Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

O objetivo geral desta abordagem experimental é investigar a resposta imune à infecção do trato urinário e evitar a comparação direta entre animais machos e fêmeas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave da imunologia da mucosa relacionadas a como homens e mulheres respondem à infecção do trato urinário. A principal vantagem é que a infecção é estabelecida através da raiz natural.

Tivemos a ideia desse método pela primeira vez depois de observar com que frequência é afirmado que a instalação da bexiga dos camundongos machos é impossível. Embora esse método forneça informações sobre a infecção do trato urinário, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como câncer de bexiga. Para começar, prepare uma cânula de acesso intravenoso pediátrico para cada grupo de camundongos a ser infectado.

Usando o mecanismo de mola embutido, retire cada cânula de sua agulha conforme as instruções do fabricante. Descarte as agulhas, preservando apenas a cânula intravenosa de plástico. Esterilize os cateteres em uma capela de fluxo laminar por um ciclo UV de aproximadamente 25 a 30 minutos.

Depois de passar em cultura noturna de e coli uropatogênica, ou UPEC, de acordo com o protocolo de texto, gire a suspensão bacteriana em uma microcentrífuga de mesa a 17.000 vezes g por um minuto e ressuspenda o pellet bacteriano resultante duas vezes 10 elevado à oitava UFC por mililitro em PBS. Diluir em série uma alíquota de suspensão e aplicar em ágar LB com antibióticos, se apropriado, para determinar o inóculo exato para cada infecção. Puxe o inóculo bacteriano para uma seringa de um mililitro e conecte o cateter à extremidade da seringa.

Bata na seringa para remover qualquer ar e pressione o êmbolo para preencher o espaço de ar morto no cateter antes de iniciar a instilação. Depois de anestesiar um camundongo fêmea de acordo com um protocolo aprovado, coloque o animal em decúbito dorsal e aplique pressão média na parte inferior do abdômen para esvaziar a bexiga de urina. Bexigas cheias parecem uma ervilha sob a pele, entre as cristas ilíacas.

Quando a bexiga estiver vazia, usando a mão não dominante, coloque o polegar na cauda e um dedo da mesma mão no abdômen do camundongo e aplique uma leve pressão em direções opostas para segurar o mouse firmemente no lugar. Em seguida, coloque a ponta do cateter perpendicular ao camundongo no orifício uretral e, em seguida, com uma leve pressão, deslize o cateter na uretra até que o cubo encontre o orifício uretral, enquanto abaixa simultaneamente a seringa para que fique paralela à superfície de trabalho. Assim que o cateter estiver no lugar, use um dedo da mão não dominante que está apoiada no abdômen do camundongo para puxar suavemente a pele abdominal em direção à cabeça do camundongo.

Observe que o orifício uretral não se moverá. No entanto, se os cateteres estiverem na vagina, o tecido se moverá para cima e para longe do cateter. Com o hub do cateter contra o orifício uretral, dispense lentamente 15 microlitros do inóculo bacteriano.

Uma taxa de instalação lenta minimiza o refluxo vesicoureteral para o rim. Remova lentamente o cateter para evitar vazamentos. Em seguida, coloque o animal em sua gaiola em decúbito dorsal.

Para inocular camundongos machos, coloque duas pinças de polegar cranialmente e caudalmente à genitália externa do camundongo. Retraia o prepúcio para expor totalmente o pênis da glândula. Então, uma vez que o pênis esteja posicionado externamente, solte a pinça do polegar.

Reposicione a pinça para estabilizar o pênis saliente perpendicular ao animal, segurando o órgão suavemente, mas esticado. Em seguida, através da pequena abertura na ponta do meato uretral, introduza cuidadosamente o cateter e guie-o suavemente para dentro do pênis usando uma pinça para manter suavemente a tensão. Assim que o hub dos cateteres encontrar a ponta do pênis, dispense muito lentamente 50 microlitros do inóculo, mantendo a posição do pênis.

Observe a qualidade da instilação de acordo com um índice de qualidade de instilação predeterminado, como o mostrado aqui. Retraia o cateter lentamente ao longo de cinco segundos para evitar vazamento do inóculo. Coloque o mouse em sua gaiola em decúbito dorsal.

O animal deve começar a se recuperar 30 a 45 minutos após a administração do anestésico. Depois de sacrificar os ratos de acordo com um protocolo aprovado, use 70% Epinal para umedecer completamente o abdômen para minimizar a contaminação pelo pelo. Usando uma tesoura, faça uma incisão de dois centímetros no terço inferior do abdômen do camundongo e remova assepticamente a bexiga e quaisquer outros órgãos desejados.

Transfira os órgãos para tubos de polipropileno de cinco mililitros, contendo um mililitro de PBS estéril e mantenha todas as amostras no gelo. Com um homogeneizador portátil, homogeneizar os órgãos até que quase não reste tecido sólido. Descarte qualquer tecido adiposo bege-branco brilhante que não homogeneize bem.

Em seguida, use Epinal, seguido de PBS para lavar o homogeneizador entre cada grupo experimental ou de órgãos. Depois de preparar diluições seriadas de suspensão de órgãos homogeneizados, diluições em placas de ágar LB, com antibióticos quando apropriado, e incubar a 37 graus Celsius durante a noite. Para realizar a citometria de fluxo no tecido da bexiga, depois de isolar a bexiga, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, use uma tesoura para picar bem o tecido.

Adicione uma bexiga picada por tubo contendo tampão de digestão. Em seguida, agite o tubo para lavar o tecido picado no tampão de digestão e mantenha-o no gelo até que todas as bexigas sejam dissecadas e picadas. Incube as bexigas picadas a 37 graus Celsius, por 60 a 75 minutos com agitação vigorosa com as mãos por cinco segundos, a cada 15 minutos.

Quando o tecido tem uma aparência transparente vítrea semelhante a papel de seda úmido, a digestão é completa. Inative as enzimas de digestão adicionando dois a três mililitros de tampão de citometria de fluxo gelado e misture suavemente. Em seguida, coloque os tubos no gelo.

Para garantir uma suspensão unicelular e remover qualquer tecido conjuntivo, passe o conteúdo do tubo através de um filtro de 100 micrômetros colocado em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, com a ponta de um êmbolo de seringa, pressione suavemente qualquer tecido restante através do filtro. Lave o filtro com mais dois mililitros de tampão de citometria de fluxo e mantenha as amostras no gelo.

Lave as amostras por centrifugação a 200 vezes g e quatro graus Celsius, por sete minutos. Ressuspenda os pellets em 100 microlitros de tampão de citometria de fluxo contendo bloco Fc, diluído a cinco microgramas por mililitro, e transfira para uma placa de fundo redondo de 96 poços. Após 10 a 15 minutos, adicione 100 microlitros do coquetel de anticorpos desejado a cada amostra.

Em seguida, incube as amostras em gelo protegido da luz por 30 a 45 minutos. Lavar as amostras por centrifugação a 200 vezes g e quatro graus Celsius durante sete minutos. Finalmente, ressuspenda os grânulos de células em 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo e passe as amostras por um filtro de células de 40 micrômetros em um tubo de poliestireno de cinco mililitros, pouco antes da aquisição em um citômetro de fluxo.

Esta figura mostra dados representativos de camundongos infectados por 24 horas. A carga bacteriana foi equivalente entre camundongos machos e fêmeas 24 horas após a infecção. Para determinar se a perda de inóculo no momento da infecção afetou o estabelecimento da infecção, cada instilação foi pontuada em uma escala de um a cinco, sendo uma a mais ideal.

A colonização bacteriana foi determinada 24 horas após a infecção. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as UFC obtidas de animais com diferentes escores de instilação, avaliados por um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, comparando a classificação média de cada coluna com a classificação média de todas as outras colunas e corrigindo para comparações múltiplas usando um teste de Dunn. Pode-se concluir que instilações abaixo do ideal, resultando em vazamento substancial de inóculo bacteriano durante a infecção, não afetam significativamente a colonização bacteriana em 24 horas.

É importante ressaltar que a frequência da instilação abaixo do ideal diminuirá com a prática. Finalmente, embora o número de células imunes CD45 positivas, presentes em animais virgens, não tenha sido diferente entre camundongos fêmeas e machos, houve um aumento estatisticamente significativo na infiltração nas bexigas de camundongos fêmeas infectados. Ao tentar o cateterismo, é importante usar movimentos lentos e suaves.

Com seu desenvolvimento, essa técnica nos ajudou a explorar as diferenças de imunidade baseadas no sexo na bexiga de animais machos e fêmeas.