Name: A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda a comparar a eficácia protetora da vacinação BCG intranasal versus subcutânea em camundongos. Este método avalia respostas imunes pulmonares e o papel da IL17 na proteção contra tuberculose.

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Este trabalho foi apoiado pelo "Ministério da Economia e Competitividade da Espanha" [número de concessão BIO2014-5258P], "Comissão Europeia" pelos programas H2020 [números de concessão TBVAC2020 643381].

Todos os ratinhos foram mantidos sob condições controladas e observados quanto a quaisquer sinais de doença. O trabalho experimental foi realizado de acordo com as directivas europeias e nacionais para a protecção dos animais experimentais e com a aprovação dos comités de ética locais competentes. 1. Preparação de Stocks quantificada glicerol de BCG dinamarquesa e H37Rv Mycobacterium tuberculosis Nota: Todos os protocolos descritos foram realizadas em condições BSL3. <ol><li> Estoques de glicerol congelado descongelar BCG Danish ou estirpes H37Rv e inocular 100 ul em 10 ml de meio 7H9 10 suplementado com Tween-80 0,05% (v / v) e ADC (albumina, dextrose, catalase) 10% (v / v). </li><li> Incubar sob condições estáticas durante uma semana a 37 ° C até a cultura está em crescimento de fase log. </li><li> Dimensionar-se a cultura bacteriana por transferência da cultura de 10 ml a 200 ml de meio fresco. Incubar por 20 adicionaldias, em condições estáticas. </li><li> Transferir para tubos de centrífuga de 50 ml e centrifugar durante 15 min a 2500 x g. </li><li> Rejeitar sobrenadante e ressuspender sedimento bacteriano no volume residual. Adicionar a cada tubo de esferas de vidro de 3 mm de diâmetro estéreis (10 - 15) por tubo. </li><li> Vortex vigorosamente durante 1 min, a fim de dissociar aglomerados de bactérias. Ressuspender cada pellet em 10 ml de PBS com Tween-80 a 0,05% (v / v). </li><li> Deixar os tubos durante 10 minutos permitindo que os maiores agregados bacterianos e contas de vidro para se estabelecer. </li><li> Recuperar 9,5 ml de sobrenadante a partir de cada um dos 4 tubos contendo pequenos aglomerados e bactérias individuais e volumes de transferência para um único tubo de centrífuga de 50 ml fresco (volume recuperado final de 38 ml). Centrifugar durante 10 minutos a 400 x g. </li><li> Recuperar 35 ml de sobrenadante (contendo as bactérias, principalmente simples) num tubo de centrífuga de 50 mL fresco e adicionar 15 ml de PBS com glicerol a 50% (v / v), obtendo-se uma concentração de glicerol final de 15% (v / v). </li><li> misture delicadamentee distribuir-se em alíquotas de 1 ml em tubos apropriados para congelação. Armazenar a -80 ° C (um lote fornece cerca de 50 alíquotas de stock de glicerol). </li><li> Para quantificar os estoques de glicerol, glicerol a descongelar um dia após a congelação e executar sete diluições em série de dez vezes em tubos de 1,5 ml contendo 900 ul separadas de PBS. </li><li> Placa de 100 ul de cada diluição em meio sólido 7H10 agar-10 suplementado com ADC a 10% (v / v) preparados em placas de Petri de diâmetro de 55 mm. </li><li> Adicionar cuidadosamente 3 mm de diâmetro contas de vidro (aprox. 10 por placa) e agitar suavemente placa para distribuir igualmente o volume sobre a placa de ágar. Descarte pérolas e selar placa de ágar com parafilme. </li><li> Incubar durante 21 dias a 37 ° C e determinar a concentração bacteriana por contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) nas diluições onde as colónias individuais podem ser distinguidos com precisão. </li></ol> 2. Rato Vacinação <ol><li> Descongelar um glicerol pré-quantificadas BCG e diluir em PBS para prepsão duas suspensões. Calcular o volume final, considerando a dose por animal é de 100 ul para a administração subcutânea (10 7 CFU por ml para vacinação por via subcutânea) e de 40 ul para a administração intranasal (2,5 x 10 7 UFC de vacinação intranasal). </li><li> Use uma estação de trabalho de anestesia especializada para roedores para anestesiar os ratos com uma mistura de isoflurano e oxigênio. Use isoflurano a 5% para induzir a anestesia e 2% para manter os ratos na câmara de anestesia. (Outro método de anestesia aceite pode ser usado). </li><li> Para a administração subcutânea de vacina encher uma seringa de 1 ml com uma agulha de 26 G com 1 ml de suspensão bacteriana (10 7 CFU / ml). Remover bolhas de ar. </li><li> Coloque um rato anestesiado numa superfície plana na posição de bruços no interior de uma câmara de fluxo laminar e inocular subcutaneamente 100 ul (10 6 CFU / dose) de vacina num flanco do rato para trás. Devolver o mouse para a gaiola e monitorá-lo para garantir que ele PROPErly recupera da anestesia. </li><li> Mudar a agulha da seringa entre cada administração mouse. Removido bolhas de ar, como descrito acima. </li><li> Para administração intranasal, coloque um rato anestesiado em decúbito dorsal no interior do exaustor. </li><li> Com uma micropipeta ter 20 ul da suspensão com 2,5 x 10 7 CFU / mL. Coloque a gota-a-gota de inóculo entre as duas narinas até que todo o volume foi depositado, deixando tempo entre gotas para permitir que o mouse respirar o volume. Nota: os ratos podem sofrer de desconforto respiratório durante este procedimento para que eles devem ser deixadas para assimilar cada gota antes de administrar a próxima para evitar tanto quanto possível. </li><li> Voltar a encher a micropipeta com uma outra 20 ul e repetir a operação. Se o rato começa a acordar da anestesia após a primeira inoculação, colocá-lo na câmara de anestesia antes da segunda. Devolver o mouse para a gaiola e garantir que ele corretamente recuperada anestesia. </li></ol> 3. Rato intranasal Desafio com H37Rv Strain <ol><li> Descongelar uma pré-glicerol quantificada H37Rv e dilua em PBS para preparar uma suspensão de bactérias de 2500 CFU por ml. Calcule volume final considerando a dose por animal é de 40 mL. </li><li> H37Rv é inoculado por via intranasal, tal como descrito em 2,5-2,7. Dose de desafio final por ratinho é de 10 2 UFC / 40 mL. </li></ol> 4. Análise do induzida resposta imune nos pulmões <ol><li> Lung suspensão celular NOTA: Avaliação da resposta imune adaptativa induzida pela vacina em pulmões requer a geração de suspensão de células individuais. Para este fim, usamos um Dissociator tecido tais como gentleMACS. <ol><li> Sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar. </li><li> Dentro de uma capela de fluxo laminar, extrair o lUNGS usando tesouras e pinças esterilizadas e coloque-os em uma superfície limpa. pulmões limpas retirando da traqueia e do tecido conjuntivo, e transferir os pulmões para um tubo de 1,5 ml com PBS (manter em gelo até que o processamento). </li><li> Para gerar uma suspensão celular, colocar os pulmões em um tubo adequado para a dissociação do órgão (tubo de C-Dissociator) contendo 5 ml de HEPES-NaOH 10 mM pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2 e 1,8 mM de CaCl2 amortecedor. </li><li> Adicionar 100 ul de colagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml de concentração final), e 40 ul de ADNase I 20000 IU / ml (160 UI / ml de concentração final. NOTA: As soluções-mãe de colagenase D ou ADNasel são preparados dissolvendo enzimas liofilizadas em PBS ou glicerol 50% (v / v), Tris-HCl 20 mM pH 7,5 y MgCl2 1 mM, respectivamente. </li><li> Colocar o tubo em a Dissociator tecido e usar o m_lung_01 programa predefinido para a fragmentação do pulmão. Incubar o tubo a 37 ° C num banho de água durante 30 min. </li><li> º lugare tubo no Dissociator e usar o m_lung_02 programa predefinido para homogeneização completa do pulmão em suspensão celular única. </li><li> Passar a suspensão celular através de um coador de células de nylon de 70 ^ M equipado com um tubo de centrífuga de 50 ml. Lavar o filtro com 10 ml de meio RPMI 1640. </li><li> centrifugar células durante 5 minutos a 400 xg e elimine o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão de lise de eritrócitos, misturar em vortex e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Adicionam-se 10 ml de meio RPMI 1640 células médias e centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. </li><li> Ressuspender as células em 0,5 ml de meio completo de RPMI 1640 suplementado com-inactivado pelo calor 10% de Soro Fetal Bovino (FCS), 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina, 100 IU / ml de penicilina e 50 ^ M de 2-mercaptoetanol. NOTA: FCS é inactivada por incubação a 56 ° C durante 30 minutos. </li><li> Contar as células e adicionar RPMI completo 1640 para alcançar a densidade celular final de 10 7 células / ml. NOTA: Para contagem de células, usamos o contador de células automatizado. </li><li> Distribuir 100 ul de suspensão celular em placas de 96 poços de fundo em U estéril (10 6 células / poço). </li><li> Adicionar 50 ul / poço de meio completo de RPMI 1640 com 15 ug / ml de H37Rv comercial derivado de proteína purificada (PPD) (5 ug / ml de concentração final). </li></ol></li><li> Recolha de sobrenadante para a determinação da citoquina por ELISA <ol><li> Incubar a placa a partir de 4.1.14 durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> placa Centrifugar durante 5 minutos a 400 xg e recuperar 100 ul de sobrenadante. </li><li> Armazenar a -80 ° C. </li><li> Dilui-se sobrenadantes de 1/10 e 1/2 no tampão de ensaio para determinação de IFN-y e IL17A, respectivamente. Determinar a concentração de citocinas com kits comerciais de ELISA, de acordo com as instruções do fabricante (kits de desenvolvimento de ELISA). </li></ol></li><li> Coloração intracelular para a determinação da citoquina-producing células CD4 + através de citometria de fluxo <ol><li> Incubar a placa a partir de 4.1.14, durante 18 h a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 1,5 uL de Brefeldina A 1 mg / ml (estoque dissolvido em DMSO) a cada (concentração final 10 ug / mL) bem e incubar durante seis horas adicionais. </li><li> Centrifugar a placa a partir de 4.3.2, durante 1 min a 3200 xg e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 50 ul de anti-rato CD4-FITC diluído em meio RPMI 1640 com FCS a 10% (1/500) e incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar a placa a partir de 4.3.4, durante 1 min a 3200 xg, descartar o sobrenadante e adicionar / poço de solução de fixação 100 ul. Incubar a 4 ° C durante 20 min. </li><li> Lave as células duas vezes com 150 mL / lavagem de solução de permeabilização. NOTA: 10x Estoque concentrado é diluído em água desionizada para preparar a solução de trabalho 1x. </li><li> Ressuspender as células em 50 ul de anti-ratinho de IFN-y-APC e anti-rato IL17A-APC.Cy7 diluído em permeabilsolução ização (1/250 ambos os anticorpos). </li><li> Incubar durante 1 h à TA. </li><li> Lave as células duas vezes com 150 mL / lavagem de solução de permeabilização. </li><li> Ressuspender as células em 200 ul de PBS para aquisição de citometria de fluxo. </li></ol></li></ol> 5. Análise das imunoglobulinas em Lavagem Broncoalveolar (BAL) <ol><li> Obtenção de amostras de LBA <ol><li> Sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar. </li><li> Expor a traquéia usando adequada precisão pinça e tesouras estéreis e realizar um pequeno corte na traqueia, certificando-se de não extirpar completamente. Tome cuidado para não causar sangramento que poderia contaminar amostras BAL. </li><li> Introduzir na traqueia uma cânula ligada a uma seringa esterilizada de 1 ml com 800 ul de PBS gelado. </li><li> Inocular lentamente o PBS nos pulmões e, em seguida, recover volume de BAL puxando para trás do êmbolo da seringa muito lentamente, a fim de evitar o colapso do pulmão. NOTA: Recuperação de 500 a 600 ul é satisfatória. </li><li> Transferir o volume BAL em um tubo de 1,5 ml e confirmar BAL permanece incolor, indicando que não está contaminada com sangue (manter em gelo até que o processamento). </li><li> Centrifugar as amostras BAL durante 5 minutos a 400 xg, e transferência de sobrenadante para um novo tubo. </li><li> sobrenadantes armazenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Determinação dos níveis de IgA em LBA sobrenadantes NOTA: Todos os reagentes utilizados são à temperatura ambiente. <ol><li> Revestimento de poliestireno de ligação elevada de proteínas de fundo plano de placas de 96 poços com 100 ul de PPD diluído em PBS (10 ug / ml) para M. tuberculose determinação IgA -específica, ou com 100 uL de sobrenadante BAL diluídas 10 vezes em PBS para determinação de IgA total. </li><li> Incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Elimine o sobrenadante e toque a placa em papel toalha para dry. Lava-se com 200 ul / poço de PBS. </li><li> Bloquear com 200 ul / poço de albumina de soro bovino (BSA) a 1% (w / v) em PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampão de bloqueio). </li><li> Incubar 1 hora à TA. </li><li> Lavar uma vez com 200 ul / poço de PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (tampão de lavagem). </li><li> Adiciona-se 100 ul de sobrenadante BAL não diluído nos poços de PPD-revestidos. Incubar duas horas à temperatura ambiente. NOTA: Se a determinação de IgA total é feita em paralelo com o PPD-específico IgA, IgA totais deixar poços com tampão de lavagem de 100 ul durante esta incubação. </li><li> Lavar três vezes com 200 ul / poço de lavagem buffer.0170004 </li><li> Adicionar 100 ul de peroxidase de rábano (HRP) -conjugated IgA anti-rato diluído em tampão (1 / 10.000) de bloqueio. </li><li> Incubar 1 hora temperatura ambiente. </li><li> Lavar cinco vezes com 200 ul / poço de tampão de lavagem. </li><li> Adicionam-se 100 ul / poço de 3,3 &#39;, 5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB). Incubar 20 minutos à temperatura ambiente em tele escuro. </li><li> Adicionam-se 100 ul / cavidade de H 2 SO 4 0,5 N. Ler a placa num espectrofotómetro a um comprimento de onda de 450 nm. </li></ol></li></ol> 6. determinação da carga bacteriana nos pulmões <ol><li> Lung homogeneização e chapeamento <ol><li> Quatro semanas após o desafio, sacrificar o mouse por deslocamento cervical (ou outra metodologia humana aceita) e garantir o rato está morto tocar o globo ocular para confirmar ausência de reflexo de piscar. </li><li> Colocar o rato na posição supina fixo sobre uma superfície plana e desinfectados, dentro de uma câmara de fluxo laminar. </li><li> Faça uma incisão e remover a pele da região torácica para deixar visível a área torácica. </li><li> Cortar as costelas e colher os pulmões eo coração, usando tesouras e pinças esterilizadas. Coloque órgãos sobre uma superfície limpa. </li><li> Limpar os pulmões através da remoção do coração, da traqueia e do tecido conjuntivo e transferir os pulmões para um tubo de 1,5 ml com 1 ml de água desionizada(Manter em gelo até o processamento). </li><li> Utilize uma pinça estéril para transferir os pulmões de cada rato para um tubo de órgão adequada para homogeneização (H - Dissociator tubo), contendo 1 ml de água desionizada. </li><li> Colocar o tubo em a Dissociator tecido e usar o RNA_1 programa pré-definido de forma a homogeneizar os pulmões. </li><li> Adicione cinco diluições em série de dez vezes em tubos de 1,5 ml, começando com 100 ul de homogenato de pulmão diluído em 900 ul. </li><li> diluições em placa conforme descrito no 1,11-1,14. </li></ol></li><li> A diferenciação entre BCG e H37Rv por PCR Nota: Nas placas de 6.1.6 correspondentes para o grupo vacinado com a vacina BCG por via intranasal, analisou-se um número representativo de colónias por um PCR discernir entre BCG e H37Rv para assegurar que o CFU considerado para avaliar a eficácia de protecção conferido pela vacina correspondeu exclusivamente para H37Rv. Esta amplificação por PCR de alvos RD9, uma região genómica diferente em BCG e M. TUberculosis, dando um fragmento de 2618 pb para H37Rv e 465 pb para BCG 11. <ol><li> Prepare um estoque mestre mix para todas as amostras com volumes por amostra como indicado, e depois distribuir em tubos de PCR (9 l / amostra). NOTA: Tampão de 5x: 2 ul. Iniciador directo 25 mM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 mL, o iniciador inverso 25 mM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 ml, Taq polimerase 5 unidades / ul: 0,04 mL, desionizada H2O: 6,32 mL. </li><li> Toque em uma colônia com um palito estéril e mergulhe o palito com a amostra num tubo de PCR contendo a mistura principal. </li><li> Executar a PCR com o seguinte programa: 10 min 95 ° C (este passo é o de provocar perturbações bacteriana), 10 min 95 ° C (este passo é o de provocar perturbações bacteriana), 35 ciclos (30 segundos a 95 ° C, 1 min a 58 ° C e 4 min a 72 ° C). </li><li> Coloque as amostras de PCR num gel de agarose a 1% com amostras de brometo de etídio e correr para visualizar os fragmentos. </li&gt; </ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Embora a vacina atual contra a tuberculose, BCG, seja a vacina mais amplamente administrada na história, a tuberculose continua sendo uma das principais causas de morte e morbidade por doenças infecciosas em todo o mundo. Esse paradoxo é explicado pela falta de proteção dessa vacina contra a tuberculose pulmonar, a forma responsável de transmissão. Novas abordagens de vacinação eficazes contra as formas pulmonares da doença são urgentemente necessárias, pois teriam o maior impacto na transmissão da doença globalmente.</p...

A tuberculose (TB) é uma das doenças infecciosas, causador de mortes associadas mais do que o HIV no mundo e combinada com o aumento do crescimento de estirpes resistentes a múltiplos fármacos torna a TB um problema de saúde mundial alarmante 1. Novas ferramentas de diagnóstico, drogas mais eficazes e menos tóxicos, e novas vacinas contra a tuberculose seguros e eficazes são uma necessidade urgente, especialmente nos países em desenvolvimento. Vivo atenuado Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) é atualmente a única vacina licenciada contra a tuberculose, que foi administrado por via intradérmica no nascimento desde 1970 em todo o mundo. BCG é considerada eficaz na prevenção de formas graves da doença (meningite e TB miliar) em crianças, mas tem demonstrado eficácia inconsistente contra a TB pulmonar responsável da transmissão da doença 2. vacinação pulmonar, que imita via natural de infecção por tuberculose, representa uma abordagem atraente para o priming resposta imune host locals. A este respeito, vários trabalhos pré-clínicos em diferentes modelos animais relevantes de TB demonstram maior eficácia da vacina após imunização pulmonar, em comparação com a via subcutânea ou intradérmica rota 3-6. No entanto, os mecanismos de protecção activadas por vacinação pulmonar não são bem compreendidos. Nos últimos anos, vários trabalhos têm apontado para resposta mediada por IL17 como um fator importante da resposta imune da mucosa específicos de TB, como em modelos de ratos deficientes em IL17 eficácia protetora induzida pela vacina da mucosa é prejudicada 7,8. Recentemente, demonstrou pela primeira vez que intranasal administração BCG protegido ratinhos DBA / 2, uma cepa de rato caracteriza-se pela falta de proteção após a BCG subcutânea imunização 9. Estes resultados sugerem que a vacinação TB respiratória poderia ser mais eficaz na redução da taxa de TB em países endêmicos, onde BCG intradérmica é considerado ineficaz contra pulmonTB ary.

<table><tbody><tr><td>Caldo Middlebrook 7H9</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enriquecimento</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro de 3 mm de diâmetro</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml 26GA 0,45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>Dissociador GentleMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubos</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &micro; m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise de glóbulos vermelhos</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x concentrado</td></tr><tr><td>de penicilina-estreptomicina Solução</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x concentrado</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Biológico Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Contador de Células Automatizado Portátil</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter Sensors, 40 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculina PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo IFN-&gama; Kit de desenvolvimento ELISA&nbsp;</td>Kit de desenvolvimento <td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA&nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rato Anti-Rato CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Kit Cytofix/Cytoperm BD</td><td></td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rato Anti-rato IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Rato Anti-rato IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0,60 x 30 mm. 23G x 1 1/4"</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Usado como cânula de traqueia para</td></tr><tr><td>placas de poliestireno de 96 poços de fundo plano de poliestireno de alta ligação a proteínas BAL MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>IgA anti-rato de cabra (&alpha;-chain specific)&minus; Anticorpo peroxidase</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-Tetrametilbenzidina (TMB)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polimerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>O kit inclui tampão 5x</td></tr></tbody></table>

a eficácia de protecção e pulmonar resposta imune seguindo subcutânea e intranasal bcg administração em ratinhos

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Apesar da cobertura global da vacinação intradérmica com BCG, a tuberculose continua sendo uma das doenças infecciosas mais prevalentes no mundo. Dados pré-clínicos têm encorajado a vacinação contra tuberculose pulmonar como uma estratégia promissora para prevenir a doença pulmonar, responsável pela transmissão. Neste trabalho, descrevemos a metodologia utilizada para demonstrar no modelo de camundongo os benefícios da vacinação intranasal com BCG quando comparada à subcutânea. Nossos dados revelaram maior eficácia protetora após a administração intranasal de BCG. Além disso, nossos resultados indicam que a vacinação pulmonar desencadeia uma maior resposta imune nos pulmões, incluindo as respostas Th1 e Th17, bem como um aumento da concentração de imunoglobulina A (IgA) nas vias aéreas respiratórias. Nossos dados mostram correlação entre a eficácia protetora e a presença de células produtoras de IL17 nos pulmões pós-desafio com Mycobacterium tuberculosis, sugerindo um papel para essa citocina na resposta protetora conferida pela vacinação pulmonar. Por fim, detalhamos o fluxo de trabalho global que desenvolvemos para estudar a vacinação respiratória no modelo de camundongo, que pode ser extrapolado para outras vacinas contra tuberculose, além da BCG, visando a resposta da mucosa ou outras vias de administração pulmonar, como a intratraqueal ou aerossol.

Este trabalho descreve a comparação de duas vias de administração de BCG: subcutânea e intranasal. via subcutânea é comparável à intradérmica, que é a via clínica corrente de BCG em todo o mundo. Via intranasal de vacinação destina-se a imitar a via natural de infecção de M. tuberculose, com o objetivo de induzir resposta imune diretamente nos pulmões, o principal órgão alvo deste patógeno. A Figura 1...

Detalhamos aqui a metodologia seguida para comparar a eficácia protetora e a resposta imune pulmonar induzida pela imunização intranasal e subcutânea com BCG em modelo de camundongo. Nossos resultados mostram os benefícios da vacinação pulmonar e sugerem um papel da resposta mediada por IL17 na proteção induzida pela vacina.

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar as respostas imunes nos pulmões após a imunização contra tuberculose, incluindo a eficácia protetora da vacina frente a um desafio intranasal e a resposta imune pulmonar local induzida pela vacina. Esta metodologia pode ajudar a responder nossas principais questões no campo da vacina contra tuberculose, incluindo a identificação das respostas imunes pulmonares defensivas desencadeadas por vacinas pulmonares para uma proteção imune pulmonar ideal. Uma vantagem desta metodologia é que a resposta imune pulmonar de cada animal é avaliada individualmente em paralelo com a eficácia protetora.permitindo a identificação dos parâmetros imunes específicos que se correlacionam com proteção. Para a administração subcutânea da vacina BCG, primeiro, encha uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 26 graus com um mililitro da suspensão da vacina BCG e remova as bolhas de ar. Em seguida, posicione um camundongo anestesiado em posição prona dentro de uma cabine de fluxo laminar e inocule o animal subcutaneamente com 100 microlitros da bactéria em um flanco traseiro.Para administração intranasal, carregue uma micropipeta com 20 microlitros da suspensão de BCG e coloque o camundongo anestesiado em posição supina dentro da câmara. Administre o inóculo gota a gota entre as duas narinas até que todo o volume de 20 microlitros tenha sido depositado, deixando um intervalo entre as gotas para permitir que o camundongo aspire a suspensão. Em seguida, recarregue a micropipeta com outros 20 microlitros de bactérias e repita a administração.Para o desafio intranasal com a cepa de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, no ponto temporal experimental apropriado após a vacinação, inocular os animais com a administração intranasal de 40 microlitros da suspensão bacteriana de H37Rv conforme acabou de ser demonstrado. Para obter a lavagem broncoalveolar ou a amostra BAL, primeiro use pinça e tesoura estéreis para expor a traqueia. Em seguida, faça uma pequena incisão na traqueia, tomando cuidado para não excisar completamente o tecido, e insira uma cânula conectada a uma seringa estéril de 1 mL, contendo 800 microlitros de PBS frio em gelo.Quando a cânula estiver posicionada, encha cuidadosamente os pulmões com o PBS e, em seguida, puxe lentamente o êmbolo para recuperar pelo menos 500 a 600 microlitros do fluido de lavagem. Transfira a bola para um tubo de 1,5 mL sobre gelo e confirme que a suspensão é incolor, indicando ausência de contaminação sanguínea. Armazene as amostras sobre gelo até o processamento da bola.Para determinar a carga bacteriana e a resposta imune nos pulmões, fixe o camundongo com agulhas na posição supina sobre uma superfície plana e desinfetada dentro da cabine de fluxo laminar e faça uma incisão na pele superior sobre o tórax. Em seguida, puxe a pele para trás para expor a região torácica e abra os pulmões. Use tesoura e pinça estéreis para coletar os pulmões e o coração e coloque os órgãos sobre uma superfície limpa.Em seguida, remova o coração, a traqueia e o tecido conjuntivo. Coloque cada pulmão em um tubo diferente de 1,5 mL com 1 mL de água desionizada sobre gelo para a determinação posterior da carga bacteriana e das respostas imunes celulares. Quando comparada à via subcutânea, a via intranasal de vacinação confere uma eficácia protetora muito maior nos pulmões.Análise de um número representativo de colônias do grupo vacinado com BCG intranasal por PCR específico para a região genômica RD9 demonstra que todas as colônias fornecem um fragmento de 0,4 quilobases que corresponde ao H37Rv. O BCG intranasal induz níveis mais elevados de IL-17 e interferon gama na produção nos pulmões, revelando uma correlação entre a eficácia protetora conferida pela vacinação intranasal com BCG e a resposta imune induzida pela vacina nos pulmões antes do desafio, com uma concentração mais elevada tanto da proteína derivada purificada total quanto da IgA específica para H37Rv nas amostras de lavado observada nos receptores da vacina intranasal. Análises adicionais de células produtoras de citocinas nos pulmões após o desafio com tuberculose revelaram que, embora células produtoras de interferon gama tenham sido detectadas em todos os grupos infectados, células CD4+ produtoras de IL-17A foram encontradas apenas no grupo vacinado com BCG intranasal, demonstrando uma correlação significativa entre a presença de IL-17 e a redução da carga bacteriana pulmonar.Após este procedimento, é possível comparar as respostas imunes locais no pulmão com o uso de vacinas biodiversas contra tuberculose, bem como diferentes vias de administração e pontos temporais após o desafio. Além disso, esta metodologia pode ser utilizada para avaliar a imunidade induzida pela vacinação após o desafio, o que poderia permitir a identificação das respostas imunes que se correlacionam com proteção.É importante destacar que o trabalho com Mycobacterium tuberculosis exige instalações laboratoriais livres de BCL, e as precauções apropriadas devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para testar a eficácia de uma vacina acelular contra coqueluche acelular contra a infecção por Bordetella pertussis em camundongos. Após a vacinação, os camundongos foram submetidos à infecção e seu homogeneizado tecidual foi cultivado para analisar as colônias bacterianas como uma leitura da imunidade protetora induzida pela vacina.

Avaliação da imunidade induzida por vacina contra infecção bacteriana em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra a imunização intranasal com BCG em camundongos, ativando respostas imunes inatas e adaptativas, levando ao desenvolvimento de células T de memória residentes no pulmão e células B efetoras, aumentando assim a proteção contra infecções por Mycobacterium.

Imunização Intranasal com BCG em Modelo de Camundongo

Vacinação profilática e terapêutica, muitas vezes não estimulam fortes respostas imunes, devido à semana de drenagem da vacina para os gânglios linfáticos e, consequentemente, fraco envolvimento das células do sistema imunológico. Por injecção directa de vacina para os nódulos linfáticos, assim chamada injecção intralinfática, a eficácia da vacina pode ser fortemente melhorada e as doses de vacina podem ser reduzidos.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

O presente trabalho ilustra a conveniência do uso da imunoterapia sublingual para aumentar a resposta imune inata nos pulmões e conferir proteção contra pneumonia pneumocócica aguda em camundongos.

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

Ensaio enzyme-linked immunospot cultivadas interferão-γ longo termo é usado como uma medida das respostas de memória central e correlaciona-se com a resposta à vacina anti-micobacterianos de protecção. Com este ensaio, as células mononucleares de sangue periférico são estimuladas com antigénios micobacterianos e interleucina-2 durante 14 dias, permitindo a diferenciação e a expansão das células T de memória central.

Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Uma nova técnica para antígeno rápida exposição sobre uma superfície bacteriana é apresentada, que envolve a superfície biotinylation seguido por exposição às proteínas de interesse em fusão com avidin monomérico. Carregando a BCG com antígenos selecionados com êxito melhora sua imunogenicidade, sugerindo que a decoração de superfície pode substituir abordagens genéticas tradicionais.

Expressão de antígenos exógenos a Mycobacterium bovis BCG através da decoração de superfície Non-genética com o sistema de avidina-biotina

O desenvolvimento do ensaio ELISpot para cobaia PBMCs interferão-gama permite a caracterização das respostas de células T neste modelo altamente relevantes para o estudo de doenças infecciosas. Temos aplicado o ensaio para medir respostas de células T associadas a intradérmica entrega de vacinas de DNA.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

Aqui nós apresentamos um protocolo elegante na vivo avaliação da vacina respostas imunes de eficácia e de acolhimento. Este protocolo pode ser adaptado para modelos de vacina que estudar virais, bacterianas ou parasitárias patógenos.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Aqui, apresentamos um protocolo alternativo para induzir ativamente encefalomielite autoimune experimental em camundongos C57BL/6, usando o epítopo imunogênico mielina oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55 suspenso em adjuvante de Freund incompleto contendo a subespécie paratuberculosis de Mycobacterium avium morta pelo calor.

Atividade Adjuvante de Mycobacterium paratuberculosis no Aumento da Imunogenicidade de Autoantígenos Durante Encefalomielite Autoimune Experimental

A determinação de unidades formadoras de colônias (UFC) é a técnica padrão-ouro para quantificar bactérias, incluindo o Mycobacterium tuberculosis , que pode levar semanas para formar colônias visíveis. Aqui descrevemos uma micro-UFC para determinação de UFC com maior eficiência de tempo, redução do espaço de laboratório e custo do reagente, e escalabilidade para experimentos de médio e alto rendimento.

Ensaio de Unidade Formadora de Microcolônias para Avaliação da Eficácia de Vacinas Contra Tuberculose

Aprenda a comparar a eficácia protetora da vacinação BCG intranasal versus subcutânea em camundongos. Este método avalia respostas imunes pulmonares e o papel da IL17 na proteção contra tuberculose.

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

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