Medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em E8.5 embriões e neurosphere culturas Usando a F9 RARE-Lacz baseado em células de Ensaio Reporter

O objetivo geral deste procedimento é medir quantitativamente os níveis relativos de ácido retinóico em preparações de tecidos, como embriões de camundongo E8.5 ou culturas de neuroesferas adultas, utilizando um ensaio com repórter baseado em células. Embora a via de sinalização do ácido retinóico seja bem caracterizada, a medição histológica direta do ácido retinóico é tecnicamente inviável. Este ensaio pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre como mutações genéticas podem afetar os níveis de ácido retinóico.

A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente sensível e versátil, com a capacidade de medir uma ampla faixa de concentrações de RA em diversos tipos de amostras de tecidos. Embora este método possa fornecer uma visão direta para determinar os níveis de RA em várias amostras de tecidos, ele também pode ser aplicado a outros estudos, como determinar a presença ou ausência de enzimas metabólicas de RA por meio do monitoramento de alterações nos níveis de RA. Antes de iniciar qualquer experimento, teste a resposta das células F9 RARE-LacZ ao RA. Adicione um nanomolar de RA all-trans a células F9 RARE-LacZ cultivadas em uma placa de 96 poços.

Em seguida, incube a placa e cultive a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, realize a coloração com LacZ e verifique a presença de um precipitado azul nas células. Se a coloração não for uniforme em todo o citoplasma celular, prossiga para subclonar as células.

Divida as culturas selecionadas em placas de 10 centímetros com 100.000 células por 10 mililitros. Após dois dias de cultivo, prepare uma placa de 24 poços com 500 microlitros de gelatina 0,2% por poço e deixe a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova a gelatina e lave os poços duas vezes com 500 microlitros de água destilada.

Agora, adicione 500 microlitros de meio de cultura F9 RARE-LacZ aos poços. Em seguida, selecione colônias de células F9 utilizando uma ponteira estéril P10 e transfira cada uma para um poço. Após três ou quatro dias de cultivo, divida as colônias em duas placas de 24 poços revestidas com gelatina, uma para testes e a outra para expansão.

Após mais dois dias de cultivo, adicione um nanomolar de RA a cada poço de uma placa de 24 poços e cultive-a durante a noite. No dia seguinte, realize uma coloração com LacZ para testar os respondentes altos e expanda o cultivo correspondente. Um dia antes de colher os embriões E8.5 ou dissociar os neuroesferas, recubra uma placa de 96 poços com 100 microlitros de gelatina 0,2% por poço e deixe a placa em repouso por 30 minutos.

Em seguida, aspire a gelatina e enxágue os poços duas vezes com 200 microlitros de água destilada. A seguir, faça a tripsinização das células F9 RARE-LacZ selecionadas mantidas em placas de 10 centímetros. Então, plaque 100.000 células em cada poço de uma placa de 96 poços utilizando meio de cultura sem G418.

Carregue um número suficiente de poços para co-cultivar cada embrião, ou prepare três poços por genótipo se estiver trabalhando com neuroesferas. Prepare também 24 poços para a curva padrão. Em seguida, incube a placa por 24 horas.

Para o cultivo conjunto de células embrionárias, inicie a dissecação de embriões E8,5. Em seguida, adicione um novo tubo de 1,5 mililitro com 10 microlitros de tripsina e, utilizando uma ponteira P20 de orifício alargado, transfira o embrião inteiro para o tubo e coloque o tubo no gelo. Após todos os embriões terem sido isolados, incube todos os tubos a 37 graus Celsius por cinco minutos para dissociar os tecidos.

Após cinco minutos, triture suavemente o conteúdo de cada tubo usando uma ponteira P20 e transfira 10 microlitros para um poço da placa de 96 poços preparada com células F9 RARE-LacZ. Incube a placa durante a noite. Para co-cultivos de neuroesferas, comece transferindo um cultivo de neuroesferas para tubos de 15 mililitros.

Centrifugue os tubos a 200 g por 10 minutos e remova todo o sobrenadante, exceto um mililitro. Em seguida, triture o conteúdo com uma pipeta P1000. Agora, use um pequeno volume para determinar a densidade das células dissociadas.

Em seguida, plaque 100.000 células de neuroesferas dissociadas sobre as células F9 RARE-LacZ. Distribua três poços para cada tipo de cultura de neuroesfera. Agora, certifique-se de preparar os poços para a curva padrão.

Em triplicata, adicione 100 microlitros de soluções de RA todo-trans preparadas por diluição seriada em sete concentrações diferentes em meio de cultura F9 RARE-LacZ. Inclua controles negativos de células não tratadas. Por fim, cultive a placa de 96 poços completamente carregada durante a noite.

No dia seguinte, remova o meio e fixe as culturas utilizando 100 microlitros de glutaraldeído 2,5% por poço. Deixe a placa em incubação à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, remova o fixador e lave os poços duas vezes com 200 microlitros de PBS, durante 10 minutos por lavagem.

Em seguida, lave as cavidades três vezes com 200 microlitros de solução de lavagem LacZ durante 10 minutos por lavagem. Durante a terceira lavagem, prepare a solução de coloração X-gal em um tubo de 15 mililitros envolto em papel alumínio. Além disso, prepare uma câmara umidificada para a placa de 96 poços.

Agora, adicione 200 microlitros da solução de coloração X-gal a cada poço. Coloque a placa dentro da câmara umidificada e incube a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova a solução de coloração LacZ e substitua por 200 microlitros de PBS.

Em seguida, meça a absorbância a 610 nanômetros e image a placa. A linhagem celular repórter F9 RARE-LacZ é composta por células de carcinoma embrionário aderentes que respondem quantitativamente ao ácido retinóico com uma indução proporcional da beta-galactosidase. Elas também possuem uma morfologia epitelial.

Apesar do cultivo com seleção por G418, a resposta dessas células ao RA enfraquecerá após várias passagens. Assim, subclonagens periódicas são necessárias para garantir células respondentes fortes e uniformes ao RA. Espera-se que embriões E8.5 homozigóticos para a mutação vl em Gpr161 apresentem sinalização embrionária de RA reduzida. Utilizando o ensaio de co-cultivo descrito, com embriões dissociados e células F9 RARE-LacZ, essa expectativa foi confirmada.

O co-cultivo de neuroesferas derivadas de adultos selvagens com células F9 RARE-LacZ também foi utilizado para testar a presença de RA nas culturas de neuroesferas. O aumento da coloração, em comparação com as células do estágio E8.5, pode ser devido à homogeneidade das culturas de neuroesferas. Ao gerar uma curva padrão para os níveis de RA, o nível de RA foi quantificável nas culturas de neuroesferas selvagens e nos embriões E8.5.

Ao realizar este procedimento, lembre-se de manter, por meio de subclonagens periódicas, células F9 RARE-LacZ que respondam fortemente ao RA. Além disso, certifique-se de dissociar completamente sua amostra para facilitar a distribuição homogênea e a medição consistente de RA. Após este procedimento, os efeitos de mutações genéticas nos níveis de RA podem ser investigados, e outros métodos podem então ser realizados para investigar quais componentes da via de sinalização de RA são diretamente afetados.