Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

O objetivo geral desta técnica é capturar efetivamente células tumorais circulantes viáveis ou CTCs do sangue total. Essas CTCs podem ser colocadas em cultura ou usadas para análises a jusante que requerem amostras não fixas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da metástase.

Também pode ser usado para acompanhar a progressão da doença, a resposta à terapia e avaliar o risco de recorrência. A vantagem dessa técnica é a capacidade de realizar a captura sem marcação de CTCs viáveis de qualquer tumor sólido, mantendo-se independente da expressão do biomarcador. Primeiro tivemos a ideia de liberar CTCs do filtro porque queríamos fazer análise de RNA a jusante e cultura de CTCs, em vez de cultivá-las in-situ no filtro.

Para iniciar o experimento, pesar PIPAAm suficiente para preparar uma solução de 10% de peso por volume em um tubo de 15 mililitros, contendo butanol. Vortex o tubo até que a solução esteja límpida. Em seguida, corte as lâminas plásticas do microscópio em quadrados de aproximadamente 12 milímetros por 12 milímetros com uma tesoura.

Em seguida, usando uma tesoura afiada de borda reta, corte um wafer de microfiltro de poro de fenda em quadrados de oito milímetros por oito milímetros e coloque essas peças diretamente nos quadrados de plástico. Usando uma fita de filme de poliimida, prenda os filtros cortados nos quadrados de plástico, apenas na borda e no canto do filtro, de modo que pelo menos sete milímetros por sete milímetros de área do filtro não seja coberta pela fita. Coloque o microfiltro que está preso no quadrado de plástico no mandril de vácuo do revestidor giratório.

Programe o revestidor giratório para a seguinte receita. Em seguida, com uma pipeta de transferência de plástico padrão, dispense solução PIPAAm suficiente de 10% de peso por volume para cobrir completamente a superfície do microfiltro e iniciar o revestidor giratório. Após a conclusão do revestimento, remova o microfiltro revestido com PIPAAm do revestidor giratório e deixe o filtro preso ao quadrado de plástico durante o armazenamento.

Passe para a montagem do de filtração e reidrate o microfiltro revestido com PIPAAm à temperatura ambiente, colocando o microfiltro em uma placa de Petri. Adicione 1X PBS até que o microfiltro esteja totalmente submerso. Após a etapa de hidratação, solte o filtro do quadrado de plástico descascando ou cortando a fita de filme de poliimida do filtro.

Em seguida, monte o microfiltro no de filtração colocando o microfiltro entre a peça de acrílico superior e inferior ao longo das peças PDMS que atuam como uma junta. Em seguida, prenda o de acrílico com clipes para prender o filtro, para fornecer uma vedação firme. Aqueça três mililitros do meio de cultura de células de McCoy a 37 graus Celsius.

Adicione 7,5 mililitros de solução salina balanceada de Hank ou HBSS aos 7,5 mililitros de amostra de sangue e aspire esse sangue diluído em uma seringa de 25 mililitros. Depois de identificar a parte superior do, encaixe o de filtração com a seringa e coloque-o na bomba da seringa. Defina a bomba de seringa para uma taxa de fluxo de 75 mililitros por hora.

Coloque um tubo de 50 mililitros na parte inferior para coletar o fluxo e iniciar a bomba. Após a conclusão da filtração, desengate o de filtração, observando qual lado é o topo que tem as células presas na superfície revestida com PIPAAm. Aspirar um mililitro do meio de cultura quente para uma seringa nova.

Novamente, determine a parte superior do e, em seguida, reencaixe o de filtração com a seringa que contém o meio e encaixe a extremidade inferior do de modo que a superfície revestida com PIPAAm do filtro fique voltada para longe da seringa. Em seguida, coloque a seringa de volta na bomba da seringa e segure a placa de seis poços logo abaixo do de filtração. Defina a vazão e ligue a bomba.

Passe todo o meio pelo filtro e recolha o fluxo na placa de Petri. Aguarde a passagem de todo o meio, pare a bomba e remova a seringa e o de filtragem da bomba. Em seguida, desengate o de filtração da seringa e abra-o para recuperar o filtro do.

Coloque o filtro com a superfície PIPAAm voltada para baixo na mesma placa de Petri usada para coletar o fluxo reverso ao liberar as células dos poros. Adicione o resto do meio quente e coloque a placa de Petri em uma incubadora de cultura, ajustada a 37 graus Celsius. Uma vez que o filtro tenha sido recuperado do, é fundamental colocá-lo na placa com as células voltadas para baixo e, se necessário, agitá-lo suavemente no meio para garantir que as células sejam separadas do filtro.

Após 24 horas em cultura, remova cuidadosamente o microfiltro usando uma pinça e descarte o filtro. Ressuspenda suavemente os eritrócitos e as células mononucleares do sangue periférico ou PBMCs com uma pipeta de 1000 microlitros. É fundamental ser extremamente cuidadoso ao ressuspender os eritrócitos e PBMCs para evitar a pipetagem das CTCs.

Remova cuidadosamente todo o meio contendo os eritrócitos ressuspensos e PBMCs, deixando para trás as células cancerígenas anexadas e substitua as células por meio fresco, pré-aquecido a 37 graus Celsius. Prossiga com a avaliação de viabilidade do CTC. Usando sangue de doadores saudáveis enriquecidos com células cancerígenas cultivadas, a técnica responsiva térmica para liberação de células tumorais circulantes viáveis ou CTCs, alcançou eficiência de captura, liberação e recuperação de 94% 82% e 77%, respectivamente.

A eficiência de liberação e recuperação de filtros não revestidos foi significativamente menor. Um ensaio de mortos-vivos foi realizado para avaliar a viabilidade celular antes do pico no sangue e após a liberação. As células permaneceram viáveis após a liberação e se expandiram rapidamente em cultura.

As células SKBr-3 foram recuperadas do sangue pelo filtro de fenda revestido com PIPAAm e plaqueadas em uma placa de 48 poços. Às 16 horas em uma cultura, as células tumorais aderem à placa de cultura junto com eritrócitos e leucócitos hipotônicos que se depositam na parte inferior da placa. As células não aderentes pós-lavagem foram removidas apenas deixando as células tumorais aderentes na placa.

Os mesmos filtros podem ser usados para captura de células fixas, tanto para enumeração quanto para caracterizações moleculares de CTCs para rastrear a progressão do câncer e melhor gerenciamento do câncer. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo das CTCs, permitindo a caracterização funcional dessas células, para explorar futuros alvos de drogas enquanto davam um passo em direção à medicina personalizada.