolacha de silício para trimetilclorosilano vapor (TMCS). Adicione a camada de espessura ~ 6 milímetros de controlo, lançando-se a mistura de PDMS (com razão de reticulação 5: 1) sobre a bolacha de silício sobre o molde de controle camada foto-resistente. Cozer a camada de controlo durante 40 minutos a 80 ° C durante 1 hora no forno. </li><li> Adicione a camada de fluxo de rotação por revestimento de uma mistura de PDMS (com reticulação proporção de 20: 1, velocidade de rotação 3000 rpm durante 60 seg) em um molde fotorresistente camada de escoamento. Cozer a camada de fluxo durante 30 min a 80 ° C durante 1 hora no forno. </li><li> Use uma lâmina de barbear para cortar a camada de controle para o tamanho do chip desejado (tipicamente 3 cm x 2 cm) e manualmente retire a camada de controle. Coloque a camada de controlo no topo da camada de escoamento e alinhá-los sob um estereomicroscópio. Curar a montagem alinhada a 80 ° C na noite forno. Em seguida, mergulhe o conjunto em 250 ml de água deionizada em um recipiente de plástico durante 5 horas para dissolver o TMCS residual. </li><li> Subsequentemente, perfurar os orifícios de entrada com 20 g de agulhas e ligar todo o elastómero a uma lâmina de vidro revestida com uma camada de PDMS em branco (PDMS reticulação proporção de 5: 1, velocidade de rotação 2000 rpm durante 30 seg) por tratamento com plasma de ar de 40 seg a 1,2 Torr de pressão de ar. </li><li> Realizar ampla cozimento durante 36 h a 80 ° C para reduzir os efeitos citotóxicos de PDMS. Note-se que esta fase de cozedura é crítica para minimizar a toxicidade para as células bacterianas. </li></ol></li><li> No Experimento Crescimento Chip <ol><li> Antes de carregar no dispositivo de microfluidos, lavá-la com água desionizada durante 1 hora e meio M9 durante 1 h. </li><li> Descongelar a amostra congelada diária à temperatura ambiente durante 5 min e inocular um novo tubo de ensaio com meio fresco M9. Colocar a amostra num incubador com agitação a 37 ° C durante a noite. </li><li> Diluir o microbiana amostra de 10 vezes com meio M9 e carregá-lo para dentro do dispositivo microfluídico pressionando o recipiente da amostra microbiana a 5 psi. Em seguida, carregar a droga TMPmédio no chip pressionando o recipiente do meio de droga em 5 psi. Executar a mistura entre o micróbio e fármaco por actuação da válvula de micromecânica entre as duas câmaras no chip de microfluidos durante 15 min. </li><li> Colocar o chip de microfluidos na incubadora microscópio montado no microscópio invertido. Adquirem a imagem de células na câmara de crescimento a cada HR durante 8 horas com a câmara CCD montada sobre o microscópio invertido. </li><li> Use o script programa personalizado para calcular o número de células por meio de um algoritmo de limite sobre os dados de imagem de células 18. Note-se que os dados do número de células são calculados normalmente mais de três câmaras microfluídicos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Um dispositivo morbidostat baixa pegada de componentes de baixo custo é demonstrada. Os aumentos no nível de resistência a drogas registadas pelo dispositivo são consistentes com os dos relatórios anteriores 5. Concebido para estudos evolutivos de resistência a drogas, o dispositivo é potencialmente aplicável a muitas outras experiências. Primeiro, um banco de dados abrangente de mutações induzidas pela droga pode ser estabelecido para um grande conjunto de antibióticos clinicamente relevantes. Por exemplo, a...

Desde a introdução da primeira penicilina antibiótico, a resistência aos antibióticos microbiana tornou-se um problema de saúde global 1. Embora a aquisição de resistência a antibióticos pode ser retrospectivamente estudados in vivo, as condições destas experiências muitas vezes não são controlados ao longo de toda a evolução 2. Alternativamente, evolução adaptativa laboratório pode revelar a evolução molecular de uma determinada espécie microbiana sob stresses ambientais ou pressão de seleção de um medicamento antibiótico 3. Recentemente, muitas experiências evolutivas bem controlados de resistência aos medicamentos antibióticos elucidaram o surgimento de resistência aos medicamentos antibióticos. Por exemplo, o grupo de Austin demonstrado surgimento rápido num ambiente compartimentado microfluidos adequadamente manipulado 4. O morbidostat recentemente desenvolvido induz a mutações sistemáticas sob droga pressão de seleção 5,6. O morbidostat, uma selec microbianação dispositivo que ajusta continuamente a concentração de antibiótico para manter uma população praticamente constante, é um grande avanço a partir do teste de flutuação utilizado em microbiologia 7,8. No teste de flutuação, uma droga antibiótica é injectada a alta concentração, e os sobreviventes mutantes são rastreadas e contadas. Em vez disso, os micróbios em um morbidostat são constantemente desafiados e adquirir múltiplas mutações. O morbidostat opera de forma semelhante ao quimiostato, cultura de um dispositivo inventado por Novick e Szliard em 1950 que mantém uma população constante através do fornecimento de nutrientes continuamente enquanto que a diluição da população microbiana 9. Desde a sua introdução, o quemostato tem sido avançado e melhorado. quimiostatos microfluídicos em curso alcançaram capacidades nanolitros e de uma única célula. No entanto, estes dispositivos não são adequados para experiências evolução adaptativa, que necessitam de uma população de células grandes com muitos eventos de mutação 10,11. Recentemente, mini-quimiostatos com volumes de trabalho de ~ 10 ml também foram desenvolvidos para preencher a lacuna entre biorreatores em escala litro eo microfluídico quemostato 12,13. Aqui apresentamos a concepção e utilização de um baixo custo, morbidostat automatizado para um estudo de resistência aos medicamentos antibióticos. O módulo proposto pode ser empregue num incubador agitador de laboratório com microbiologia requisito mínimo de hardware. O firmware open-source também é facilmente adaptado para aplicações específicas de evolução adaptativa, tais como engenharia metabólica 3. Finalmente, o morbidostat é integrado em uma plataforma microfluídica multiplexado para testes de sensibilidade aos antibióticos 14.

<table><tbody><tr><td>Incubadora de agitador ambiental</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo placa</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Resistor de carbono</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor para LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Resistor de carbono</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor para fototransistor</td></tr><tr><td>940 nm diodo emissor de luz</td><td>LED brilhante eletrônico</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Medição de densidade óptica</td></tr><tr><td>940 nm fototransistor</td><td>Kodenshi&nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Medição de densidade óptica</td></tr><tr><td>Darlington par IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>este IC aciona microbombas e unidade de agitação magnética</td></tr><tr><td>Ventilador sem escova de 5 V DC</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>spec: tensão de alimentação de 5 V e 80&nbsp; mamã; disponível www.jameco.com</td></tr><tr><td>Microbomba piezoelétrica</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>> de pressão 3&nbsp; kPa; Taxa de fluxo >5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32" OD: 3/32" L:50'&nbsp;</td></tr><tr><td>Barra de Agitação Magnética</td><td>COWIE</td><td></td><td>forma cônica dim: 10&nbsp; mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Frasco de cintilação de vidro de 20 ml</td><td>DGS</td><td></td><td>Vidro Pyrex 28 mm (diâmetro) x 61 mm (altura)</td></tr><tr><td>Suporte</td><td></td><td></td><td>para frasco de cultura Feito sob medida de Poliformaldeído&nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>usado para selar o frasco de vidro</td></tr><tr><td>Frasco médio</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 sal mínimo 5x</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cadaminoácido</td> Médio <td>BD</td><td></td><td>Glicose média</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr>Agar <td>Oxóide</td><td></td><td>bateriológico</td><td>para placa</td></tr> <tr><td>de ágarLuria Bertani microscópio médio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>invertido</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>usado para medição microfluídica Use objetiva 40X NA = 0,55</td></tr><tr><td>Incubadora de Microscópio</td><td>Instrumento de Célula Viva</td><td>-109</td><td>usado para medição microfluídica</td></tr><tr><td>Válvulas solenoidais</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normalmente aberto 1,3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>Placa de interface USB</td><td>Módulo de I/O Digital USBIO24-R</td> da <td>Hobby Engineering</td><td>para medição microfluídica</td></tr><tr><td>Compressor de ar</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Fonte de pressão para microfluidos; Pressão Máxima 80 psi</td></tr><tr><td>Conexões luer-lock macho para ValuePlastics.com de 1/8"</td><td></td><td>MTLL230-1</td><td>usadas para controle microfluídico</td></tr> 1<tr><td>/8" de barb para porta roscada 10-32</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>usadas para controle microfluídico</td></tr><tr><td>Conexões luer-lock fêmeas para porta</td> <td>roscada 10-32ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>usado para controle microfluídico</td></tr><tr><td>NPN darlington transistor 500 mA, 40&nbsp; V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>usado para controle microfluídico</td></tr><tr><td>10 kOhm, resistor de filme de carbono, 0,25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>usado para controle microfluídico</td></tr><tr><td>Capacitor de tântalo, 10&nbsp; &mu; F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>usado para controle microfluídico</td></tr><tr><td>Andor câmera CCD</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>usado para imagem microfluídica em chip</td></tr><tr><td>Leitor</td><td></td><td></td><td></td>de placa ELISA</tr><tr><td>de dois componentes Silicone&nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>usado para fabricação de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>SU-8 fotorresistente</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>usado para fabricação de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>AZ4620 fotorresistente</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>usado para fabricação de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>usado para fabricação de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>Agulha de seringa de calibre</td><td>20 BD</td><td></td><td>usado para fabricação de chips microfluídicos</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA polimerase</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>Amplificação de PCR</td></tr><tr><td>Trimetoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&nbsp;</td><td>Medição de resistência a antibióticos</td></tr></tbody></table>

concepção e utilização de um baixo custo, automated morbidostat para adaptive evolução das bactérias sob antibiótico seleção de drogas

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Descreve-se um baixo custo, morbidostat configurável para a caracterização da via evolutiva da resistência aos antibióticos. O morbidostat é um dispositivo de cultura bacteriana que monitora continuamente o crescimento bacteriano e ajusta dinamicamente a concentração da droga para desafiar constantemente as bactérias à medida que evoluem para adquirir resistência aos medicamentos. O dispositivo dispõe de um volume de trabalho de ~ 10 mL e é totalmente automatizado e equipado com medição de densidade óptica e micro-bombas para médio e entrega de droga. Para validar a plataforma, medimos a aquisição gradual de resistência trimetoprim em Escherichia coli MG 1655, e integrada com o dispositivo de microfluidos de uma plataforma multiplexado para investigar a morfologia das células e sensibilidade aos antibióticos. A abordagem pode ser up-dimensionado para estudos laboratoriais de resistência aos medicamentos antibióticos, e é extensível para adaptativa evolução de melhorias de tensão em engenharia metabólica e outros experimentos de cultura bacteriana.

O morbidostat acima descrito está esquematizado na Figura 1. As operações morbidostat comuns, incluindo a evolução experimental, teste de susceptibilidade aos antibióticos e a morfologia das células de controlo, foram validados em uma E. coli MG1655 cultura exposta ao trimetoprim (TMP), um fármaco antibiótico comumente utilizado 5,6. TMP induz aumentos graduais muito distintas em resistência aos medicamentos, e as mutações são agrupados em torno do ge...

Descrevemos um morbidostato configurável de baixo custo que permite a caracterização da resistência a antibióticos ajustando dinamicamente a concentração do medicamento. O dispositivo pode ser integrado a uma plataforma microfluídica multiplexada. A abordagem pode ser ampliada para estudos laboratoriais de resistência a antibióticos.

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

O objetivo geral deste experimento é caracterizar a trajetória evolutiva da resistência a antibióticos utilizando um morbidostato que monitora continuamente o crescimento bacteriano e ajusta dinamicamente a concentração do antibiótico à medida que as bactérias adquirem resistência ao fármaco. A principal vantagem desta técnica é que o equipamento é composto por componentes eletrônicos de baixo custo e facilmente disponíveis, podendo ser facilmente reconfigurado para fins específicos. Os procedimentos serão demonstrados por Po Cheng Liu e Yi Tai Lee, ambos alunos de pós-graduação do meu laboratório.Para montar o Morbidostato, comece usando uma agulha de 18 gauge para furar três orifícios na tampa do frasco de cultura. Corte três pedaços de tubo de polietileno com aproximadamente sete centímetros de comprimento e insira-os nos orifícios da tampa. Use fita adesiva para envolver a borda da tampa, servindo como molde para a mistura de polidimetilsiloxano, ou PDMS.Em seguida, adicione cinco gramas do componente A e 0,5 gramas do componente B da PDMS em um recipiente plástico de 150 mililitros e use um palito de dente para misturar manualmente. Carregue a mistura em uma seringa de 10 mililitros. Depois, com a seringa, injete a mistura de PDMS na tampa.Asse toda a tampa a 70 graus Celsius por oito horas para curar o PDMS. Em seguida, usando um ferro de solda, solde o ânodo do LED com o fio de bitola 24 e o cátodo do LED com o resistor de carbono. Depois, solde um resistor de carbono de 680 Ohm com um fio de bitola 24.Use fita isolante para isolar a conexão do fio. Solde o coletor do fotodetector com o fio de bitola 24 e o emissor do fotodetector com um resistor de carbono de 100 Ohm. Em seguida, use fita isolante para isolar a conexão do fio.Coloque o diodo emissor de luz no suporte do frasco de cultura. Seguindo o diagrama do circuito mostrado aqui, conecte o diodo emissor de luz e utilize uma fonte de alimentação de cinco volts para ativá-lo. Verifique se o LED está funcionando utilizando uma câmera digital que possa detectar infravermelho. Agora, coloque o fotodetector no suporte do frasco de cultura.Em seguida, seguindo o diagrama, conecte o fotodetector e utilize uma fonte de alimentação de cinco volts para alimentá-lo. Conecte o fio em ambos os lados dos resistores do fotodetector para medir a tensão através da placa de controle eletrônico. Cole um ímã no eixo do ventilador de refrigeração, que serve como unidade de agitação magnética.Como a unidade de agitação magnética é formada pelo ímã e pelo ventilador de refrigeração, é fundamental alinhar a prateleira do ventilador ao frasco de cultura. Além disso, a distância entre o frasco de cultura e o ímã é muito crítica para garantir o funcionamento estável. Conecte cada peça de tubo de polietileno do frasco de cultura à peça correspondente de tubo de silicone das microbombas, frascos de meio e frasco de resíduos.Ligue a bomba por uma hora e meça o volume total bombeado do frasco de meio para o frasco de cultura para determinar a taxa de bombeamento. A taxa de bombeamento típica deve ser de aproximadamente quatro mililitros por hora, o que corresponde à taxa de diluição de D igual a 0,33 por hora para um volume de trabalho de 12 mililitros no frasco de cultura. Quando a montagem estiver concluída, coloque todo o conjunto em um incubador agitador de tamanho médio.Para testar previamente o Morbidostato, ajuste a tensão da fonte de alimentação do ventilador de refrigeração para cinco volts para acionar seu motor e testar a barra de agitação magnética. Após preparar uma série de amostras de E. coli e traçar uma curva de calibração de acordo com o protocolo descrito, prepare o frasco de cultura com três comprimentos de sete centímetros de tubo Tygon ultra resistente a produtos químicos, com diâmetro interno de 1/32 de polegada e diâmetro externo de 3/32 de polegada, para as entradas que formarão o dispositivo. Prepare o meio mínimo M9 com 0,2% de glicose e o meio M9 contendo a droga Trimetoprima ou TMP.Em seguida, esterilize o meio, o frasco do meio, o frasco do meio com fármaco, o frasco de resíduos e o frasco de cultura em autoclave a 121 graus Celsius. No primeiro dia do experimento, descongele um mililitro de células congeladas de E-coli selvagem MG1655 à temperatura ambiente por cinco minutos e transfira 120 microlitros das células para um frasco de cultura contendo aproximadamente 12 mililitros de meio de crescimento M9. Ligue o incubador com agitação e ajuste a temperatura para 30 graus Celsius sem agitação.Inicie a operação do Morbidostato ligando a microbomba, a unidade de agitação magnética e a medição da densidade óptica. Após aproximadamente 23 horas, pare a microbomba desligando sua tensão de alimentação e retire o frasco de cultura. Adicione glicerol a 15% ao frasco de cultura e congele as amostras a menos 80 graus Celsius para armazenamento.É importante também trocar para um novo frasco de cultura no início de cada um desses experimentos para evitar formações de biotina. Caso contrário, a formação de biotina pode ocorrer em dois ou três dias. Após descongelar a amostra congelada diariamente à temperatura ambiente por cinco minutos, inocular um novo tubo de ensaio com meio M9 fresco.Coloque a amostra em um incubador com agitação a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use o meio M9 para diluir a amostra microbiana dez vezes e carregue-a no dispositivo microfluídico pressionizando o recipiente da amostra microbiana a cinco PSI. Em seguida, carregue o meio contendo TMP no chip pressionizando o recipiente de M9 com TMP a cinco PSI.Realize a mistura entre o microrganismo e a droga acionando a válvula micro-mecânica entre as duas câmaras no chip microfluídico por 15 minutos. Por fim, coloque o chip microfluídico no incubador do microscópio montado no microscópio invertido. Com uma câmera CCD, adquira imagens das células na câmara de crescimento a cada hora durante oito horas.Calcule os dados de número de células de acordo com o protocolo descrito no texto. As operações comuns do Morbidostato, incluindo evolução experimental, teste de suscetibilidade a antibióticos e verificação da morfologia celular, foram realizadas utilizando um cultivo de E-coli MG1655 exposto ao antibiótico TMP, o qual induz um aumento distintivo em etapas na resistência ao fármaco, com mutações agrupadas ao redor do gene da di-hidrofolato redutase, ou DHFR. A cada dia, espera-se que o microrganismo cresça acima do limite pré-definido de densidade óptica e acione a injeção do fármaco, conforme mostrado aqui.Espera-se que a injeção do fármaco iniba o crescimento e, como resultado, reduza a densidade óptica. Este gráfico mostra o aumento temporal da resistência a antibióticos em um experimento para determinar a CI50. A resistência ao fármaco aumentou aproximadamente 1500 vezes, atingindo 1.000 microgramas por mililitro em cerca de 12 dias.Conforme observado anteriormente. As mutações pontuais no DHFR no mutante do último dia foram medidas por sequenciamento Sanger e estão listadas nesta tabela. A aquisição de resistência ao fármaco com múltiplas mutações comprova a utilidade do Morbidostato.Como a seleção em placas de ágar contendo drogas tende a conferir apenas uma única mutação, esta figura exibe as curvas de crescimento em chip em várias concentrações de TMP. As amostras mutantes mostram um aumento significativo na resistência ao antibiótico.Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que os pesquisadores estudassem a posição da resistência bacteriana a antibióticos em um ambiente de laboratório com controle real. Após este procedimento, outras medidas, como a análise microfluídica de célula única, podem ser realizadas para responder perguntas adicionais, como se a morfologia ainda muda devido à exposição a medicamentos antibióticos. Uma vez dominado, este dispositivo pode ser facilmente reconfigurado para todos os experimentos de cultura bacteriana, como o cultivo de um sinal de bactérias ou o aumento do nível de tolerância a custos de uma linhagem bacteriana.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar a aquisição de resistência a antibióticos em um experimento real de evolução adaptativa em laboratório com controle. Não se esqueça de manipular as bactérias resistentes aos fármacos de acordo com as regras de biossegurança para a prática microbiológica. Pode ser necessária permissão especial para um experimento envolvendo o treinamento básico de bactérias.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

Fonte: Liu, P. C., et al. Projeto e uso de um morbidostato automatizado de baixo custo para evolução adaptativa de bactérias sob seleção de antibióticos. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra o uso de um chip microfluídico para visualizar e comparar o crescimento e a morfologia de cepas de E. coli do tipo selvagem e resistentes ao trimetoprima sob estresse antibiótico trimetoprima.

Crescimento bacteriano em um chip microfluídico para estudar a resistência a antibióticos

Fonte: Jian, X., et al., Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando o Sistema de Cultura de Microgotículas Microbianas (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra o uso de um sistema de cultura de microgotículas microbianas para impulsionar a evolução adaptativa das bactérias em direção à tolerância ao metanol. Ao misturar culturas bacterianas modificadas com um meio de estresse de alto teor de metanol e segmentá-las em microgotículas, o sistema seleciona mutantes que...

Evolução adaptativa de bactérias usando um sistema de cultura de microgotículas microbianas

Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Temos desenvolvido e validado um conjunto de pequenas dimensões de quimiostatos em miniatura construído a partir de partes prontamente disponíveis para baixo custo. Resultados evolução fisiológica e experimental foram semelhantes aos quimiostatos de maior volume. A matriz ministat fornece uma plataforma compacta, barata e acessível para experimentos quemostato tradicionais, a genômica funcional e aplicações de rastreamento de produtos químicos.

Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

As bactérias podem acumular mutações prejudiciais ou benéficas durante a vida. Em uma população de células indivíduos que acumularam mutações benéficas podem rapidamente superar seus companheiros. Aqui apresentamos um procedimento simples para visualizar a competição de intraespécies em uma população de células bacterianas ao longo do tempo usando indivíduos rotulados fluorescentes.

Monitorando a competição de subespécies em uma população de células bacterianas por cocultivação de cepas fluorescentes rotuladas

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Aqui nós apresentamos um método experimental para testar o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos.

Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos

A estrutura eVOLVER permite a cultura microbiana contínua de alto débito com alta resolução e controle dinâmico sobre parâmetros experimentais. Este protocolo demonstra como aplicar o sistema para realizar um experimento de condicionamento físico complexo, orientando os usuários a programar o controle automatizado sobre muitas culturas individuais, medindo, coletando e interagindo com dados experimentais em tempo real.

Projetando experimentos de crescimento de células contínuas, de alta produtividade e automatizados usando o eVOLVER

A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

Este protocolo fornece um método para a otimização global sistemática de biossensores geneticamente codificados por meio da geração e avaliação de bibliotecas genéticas assistidas por automação. Isso é combinado com metodologias de design de experimento para agilizar a experimentação e permitir a seleção de componentes genéticos para ajustar os biossensores a resultados de design específicos.

Amostragem eficiente de espaço de design de biossensor geneticamente codificado habilitado com um design de experimentos e fluxo de trabalho de automação

Aprenda a usar um morbidostat de baixo custo para estudar a evolução adaptativa de bactérias sob seleção de antibióticos. Este método permite monitorar o crescimento bacteriano em tempo real e ajustar dinamicamente as concentrações de drogas.

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas (Vídeo) | JoVE Journal

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

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