Crescimento diferido Ensaio de Inibição para quantificar o efeito de antimicrobianos bactérias derivadas de concorrência

O objetivo geral deste protocolo é examinar a competição de um isolado bacteriano sobre outro de maneira quantitativa e qualitativa. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre investigações de exclusão competitiva dentro de comunidades bacterianas. A principal vantagem desta técnica é que ela reflete o que ocorre em uma comunidade bacteriana.

Os isolados invasores devem ser capazes de sobreviver aos efeitos inibitórios dos isolados estabelecidos para que a invasão seja bem-sucedida. O procedimento será demonstrado por Emma Crank, uma estudante de pós-graduação da biologia hospitalar. Para começar, prepare o ágar infusão cerebral-cárdica ou BHI de acordo com as instruções do fabricante.

Esterilize o ágar em autoclave a 121 graus Celsius e 15 psi por 20 minutos. Despeje alíquotas de 15 mililitros de ágar BHI esterilizado em placas de Petri estéreis e deixe o ágar solidificar. Prepare o caldo BHI de acordo com as instruções do fabricante e transfira alíquotas de 10 mililitros para frascos universais de vidro de 28 mililitros.

Em seguida, autoclave o caldo BHI por 20 minutos. Para preparar as garrafas do vaporizador, comece desmontando-as. Pulverize um agente de limpeza com ação superficial a 5% através do vaporizador para eliminar contaminantes internos.

Em seguida, deixe o frasco do vaporizador, a tampa e o vaporizador de molho no agente de limpeza durante a noite. No dia seguinte, seque o vaporizador, a tampa e os frascos sob capela de fluxo laminar. Em seguida, use etanol 70% para preencher os frascos.

Posteriormente, recoloque o vaporizador e pulverize um pouco do etanol através dele. Coloque a tampa sobre o vaporizador e guarde-o com etanol em seu interior até o uso. Antes do uso, utilize caldo BHI estéril para enxaguar assépticamente o frasco e pulverize o caldo através do vaporizador.

Para preparar culturas bacterianas de crescimento noturno, faça o esgotamento das cepas competidora e inibidora em uma placa de ágar BHI estéril e incube a 37 graus Celsius, de forma aeróbica, por aproximadamente 18 horas. Em um frasco universal de 28 mililitros, inocular 10 mililitros de caldo BHI estéril com uma única colônia da cepa bacteriana competidora desejada. Incube a cultura em um agitador orbital universal a 37 graus Celsius e 250 RPM durante a noite.

No dia seguinte, certifique-se de que as placas de ágar estejam completamente secas e sem condensação na tampa, para evitar que a inóculação se espalhe pela placa. Pipete 25 microlitros da cultura de crescimento noturno no centro das placas de ágar, evitando pressionar completamente o êmbolo da pipeta para prevenir bolhas de ar que possam espalhar a cultura sobre o ágar. Deixe a cultura secar à temperatura ambiente para limitar sua disseminação.

Em seguida, incubar as placas de ágar a 37 graus Celsius, em atmosfera aeróbica, durante a noite. Após o crescimento de uma cultura de incubação noturna, e trabalhando sob uma cabine de segurança nível dois forrada com papel absorvente, usar caldo BHI para diluir a cultura dez vezes, obtendo aproximadamente quatro vezes dez à sexta UFC por mililitro. Em seguida, transferir a cultura diluída para um frasco estéril de vaporizador plástico para perfume.

Para realizar um ensaio de inibição do crescimento diferido, pulverize a cultura através de cada um dos frascos do vaporizador para garantir que a cultura esteja carregada no mecanismo de pulverização antes de borrifá-la sobre o ágar. A uma distância de aproximadamente 15 centímetros acima do ágar, pulverize cerca de 250 microlitros de cultura diluída sobre toda a superfície do ágar. Incube as placas a 37 graus Celsius, em aerobiose, durante a noite.

Para interpretar a inibição do crescimento diferida, meça a zona de inibição do crescimento da linhagem competidora pulverizada em milímetros, subtraindo o diâmetro da mancha central da cepa produtora do inibidor. Por fim, registre o escore de clareza para as zonas de inibição de acordo com o protocolo descrito no texto. Conforme mostrado nesta figura, os resultados do ensaio devem ser observáveis como uma diferença na camada da linhagem competidora sobreposta próxima à cepa produtora do inibidor, posicionada centralmente.

As diferenças podem ser inibição completa, inibição parcial, ausência de inibição ou associação positiva. Este gráfico compara as zonas de inibição entre isolados produtores de inibidores, o que pode ser resultado da quantidade de antimicrobiano produzido, da capacidade do inibidor de difundir-se através do meio, do tipo de inibidor produzido ou do nível de resistência da linhagem competidora aos inibidores. Este exemplo mostra que, se a cultura-teste do competidor estiver muito diluída, a zona de inibição parecerá maior e com uma borda menos definida do que o normalmente observado.

Se a estirpe produtora de inibidor não estiver completamente seca antes da incubação durante a noite, a estirpe inibidora se espalhará e não formará um ponto totalmente definido. Alternativamente, se a estirpe competidora não for pulverizada de maneira uniforme, isso pode levar a uma disseminação desigual das bactérias. Por fim, se a estirpe competidora estiver muito concentrada, ela poderá crescer por cima da estirpe inibidora e, em casos extremos, pode levar à inversão dos papéis entre as estirpes competidora e inibidora.

Uma vez dominada, esta técnica levará uma hora distribuída em quatro dias por par de isolados testado. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de pulverizar uniformemente com boa replicação entre os ensaios. Após este procedimento, os dados de inibição podem ser sobrepostos aos dados taxonômicos sobre a presença ou ausência de uma espécie bacteriana em uma comunidade.

Então é possível determinar se efeitos inibitórios influenciam a capacidade de uma espécie colonizar um ambiente. Após seu desenvolvimento, esta técnica permite que pesquisadores na área de microbiomas comunitários explorem os efeitos da variância de características, como a predição de peptídeos antimicrobianos, na estrutura comunitária em relação à exclusão competitiva. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como comparar a capacidade de um isolado bacteriano de inibir competitivamente o crescimento de outro, tanto de maneira qualitativa quanto quantitativa.

Não se esqueça de que trabalhar com bactérias em aerossol pode ser extremamente perigoso, e precauções como atuar dentro de uma cabine de segurança de nível dois e usar EPI apropriado devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.