Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

Descrevemos um morbidostato configurável de baixo custo que permite a caracterização da resistência a antibióticos ajustando dinamicamente a concentração do medicamento. O dispositivo pode ser integrado a uma plataforma microfluídica multiplexada. A abordagem pode ser ampliada para estudos laboratoriais de resistência a antibióticos.

O objetivo geral deste experimento é caracterizar o caminho evolutivo da resistência aos antibióticos usando um Morbidostat que monitora continuamente o crescimento bacteriano e ajusta dinamicamente a concentração de antibióticos à medida que as bactérias adquirem resistência aos medicamentos. A principal vantagem desta técnica é que a configuração é feita de componentes eletrônicos de baixo custo e facilmente disponíveis e pode ser facilmente reconfigurada para meios específicos. Demonstrando os procedimentos estarão Po Cheng Liu e Yi Tai Lee, ambos alunos de pós-graduação do meu laboratório.

Para montar o Morbidostat, comece usando uma agulha de calibre 18 para fazer três furos na tampa do frasco de cultura. Corte três pedaços de tubo de polietileno com aproximadamente sete centímetros de comprimento e insira-os nos orifícios da tampa. Use fita adesiva para enrolar a borda da tampa para servir como molde para a mistura de polidimetilsiloxano, ou PDMS.

Em seguida, adicione cinco gramas do componente A e 0,5 gramas do componente B do PDMS em um recipiente de plástico de 150 mililitros e use um palito para mexer manualmente. Coloque a mistura em uma seringa de 10 mililitros. Em seguida, com a seringa, injete a mistura PDMS na tampa.

Asse toda a tampa a 70 graus Celsius por oito horas para curar o PDMS. Em seguida, usando um ferro de solda, solde o ânodo de LED com o fio de calibre 24 e o cátodo de LED com o resistor de carbono. Em seguida, solde um resistor de carbono de 680 Ohm com um fio de calibre 24.

Use fita isolante para isolar a conexão do fio. Solde o coletor do fotodetector com o fio de calibre 24 e o emissor do fotodetector com um resistor de carbono de 100 Ohm. Em seguida, use fita isolante para isolar a conexão do fio.

Coloque o diodo emissor de luz no suporte do frasco para injetáveis de cultura. Seguindo o diagrama de circuito mostrado aqui, conecte o diodo emissor de luz e use uma fonte de alimentação de cinco volts para alimentá-lo. Certifique-se de que o LED funcione usando uma câmera digital que possa detectar IR. Agora coloque o fotodetector no suporte do frasco de cultura.

Em seguida, seguindo o diagrama, conecte o fotodetector e use uma fonte de alimentação de cinco volts para alimentá-lo. Conecte o fio a ambos os lados dos resistores do fotodetector para medir a tensão na placa de controle eletrônico. Cole um ímã no eixo do ventilador de resfriamento que serve como unidade de agitação magnética.

Como a unidade de agitação magnética é formada a partir do ímã e do ventilador de resfriamento, é crucial alinhar a prateleira do ventilador ao frasco de cultura. Além disso, a distância entre o frasco de cultura e o ímã é muito crítica para garantir a operação estável. Conecte cada pedaço de tubo de polietileno do frasco de cultura no pedaço correspondente de tubo de silicone para as microbombas, frascos médios e frasco de resíduos.

Ligue a bomba por uma hora e meça o volume total que está sendo bombeado do frasco médio para o frasco de cultura para determinar a taxa de bombeamento. A taxa de bombeamento típica deve ser de aproximadamente quatro mililitros por hora, o que corresponde à taxa de diluição de D igual a 0,33 por hora para um volume de trabalho de 12 mililitros do frasco de cultura. Quando a configuração estiver concluída, coloque todo o conjunto em uma incubadora vibratória de tamanho médio.

Para pré-testar o Morbidostat, defina a tensão da fonte de alimentação do ventilador de resfriamento para cinco volts para dar partida no motor e testar a barra de agitação magnética. Depois de preparar uma série de amostras de E-coli e traçar uma curva de calibração de acordo com o protocolo de texto, prepare o frasco de cultura com três comprimentos de sete centímetros de tubo Tygon ultra resistente a produtos químicos com um diâmetro interno de 132 polegadas e um diâmetro externo de 332 polegadas para que as entradas formem o dispositivo. Prepare o meio mínimo M9 com glicose a 0,2% e o M9 contendo o medicamento Trimetoprim ou TMP.

Em seguida, esterilize o frasco médio, o frasco médio do medicamento, o frasco de resíduos e o frasco de cultura em uma autoclave a 121 graus Celsius. No primeiro dia do experimento, descongele um mililitro de células E-coli MG1655 do tipo selvagem congeladas em temperatura ambiente por cinco minutos e transfira 120 microlitros das células para um frasco de cultura contendo aproximadamente 12 mililitros de meio de crescimento M9. Ligue a incubadora agitada e ajuste a temperatura para 30 graus Celsius sem agitação.

Inicie a operação do Morbidostat ligando a microbomba, a unidade de agitação magnética e a medição da densidade óptica. Após aproximadamente 23 horas, pare a microbomba desligando sua tensão de alimentação e retire o frasco de cultura. Adicione 15% de glicerol no frasco de cultura e congele as amostras a 80 graus Celsius negativos para armazenamento.

Mudar para um novo frasco de cultura no início de cada um desses experimentos também é importante para evitar a formação de biotina. Caso contrário, a formação de biotina pode ocorrer dentro de dois ou três dias. Depois de descongelar a amostra congelada diariamente à temperatura ambiente por cinco minutos, inocular um novo tubo de ensaio com meio M9 fresco.

Coloque a amostra em uma incubadora agitada a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use o meio M9 para diluir a amostra microbiana dez vezes e carregue-a no dispositivo microfluídico pressionando o recipiente de amostra microbiana a cinco PSI. Em seguida, carregue o meio contendo TMP no chip pressionando o M9 com o recipiente TMP a cinco PSI.

Execute a mistura entre o micróbio e o medicamento acionando a válvula micromecânica entre as duas câmaras no chip microfluídico por 15 minutos. Por fim, coloque o chip microfluídico na incubadora do microscópio montada no microscópio invertido. Com uma câmera CCD, adquira imagens de células na câmara de crescimento a cada hora durante oito horas.

Calcule os dados do número de células de acordo com o protocolo de texto. As operações comuns do Morbidostato, incluindo evolução experimental, teste de suscetibilidade a antibióticos e verificação da morfologia celular, foram invalidadas usando uma cultura de E-coli MG1655 exposta ao antibiótico TMP, que induz um aumento distinto na resistência aos medicamentos com mutações agrupadas em torno do gene da diidrofolato redutase, ou DHFR. A cada dia, espera-se que o micróbio cresça acima do limite de densidade óptica predefinido e desencadeie a injeção do medicamento, conforme mostrado aqui.

Espera-se que a injeção do medicamento iniba o crescimento e, como resultado, diminua a densidade óptica. Este gráfico mostra o aumento temporal da resistência aos antibióticos em um experimento para determinar o IC50. A resistência aos medicamentos aumentou aproximadamente 1500 vezes para 1.000 microgramas por mililitro em cerca de 12 dias.

Consistente com descobertas anteriores. As mutações pontuais de DHFR no mutante do último dia foram medidas por sequenciamento de Sanger e estão listadas nesta tabela. A aquisição de resistência a drogas com múltiplas mutações comprova a utilidade do Morbidostat.

Como a seleção em placas de ágar contendo fármaco tende a conferir apenas a mutação única. Esta figura exibe as curvas de crescimento no chip em várias concentrações de TMP. As amostras mutantes mostram um aumento significativo na resistência aos antibióticos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores estudarem a posição da resistência aos antibióticos em um ambiente real de laboratório de controle. Após este procedimento, outras medidas, como a medição microfluídica de uma única célula, podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como a morfologia ainda muda devido à exposição a antibióticos. Uma vez dominado, este dispositivo pode ser facilmente reconfigurado para todos os experimentos de cultura bacteriana, como o cultivo de um sinal de bactéria ou o aumento do nível de tolerância de custo de uma cepa bacteriana.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar a aquisição de resistência a antibióticos em um experimento evolutivo de laboratório adaptativo de controle real. Não se esqueça de manusear as bactérias resistentes a medicamentos de acordo com as regras de biossegurança para a prática microbiológica. Pode ser necessária uma autorização especial para uma experiência que envolva o treino básico de bactérias.