Name: Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda cateterismo transuretral em ratos machos e fêmeas para estudar infecções urinárias e respostas imunes diferenciadas entre sexos. Este método permite investigar patologias da bexiga em ambos os sexos.

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Agradecemos o Dr Matthieu Rousseau pela leitura crítica do manuscrito e o Laboratory of Immunobiology dendríticas para suas introspecções úteis durante o desenvolvimento do presente protocolo e projeto. Este trabalho foi financiado em parte por fundos da União Europeia sétimo programa Marie Curie acção-quadro (PCIG11-GA-2012-3221170 e o LabEx imuno-Oncologia (AMI).

Mouse experimentos foram conduzidos em conformidade com a aprovação do protocolo número 2012-0024 pelo Comitê d'éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (Comitê de ética para experimentação animal), em aplicação da Directiva 2010/63 Europeu UE.
1. preparação de cateteres
<ol><li>Prepare uma cânula de acesso intravenosa pediátrica para cada grupo de ratos para ser infectado. Usando o mecanismo de mola embutido, alienar cada cânula de sua agulha, conforme as instruções do fabricante. Descarte as agulhas, preservando apenas a plástica cânula intravenosa.</li>
	<li>Esterilize os cateteres em uma capa de fluxo laminar para o ciclo de um ultravioleta (UV), geralmente de 25 a 30 min. Nota: Os cateteres podem ser usados para mais do que um rato, porém um novo cateter deve ser usado entre grupos experimentais, sexos ou estirpes bacterianas.</li>
</ol>2. preparação de Uropathogenic e. coli para infecção
<ol><li>Pelo menos dois dias antes da infecção, utilizando uma ansa de inoculação estéril, raia UPEC de um estoque de bactérias congelada em uma placa de ágar caldo Luria (LB), contendo antibióticos, se for o caso. Incube a 37 ° C durante a noite. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C por até uma semana.</li>
	<li>Em um Erlenmeyer 100 ml estéril, inocular 10 ml LB, contendo antibióticos, se for caso disso, com uma única colônia da placa LB e incubar a 37 ° C durante a noite (aproximadamente 16-18 hr) de pé. Nota: Culturas permanentes permitem a expressão do tipo 1 pili, que são necessários para infecção23. Culturas cultivadas tremendo terá menos eficiente expressão de pili e, portanto, inconsistentes taxas de infecção.</li>
	<li>Medir a densidade óptica (OD)600 da cultura durante a noite e calcular o número de bactérias / ml, utilizando uma curva de crescimento pré-determinado. Como um exemplo, para a tensão UPEC UTI89, OD600 = 0.35 é equivalente a 2 x 108 UFC / ml, assim, uma cultura durante a noite com uma OD600 = 2.4 seria equivalente a 13,7 x 108 UFC por ml. determinar empiricamente a relação entre o OD600 e bactérias viáveis com cada nova estirpe utilizada para a infecção.</li>
	<li>
Determine a quantidade de bactérias necessárias, considerando o número de animais para ser infectado, e que cada rato deve receber aproximadamente 107 formadoras unidades (CFU) em 50 µ l de PBS. Inclua no cálculo o volume morto ~ 130 µ l do cateter e a seringa nub e 100 µ l necessários para determinar o inóculo.
	<ol>
<li>Girar a suspensão bacteriana em mesa microcentrifuga a 17.000 x g por 1 min e ressuspender o precipitado resultante bacteriana em 2 x 108 UFC / ml de PBS. Serialmente Dilua uma alíquota desta suspensão e placa no ágar LB, com antibióticos, se for caso disso determinar o exato inóculo para cada infecção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desenhar o inóculo bacteriano em uma seringa de 1 ml e fixe o cateter ao final da seringa. Toque a seringa para remover todo o ar e pressione o êmbolo para preencher o espaço de ar morto no cateter antes de iniciar a instilação.</li>
</ol>3. preparação dos ratos
<ol><li>Anestesia os ratos através de injeção intraperitoneal de 100 mg/kg quetamina e 5 mg/kg de xilazina. Calor suplementar pode ser fornecido.</li>
	<li>Certifique-se de que cada rato é totalmente sedado apertando o Whitney com média pressão. Os ratos são totalmente sedados quando eles não reagir e exigir 3-5 min para chegar a este estado.</li>
	<li>Coloque os ratos em decúbito dorsal e aplique uma pressão média do abdômen inferior para esvaziar a bexiga de urina. Como uma ervilha debaixo da pele entre as cristas ileac bexigas completa? Nota: Isoflurano inalado tem sido utilizado para cateterismo ratos fêmeas15,22, no entanto, ele não foi testado se ratos masculinos são suficientemente anestesiados por isoflurano inalado para este procedimento.</li>
</ol>4. transuretral instilação de ratos fêmeas
<ol><li>Usando a mão não dominante, coloque o polegar sobre a cauda e um dedo da mesma mão no abdômen do mouse e aplique uma pressão suave em opostas direções para segurar o mouse firmemente no lugar.</li>
	<li>
Coloque a ponta do cateter perpendicular ao rato no orifício uretral. Com uma pressão suave, deslize o cateter na uretra, até que o hub encontra o orifício uretral, reduzindo simultaneamente a seringa para que é paralela à superfície de trabalho. O cateter não necessita de lubrificação. Não empurre ou forçar o cateter na uretra. O cateter deve deslizar suavemente e facilmente na uretra, com pouca ou nenhuma resistência.
	<ol>
<li>Antes de instilar o inóculo (passo 4.3), uma vez o cateter está no lugar, muito gentilmente puxe a pele abdominal na direcção da cabeça do mouse com o dedo desde o não-dominante mão que já está no abdômen do mouse (passo 4.1). Se o cateter está na uretra, o tecido compondo o orifício da uretra não se moverá, Considerando que se incorretamente, o cateter é colocado na vagina, se moverá o tecido e afaste o cateter. Este teste rápido deve ser executado em cada rato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando o hub do cateter se encontra o orifício uretral, lentamente dispense 50 µ l de inóculo bacteriano. Uma taxa de instilação lenta minimiza refluxo vesico-ureteral para o rim. Remova lentamente o cateter para evitar fugas, ao longo de uma contagem de 5. Coloque os ratos em suas gaiolas em posição supina.</li>
</ol>5. transuretral instilação de camundongos machos
<ol><li>Coloque dois pinça de polegar cranialmente e caudalmente a genitália externa do rato. Retrai o prepúcio para expor totalmente a glande. Uma vez que o pênis é posicionado externamente, solte a pinça de polegar.</li>
	<li>Reposicione o fórceps para estabilizar o pênis saliente perpendicular ao animal, segurando o órgão suavemente, mas esticada. Visualize o meato uretral e introduzir o cateter cuidadosamente a pequena abertura na ponta do órgão. Gentilmente guia o cateter dentro do pênis, em direção ao corpo do mouse, mantendo uma tensão suave com a pinça. O cateter não necessita de lubrificação. Não force o cateter dentro do pênis; o cateter deve deslizar suavemente na uretra, indicando o correto posicionamento.</li>
	<li>Uma vez que o hub do cateter encontra a ponta do pênis, muito lentamente, dispense 50 µ l de inóculo, enquanto mantém a posição do pênis. A qualidade da instilação pode referir-se neste momento de acordo com um índice de qualidade de instilação predeterminado, como mostrado na Figura 2.</li>
	<li>Retrai o cateter lentamente, ao longo de uma contagem de 5, para impedir o escapamento do inóculo. Coloque os ratos em suas gaiolas em posição supina. Os animais devem começar a recuperar 30-45 min após a administração do anestésico.</li>
</ol>6. determinação de UFC em órgãos infectados
<ol><li>Nos pontos de tempo pré-determinado, sacrifício ratos usando aprovaram procedimentos habituais de funcionamento (por exemplo, deslocamento cervical ou overdose de dióxido de carbono). Umedeça o abdômen completamente com etanol a 70% para minimizar a contaminação pela pele.</li>
	<li>Fazer uma incisão através do terço inferior do abdome do rato de pelo menos 2 cm com uma tesoura e remover assepticamente a bexiga e quaisquer outros órgãos desejados, incluindo mas não limitado a, rins, testículos, vesículas seminais ou Glândulas Prepuciais, em 5 ml tubos de polipropileno snap cap contendo 1 ml PBS estéril. Mantenha todas as amostras no gelo.</li>
	<li>Homogeneizar os órgãos com um homogeneizador portátil até quase nenhum tecido sólido permanece, aproximadamente 15 a 60 segundos dependendo do órgão. Gordura não homogeneizar bem e é facilmente reconhecível como brilhante tecido Bege-branca. Descarte a seguir ou gordura antes de homogeneização. Lave o homogenizador em etanol seguido de PBS entre cada experimental ou grupo de órgãos. Nota: Normalmente, use Homogeneizadores portátil ou Homogeneizadores de moinho do grânulo. Enquanto todos estes sistemas têm rendido resultados semelhantes, conforme determinado pela comparação direta de UFC bacteriana a pós-infecção 24h, as condições ideais para homogeneizar o tecido do hospedeiro, preservando a viabilidade bacteriana devem ser determinadas empiricamente, antes Este protocolo realizando rotineiramente.</li>
	<li>Realize diluições em série de suspensões de órgão homogeneizada. Diluições em placas de ágar LB, contendo antibióticos, quando for caso disso, a placa e incubar durante a noite (~ 15 hr) a 37 ° C. UPEC estirpes têm vezes dobrando muito rápidos, e como tal, deve ter cuidado para não incubar as placas de ágar há muito tempo, porque isto vai dificultar a capacidade de contagem das colónias individuais.</li>
</ol>7. fluxo Cytometric análise de tecido da bexiga
<ol><li>Prepare a solução tampão de digestão com colagenase em 34 unidades/mL e DNase em 100 µ g/mL, em PBS. Manter-se no gelo. Prepare um tubo cônico de 15 ml por animal a ser analisado e alíquota 1 ml de tampão de digestão por tubo.</li>
	<li>Em momentos pré-determinados, sacrifício ratos usando aprovaram procedimentos habituais de funcionamento (por exemplo, deslocamento cervical ou overdose de dióxido de carbono). Umedeça o abdômen completamente com etanol a 70% para minimizar a contaminação pela pele.</li>
	<li>
Fazer uma incisão através do terço inferior do abdome do rato de pelo menos 2 cm com uma tesoura e remover a bexiga inteira. Pique bem com uma tesoura, corte a bexiga em 2-3 mm2 tamanho peças, normalmente cerca de 8 peças.
	<ol>
<li>Adicione uma bexiga picada por tubo contendo tampão de digestão. Agite para lavar o tecido da bexiga picada para o buffer de digestão. Mantenha-se no gelo até todas as bexigas são dissecadas e picadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar a picada bexigas por 60-75 min a 37 ° C, com agitação vigorosa à mão por 5 s cada 15 min. Quando o tecido tem uma aparência transparente vítrea, papel de tecido molhado, assemelhando-se a digestão é completa. Digestão prolongada irá remover proteínas de superfície das células necessárias para a identificação e deve ser evitado.</li>
	<li>Inativar as enzimas de digestão pela adição de 2-3 mL de tampão de citometria de fluxo gelada (PBS contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) e 0,2 mM EDTA) e misture delicadamente. Coloque os tubos em gelo.</li>
	<li>Para garantir uma suspensão de célula única e remover todo o tecido conjuntivo, passe o conteúdo do tubo através de um filtro de 100 µm, colocado em um tubo cônico de 15 mL. Pressione suavemente qualquer tecido restante através do filtro com o fim de um êmbolo da seringa. Lave o filtro com um adicional 2 mL de tampão de citometria de fluxo. Mantenha as amostras no gelo.</li>
	<li>Lavar as amostras por centrifugação durante 7 min a 200 x g, 4 ° C. Resuspenda pelotas em 100 µ l fluxo cytometry contendo Fc bloco amortecedor, diluído a 5 µ g/mL e transferir para um 96-poço redondo placa inferior. Após 10-15 min, adicione 100 µ l desejado cocktail de anticorpo para cada amostra. Incube as amostras por 30-45 min, no gelo, protegido da luz. Nota: O bloco Fc é um reagente usado para prevenir a ligação da porção Fc dos anticorpos para as células que expressam receptores de Fc. Seu objetivo é minimizar a ligação de anticorpos inespecíficos. Determinação de anticorpos para usar será dependente a hipótese que está sendo testada no experimento e deve ser seleccionada com a entrada da literatura. Na Figura 3, para medir a infiltração de células imunes no geral, um anticorpo anti-CD45 foi empregado, que é uma proteína celular pan-imune.</li>
	<li>Lavar as amostras por centrifugação durante 7 min a 200 x g, 4 ° C. Resuspenda pelotas de célula em 200 buffer de citometria de fluxo µ l e passar as amostras através de um filtro de célula 40 µm em um tubo de 5 ml de poliestireno apenas antes da aquisição de um citômetro de fluxo.</li>
	<li>Colete a amostra inteira sobre o citômetro de fluxo. Uma boa digestão irá produzir 200.000-400.000 células, com 8.000-10.000 CD45+ células do sistema imunológico de bexigas de rato ingênuo, enquanto órgãos infectados irão conter mais células16 (Figura 3). Nota: As amostras preparadas para análise de fluxo cytometric não podem ser usadas para avaliar CFU. Não é aconselhável dividir a bexiga em duas partes como nenhuma evidência existe para demonstrar essa colonização UPEC ou infiltração de células imunes é uniforme em todo o tecido.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Instilação transuretral de ratos masculinos oferece muitas novas oportunidades de pesquisa para a influência do sexo sobre a doença da mucosa da bexiga, mas também apresenta vários desafios. Acima de tudo, uma limitação é que a instilação inicialmente pode provar para ser tecnicamente difícil, resultando em inflamação excessiva durante a inserção do cateter. Melhoria na técnica pode ser conseguida a instilação de ratos mortos com uma solução colorida, como corante de azul de Evans. Para confirmar que a instilação é bem s...

Infecções do trato urinário (ITU) são uma das infecções mais comuns em países desenvolvidos1. Taxas de infecção são semelhantes entre as fêmeas e os machos entre os recém-nascidos e os idosos2. Mulheres adultas na pré-menopausa, no entanto, têm uma incidência muito maior de ITU adquirida na Comunidade em comparação com os homens,2,3. Dado que esta doença afeta principalmente as mulheres, de investigação fundamental e clínica centrou-se esmagadoramente na UTI nas fêmeas. No entanto, a ITU em homens é um desafio de saúde significativos e pouco estudado4. Com efeito, porque a ITU em homens estão associadas a maior morbidade, estas infecções rotineiramente são definidas como complicado4,5.
Como nosso entendimento do papel central de enviesamentos de sexo na fisiologia e patologia evolui, novos métodos são necessários para explorar este aspecto anteriormente negligenciado da doença. Diferenças de sexo desempenham um papel essencial na imunidade e infecção; as fêmeas têm maior incidência de doença auto-imune, enquanto os machos são mais suscetíveis a determinadas infecções, como tuberculose, malária e HIV6,7. Câncer de bexiga, outra patologia urológica, é significativamente mais prevalente em homens do que nas mulheres, e vários estudos têm demonstrado um papel de andrógenos no desenvolvimento de malignidade8,9,10,11 ,12. Nomeadamente, no entanto, investigação de terapias intravesical para câncer de bexiga é realizada exclusivamente em fêmeas, devido à incapacidade de cateterismo repetidamente camundongos machos13.
O estudo da patogênese da ITU confia pesadamente em modelos de roedores de infecção (por exemplo, ratos e ratazanas). Murino modelos de UTI podem empregar uropathogens originalmente isolados de infecções humanas, tais como uropathogenic e. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcusou Proteus14. Normalmente, as bactérias são introduzidas o bexiga através de cateterismo da uretra. Após a infecção, bexiga e rins podem ser removido para avaliar parâmetros específicos de infecção, tais como a colonização bacteriana, dano tecidual ou anfitrião resposta imune15,16. Universalmente, no entanto, apenas fêmeas são utilizadas para pesquisa de ITU. De fato, muitos estudos observaram que, devido a razões anatômicas, cateterismo de ratos masculinos não é possível13,17,18,19. Mais recentemente, tem sido descrita uma abordagem cirúrgica para instilação masculina, no qual o abdome é aberto, a bexiga é deslocada externamente aplicando uma pressão suave para a abertura no abdômen e bactérias são injetadas a bexiga20. Essa abordagem permite que a infecção masculina, ao custo de intervenção cirúrgica. Assim, uma ressalva importante desta abordagem inclui a influência da inflamação, sobre o resultado da infecção, como o potencial para induzir uma resposta anti-inflamatórios-cicatrização da incisão21. Como nossos interesses incluem compreender o viés sexual em resposta à doença, desenvolvemos um método de instilação de intravesical bacteriana em ratos masculinos que mais se aproxima da abordagem de transuretral não-cirúrgico bem estabelecida usada em roedores femininos22 .
Nosso modelo baseia-se uma metodologia estabelecida e fornece a capacidade de comparar diretamente a resposta imune do hospedeiro à ITU em animais do sexo femininos e masculinos. Este método irá permitir a dissecação das diferenças baseadas no sexo, na infecção e potencialmente oferecer pistas moleculares e celulares para as pronuncia-se diferenças na susceptibilidade e resposta à infecção entre os sexos. Além disso, este modelo tem valor para além de estudos UTI, permitindo a criação de modelos para investigar outras doenças associadas a bexiga, como o câncer de bexiga, próstata, sob ou sobre active síndrome da bexiga e cistite intersticial.

<table><tbody><tr><td>BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters 24 G, 0,7 mm de diâmetro externo, 14 mM de comprimento</td><td>BD Medical</td><td>381811 ou 381411*</td><td>* número de catálogo depende do país</td></tr><tr><td>Alça de inoculação</td><td>Greiner Bio-One</td><td>731171</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller caldo</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>LB Miller ágar</td><td>Difco</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>223-9955</td><td></td></tr><tr><td>seringas</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de polegar (Adson)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 5 ml, polipropileno</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Ruptor sondas descartáveis</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de tampa flip de 15 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>deve ser alíquota e armazenada a -20 &graus; C para evitar congelamento e descongelamento repetidos</td></tr><tr><td>100 &micro; Filtros M MACS SmartStrainers&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-463</td><td>compatível com tubos de 15 ml, preferido</td></tr><tr><td>100 &micro; Filtros de células M&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td>compatível com tubos de 50 ml, se os filtros inteligentes MACS não estiverem disponíveis</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Fc bloco</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td>anti-CD16/CD32</td></tr><tr><td>anti-camundongo anticorpo CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>561487</td><td>muitas opções diferentes de conjugação fluorescente estão disponíveis</td></tr><tr><td>Tubos de 5 ml de poliestireno com tampa de filtro</td><td>Falcon</td><td></td><td>Seringa de</td></tr><tr><td>insulina</td><td>352235 Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>homogeneizador portátil</td><td>Qiagen</td><td>9001272</td><td>TissueCitômetro</td></tr><tr><td>de fluxo</td> BD <td>Biosciences</td><td>N/A</td><td>Fortessa SORP&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de citometria de fluxo</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Diva</td></tr></tbody></table>

infecção do trato urinário em um modelo animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice

Infecções do trato urinário (ITU) são extremamente comuns em todo o mundo, incorrer em despesas associadas a cuidados de saúde e Morbidade significativa. Modelos animais pequenos, que refletem com precisão a progressão e o estabelecimento da doença, permitam a dissecação das interações patógeno-hospedeiro e geração de imunidade à infecção. Em ratos, instilação intravesical de uropathogenic e. coli, o agente causador em mais de 85% da Comunidade adquiriu UTI, recapitula a muitos dos estágios de infecção observada em humanos. Até recentemente, no entanto, UTI pode somente ser modelado em fêmeas. Essa limitação tem dificultado o estudo das diferenças relacionadas ao sexo na UTI, bem como outras patologias de bexiga, como o câncer. Aqui, descrevemos um método para incutir ratos masculinos que permite a comparação direta entre animais masculinos e femininos e fornecer um protocolo detalhado para avaliar o tecido da bexiga por citometria de fluxo como meio para compreender melhor as respostas do hospedeiro à infecção. Juntas, estas abordagens ajudarão na identificação de fatores do hospedeiro que contribuem para sexo enviesamentos observados em UTI e outras doenças associadas a bexiga.

No desenvolvimento do presente protocolo, coortes de camundongos C57Bl/6 de feminino e masculinos com idade entre 6 a 8 semanas eram encargos inculcado e bacterianos avaliados em bexigas em pontos de tempo variando de 1 hora a 30 dias. Os resultados destes estudos são detalhados em outro lugar (Zychlinsky Scharff et al., pendente). Aqui, apresentamos dados representativos de infecções 24 hr. Notavelmente, a carga bacteriana foi equivalente entre ratos masculinos e femininos em 24...

O modelo estabelecido de transuretral cateterismo de ratos permite o estudo das patologias de bexiga, incluindo a infecção do trato urinário, mas só pode ser realizado nas fêmeas. Um novo modelo de instilação transuretral masculino, apresentado aqui, permitirá a pesquisa em uma área marcada por fortes diferenças clínicas e epidemiológicas entre os sexos.

Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

Urinary tract infections (UTI) are extremely common worldwide, incurring significant morbidity and healthcare-associated expenses. Small animal models, ...

O objetivo geral desta abordagem experimental é investigar a resposta imune à infecção do trato urinário e evitar a comparação direta entre animais machos e fêmeas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave da imunologia da mucosa relacionadas a como homens e mulheres respondem à infecção do trato urinário. A principal vantagem é que a infecção é estabelecida através da raiz natural.Tivemos a ideia desse método pela primeira vez depois de observar com que frequência é afirmado que a instalação da bexiga dos camundongos machos é impossível. Embora esse método forneça informações sobre a infecção do trato urinário, ele também pode ser aplicado a outros estudos de doenças, como câncer de bexiga. Para começar, prepare uma cânula de acesso intravenoso pediátrico para cada grupo de camundongos a ser infectado.Usando o mecanismo de mola embutido, retire cada cânula de sua agulha conforme as instruções do fabricante. Descarte as agulhas, preservando apenas a cânula intravenosa de plástico. Esterilize os cateteres em uma capela de fluxo laminar por um ciclo UV de aproximadamente 25 a 30 minutos.Depois de passar em cultura noturna de e coli uropatogênica, ou UPEC, de acordo com o protocolo de texto, gire a suspensão bacteriana em uma microcentrífuga de mesa a 17.000 vezes g por um minuto e ressuspenda o pellet bacteriano resultante duas vezes 10 elevado à oitava UFC por mililitro em PBS. Diluir em série uma alíquota de suspensão e aplicar em ágar LB com antibióticos, se apropriado, para determinar o inóculo exato para cada infecção. Puxe o inóculo bacteriano para uma seringa de um mililitro e conecte o cateter à extremidade da seringa.Bata na seringa para remover qualquer ar e pressione o êmbolo para preencher o espaço de ar morto no cateter antes de iniciar a instilação. Depois de anestesiar um camundongo fêmea de acordo com um protocolo aprovado, coloque o animal em decúbito dorsal e aplique pressão média na parte inferior do abdômen para esvaziar a bexiga de urina. Bexigas cheias parecem uma ervilha sob a pele, entre as cristas ilíacas.Quando a bexiga estiver vazia, usando a mão não dominante, coloque o polegar na cauda e um dedo da mesma mão no abdômen do camundongo e aplique uma leve pressão em direções opostas para segurar o mouse firmemente no lugar. Em seguida, coloque a ponta do cateter perpendicular ao camundongo no orifício uretral e, em seguida, com uma leve pressão, deslize o cateter na uretra até que o cubo encontre o orifício uretral, enquanto abaixa simultaneamente a seringa para que fique paralela à superfície de trabalho. Assim que o cateter estiver no lugar, use um dedo da mão não dominante que está apoiada no abdômen do camundongo para puxar suavemente a pele abdominal em direção à cabeça do camundongo.Observe que o orifício uretral não se moverá. No entanto, se os cateteres estiverem na vagina, o tecido se moverá para cima e para longe do cateter. Com o hub do cateter contra o orifício uretral, dispense lentamente 15 microlitros do inóculo bacteriano.Uma taxa de instalação lenta minimiza o refluxo vesicoureteral para o rim. Remova lentamente o cateter para evitar vazamentos. Em seguida, coloque o animal em sua gaiola em decúbito dorsal.Para inocular camundongos machos, coloque duas pinças de polegar cranialmente e caudalmente à genitália externa do camundongo. Retraia o prepúcio para expor totalmente o pênis da glândula. Então, uma vez que o pênis esteja posicionado externamente, solte a pinça do polegar.Reposicione a pinça para estabilizar o pênis saliente perpendicular ao animal, segurando o órgão suavemente, mas esticado. Em seguida, através da pequena abertura na ponta do meato uretral, introduza cuidadosamente o cateter e guie-o suavemente para dentro do pênis usando uma pinça para manter suavemente a tensão. Assim que o hub dos cateteres encontrar a ponta do pênis, dispense muito lentamente 50 microlitros do inóculo, mantendo a posição do pênis.Observe a qualidade da instilação de acordo com um índice de qualidade de instilação predeterminado, como o mostrado aqui. Retraia o cateter lentamente ao longo de cinco segundos para evitar vazamento do inóculo. Coloque o mouse em sua gaiola em decúbito dorsal.O animal deve começar a se recuperar 30 a 45 minutos após a administração do anestésico. Depois de sacrificar os ratos de acordo com um protocolo aprovado, use 70% Epinal para umedecer completamente o abdômen para minimizar a contaminação pelo pelo. Usando uma tesoura, faça uma incisão de dois centímetros no terço inferior do abdômen do camundongo e remova assepticamente a bexiga e quaisquer outros órgãos desejados.Transfira os órgãos para tubos de polipropileno de cinco mililitros, contendo um mililitro de PBS estéril e mantenha todas as amostras no gelo. Com um homogeneizador portátil, homogeneizar os órgãos até que quase não reste tecido sólido. Descarte qualquer tecido adiposo bege-branco brilhante que não homogeneize bem.Em seguida, use Epinal, seguido de PBS para lavar o homogeneizador entre cada grupo experimental ou de órgãos. Depois de preparar diluições seriadas de suspensão de órgãos homogeneizados, diluições em placas de ágar LB, com antibióticos quando apropriado, e incubar a 37 graus Celsius durante a noite. Para realizar a citometria de fluxo no tecido da bexiga, depois de isolar a bexiga, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo, use uma tesoura para picar bem o tecido.Adicione uma bexiga picada por tubo contendo tampão de digestão. Em seguida, agite o tubo para lavar o tecido picado no tampão de digestão e mantenha-o no gelo até que todas as bexigas sejam dissecadas e picadas. Incube as bexigas picadas a 37 graus Celsius, por 60 a 75 minutos com agitação vigorosa com as mãos por cinco segundos, a cada 15 minutos.Quando o tecido tem uma aparência transparente vítrea semelhante a papel de seda úmido, a digestão é completa. Inative as enzimas de digestão adicionando dois a três mililitros de tampão de citometria de fluxo gelado e misture suavemente. Em seguida, coloque os tubos no gelo.Para garantir uma suspensão unicelular e remover qualquer tecido conjuntivo, passe o conteúdo do tubo através de um filtro de 100 micrômetros colocado em um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, com a ponta de um êmbolo de seringa, pressione suavemente qualquer tecido restante através do filtro. Lave o filtro com mais dois mililitros de tampão de citometria de fluxo e mantenha as amostras no gelo.Lave as amostras por centrifugação a 200 vezes g e quatro graus Celsius, por sete minutos. Ressuspenda os pellets em 100 microlitros de tampão de citometria de fluxo contendo bloco Fc, diluído a cinco microgramas por mililitro, e transfira para uma placa de fundo redondo de 96 poços. Após 10 a 15 minutos, adicione 100 microlitros do coquetel de anticorpos desejado a cada amostra.Em seguida, incube as amostras em gelo protegido da luz por 30 a 45 minutos. Lavar as amostras por centrifugação a 200 vezes g e quatro graus Celsius durante sete minutos. Finalmente, ressuspenda os grânulos de células em 200 microlitros de tampão de citometria de fluxo e passe as amostras por um filtro de células de 40 micrômetros em um tubo de poliestireno de cinco mililitros, pouco antes da aquisição em um citômetro de fluxo.Esta figura mostra dados representativos de camundongos infectados por 24 horas. A carga bacteriana foi equivalente entre camundongos machos e fêmeas 24 horas após a infecção. Para determinar se a perda de inóculo no momento da infecção afetou o estabelecimento da infecção, cada instilação foi pontuada em uma escala de um a cinco, sendo uma a mais ideal.A colonização bacteriana foi determinada 24 horas após a infecção. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as UFC obtidas de animais com diferentes escores de instilação, avaliados por um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, comparando a classificação média de cada coluna com a classificação média de todas as outras colunas e corrigindo para comparações múltiplas usando um teste de Dunn. Pode-se concluir que instilações abaixo do ideal, resultando em vazamento substancial de inóculo bacteriano durante a infecção, não afetam significativamente a colonização bacteriana em 24 horas.É importante ressaltar que a frequência da instilação abaixo do ideal diminuirá com a prática. Finalmente, embora o número de células imunes CD45 positivas, presentes em animais virgens, não tenha sido diferente entre camundongos fêmeas e machos, houve um aumento estatisticamente significativo na infiltração nas bexigas de camundongos fêmeas infectados. Ao tentar o cateterismo, é importante usar movimentos lentos e suaves.Com seu desenvolvimento, essa técnica nos ajudou a explorar as diferenças de imunidade baseadas no sexo na bexiga de animais machos e fêmeas.

urinary-tract-infection-small-animal-model-transurethral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo vai demonstrar os métodos para induzir transurethrally infecções do trato urinário do mouse e quantificar a extensão das infecções resultantes.

Indução transuretral de rato infecção urinária

Fonte: Luyts, N., et al. Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra a indução e o rastreamento da infecção do trato urinário em um modelo camundongo usando E. coli bioluminescente injetada na bexiga, onde ocorrem adesão, invasão bacteriana e replicação intracelular. A luz emitida pelo operon bioluminescente serve como marcador em tempo real da carga bacteriana durante a...

Visualização da Infecção do Trato Urinário em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Fonte: Conover, M. S., et al., J. Estabelecimento e Caracterização de ITU e CAUTI em um modelo de camundongo. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra o procedimento para montar e implantar um cateter transuretral em uma camundonga, seguido pela inoculação bacteriana para estabelecer infecção urinária associada ao cateter e investigar interações hospedeiro-patógeno mediadas por biofilme.

Infecção do Trato Urinário Associada a Cateter em um Modelo de Camundongo

Neste vídeo, descrevemos a técnica de administração intravesical de bactérias uropatogênicas para gerar um modelo de infecção do trato urinário em camundongos. Este modelo pode ser usado para entender a disseminação da infecção bacteriana uropatogênica no sistema urinário e os mecanismos que determinam a suscetibilidade à ITU.

Modelo de Geração de Infecção do Trato Urinário: Uma Técnica para Administrar Bactérias Uropatogênicas em Camundongos para Desenvolver Modelo de Infecção do Trato Urinário

Este vídeo demonstra o estabelecimento da infecção uropatogênica por Escherichia coli em uma bexiga de camundongo fêmea por meio de instilação de cateter transuretral. As bactérias injetadas estabelecem com sucesso uma infecção do trato urinário dentro da bexiga, fornecendo uma plataforma valiosa para estudar doenças associadas à saúde relacionadas ao trato urinário.

Cateterismo transuretral e inoculação bacteriana para gerar um modelo de infecção do trato urinário em camundongos machos

Estabelecimento de um Modelo de Infecção do Trato Urinário em Camundongos Fêmeas

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a atividade antitumoral da proteína ativadora de neutrófilos Helicobacter pylori, ou HP-NAP, em um modelo de câncer de bexiga de camundongo. O HP-NAP interage com neutrófilos de células tumorais para produzir citocinas pró-inflamatórias, induzindo a diferenciação de células T virgens em fenótipos de células T auxiliares tipo 1 (Th1) e citotóxicas tipo 1 (Tc1). As células Th1 e Tc1 secretam interferon-gama, inibindo a angiogênese tumoral e promovendo...

Avaliação da eficácia antitumoral de uma proteína imunomoduladora bacteriana em um modelo murino

A capacidade de modelar infecções do trato urinário (ITU) é crucial para poder entender a patogênese bacteriana e gerar o desenvolvimento de novas terapêuticas. O objetivo deste trabalho é demonstrar modelos de camundongos de ITU experimental e ITU associada a cateter que recapitulam e predizem achados observados em humanos.

Criação e Caracterização da UTI e CAUTI em um modelo de rato

Instilação transuretral é um procedimento desafiador e não tem sido bem descrita na literatura. O objetivo deste manuscrito é descrever uma técnica transuretral inserção de um cateter para entrega intravesical de líquidos com substâncias activas para a bexiga urinária e/ou próstata em ratos machos adultos.

Procedimento de instilação transuretral no rato adulto masculino

Um modelo de camundongos de uropatogenic E. coli (UPEC) inoculação transuretral para estabelecer reservatórios de bexiga intracelular latente e subsequente exposição à bexiga a G. vaginalis para induzir a UTI UPEC recorrente é demonstrado. Também são demonstradas a enumeração de bactérias, citologia urinária, e fixação e processamento in situ bexiga para a varredura de microscopia eletrônica.

Infecção recorrente do trato urinário de Escherichia coli desencadeada por gardnerella vaginalis exposição bexiga em camundongos

Este manuscrito descreve a administração intravesical de bactérias uropatômicas com um operon lux para induzir uma infecção do trato urinário em camundongos e posterior análise longitudinal in vivo da carga bacteriana usando imagens de bioluminescência.

Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando bioluminescência imagem

Aprenda cateterismo transuretral em ratos machos e fêmeas para estudar infecções urinárias e respostas imunes diferenciadas entre sexos. Este método permite investigar patologias da bexiga em ambos os sexos.

Infecção do trato urinário em um modelo Animal de pequeno porte: transuretral cateterismo de ratos machos e fêmeas

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