Name: Medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em E8.5 embriões e neurosphere culturas Usando a F9 RARE-Lacz baseado em células de Ensaio Reporter (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a medir níveis de ácido retinóico em embriões E8.5 e neuroesferas usando ensaio reporter com células F9 RARE-LacZ. Este método sensível permite quantificar concentrações de RA em diversas amostras teciduais.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) e Ben Thiede (laboratório do Dr. Jeff Corwin, Universidade da Virgínia) por nos fornecerem as células F9 RARE-LacZ e suporte técnico. Este estudo é financiado pela Comissão de Pesquisa da Medula Espinhal de Nova Jersey (NJCSCR) (Grantnumber: 10-3092-SCR-E-0) e pela Comissão de Pesquisa de Lesões Cerebrais de Nova Jersey (NJCBIR) (número do subsídio: CBIR13FEL006).

Todo o trabalho animal foi feito de acordo com métodos Rutgers-RWJMS IACUC aprovados. 1. Solução e Mídia Preparação <ol><li> Prepare ações e tampão soluções conforme a Tabela 1. Preparar as soluções de trabalho de acordo com a Tabela 2. </li></ol> 2. Cultura e Manutenção de células RARE-LacZ F9 <ol><li> As células congeladas descongelamento <ol><li> Preparar o meio de cultura de células F9 RARO-LacZ como detalhado na Tabela 2. </li><li> O revestimento 10 cm placas de cultura (cultura de células tratadas) com 10 ml de 0,2% de gelatina (consulte a Tabela 2) durante 30 min à TA. Lavar o excesso de gelatina com duas lavagens de 10 ml de água destilada. Imediatamente adicionar 9 ml de meio de cultura de células raras-LacZ F9 para o balão para evitar que a gelatina seque. </li><li> Descongelar uma ampola de células F9 RARO-LacZ 14 num banho de água a 37 ° C durante 2-3 min. Células da placa (cerca de 1 x 10 6 culas / ml) para a placa revestida containing 9 ml de meio de cultura. Cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. Mudar o meio do dia seguinte. </li></ol></li><li> Manutenção da F9 raras células-LacZ <ol><li> Manter uma passagem regular, a cada 2 - 3 dias a uma razão de 1:10. Nota: Não deixe que as células crescem em confluência, pois isso irá resultar em sua diferenciação. </li><li> Dividir as culturas a uma confluência de 80-90%. Remover os meios e lava-se as células com 10 ml de solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS). Remover o PBS e adicionar 1 ml de tripsina, incubar por 5 min. Adicionar 9 ml de meio de cultura, pipeta cima e para baixo e dividir células 01:10 para a passagem. </li></ol></li><li> Congelamento F9 raras células-LacZ <ol><li> Tripsinizar um prato de 10 centímetros contendo raras células F9-lacZ a 80 - 90% de confluência como detalhado no passo 2.2.2. Transferir as células dissociadas num tubo de centrifugação de 15 mL e centrifugação a 200 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender pellet celular em 10 ml de F9 RARE-LacZ freezing médio (ver Tabela 2). Aliquota de 1 ml em criotubos e frascos rotulados transferir para recipientes de congelamento. Coloque recipiente de congelamento em O N e transferência de frascos de -80 ° C congelador / para tanques de nitrogênio líquido no dia seguinte. </li></ol></li></ol> 3. Dissecção da E8.5 embriões <ol><li> Acasalamento gaiola Set-up e bujão de verificação <ol><li> Set-up uma gaiola de acasalamento contendo um par de acasalamento. Na manhã do dia seguinte, para verificar a presença de um plug vaginal e designar o dia um plug é encontrado como o dia 0,5 23. No dia E8.5, embriões colheita. </li></ol></li><li> Dissecação de embriões <ol><li> Sacrificar a barragem por deslocamento cervical e pulverizar a área abdominal com etanol 70% (ver Tabela 2). Adicione um corte transversal sobre a pele acima do abdómen usando tesouras cirúrgicas e puxar as duas abas à parte (anterior e posterior) para expor a região abdominal. Faça um corte semelhanteno peritoneu para expor o abdómen. </li><li> Localize os úteros e solte úteros das tubas uterinas e mesométrio usando um par de tesouras 23. Colocar os úteros em um (cultura de células não-tratadas) disco de 6 cm com 10 ml de PBS 1x para lavar o excesso de gordura e o sangue. Transferir para um outro prato de 6 centímetros contendo frescos 10 ml de 1x PBS. </li><li> Separe um útero que contém um embrião, cortando-a com uma tesoura cirúrgica. Remover o útero e decídua e libertar o saco vitelino, contendo o embrião usando dois pares de NO. 5 fórceps 23. </li><li> Separa-se o saco vitelino a partir do embrião, e transferir o saco vitelino para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, durante a extracção do ADN genómico para ser usado para determinação do genótipo. Usar uma pipeta P20 com uma ponta grande calibre, transferir todo o embrião para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 10 ul de tripsina. Colocar o tubo em gelo. </li><li> Repita os passos 3.2.3 - 3.2.4 até que todos os embriões foram dissecados. </li></ol></li><li> A dissociação embrião<ol><li> Incubar os tubos de 1,5 ml contendo embriões em tripsina a 37 ° C durante 5 min para facilitar a dissociação enzimática. <ol><li> Tritura-se suavemente com uma pipeta de P20 para a dissociação mecânica do embrião, e a placa do volume de 10 ul total contendo um embrião dissociado sobre um poço de células RARO-LacZ F9 em uma placa de 96 poços (ver passo 5.1 para o plaqueamento de células F9 RARO-LacZ numa placa de 96 poços). Cultura O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Laminectomy, Dissecção do Adulto lombar Spinal Cord e Cultura Neurosphere <ol><li> laminectomia <ol><li> Sacrificar um rato (P60) adulto por deslocamento cervical. </li><li> Spray de lado dorsal com 70% de etanol e fazer um corte transversal usando uma tesoura cirúrgica. Puxar ambas as abas (anterior e posterior) afastados para expor a parte de trás e da coluna vertebral. </li><li> Usando uma tesoura cirúrgica, aparar os músculos que cobrem a espinha.Localizar a região lombar da medula espinal, abaixo das costelas. Usando a tesoura, fazer um corte profundo para cortar a coluna vertebral nesse ponto para expor a medula espinhal. </li><li> Puxar para cima a região lombar da coluna vertebral sem. 5 fórceps de modo a que a secção transversal exposta da medula espinal está de frente para o experimentador. Usando as pontas de uma tesoura fina, cortar a vértebra e músculo nas posições 3 e 9 horas da extremidade exposta. Segure a retalho dorsal da vértebra corte com uma pinça. Continuar estas cortes caudalmente até que o comprimento da medula espinal lombar está exposta. </li><li> Libertar a medula espinal a partir das vértebras usando nenhuma. 5, bem como uma pinça de extremidades rombas. Transferir a medula espinal para um tubo de 15 ml contendo 3 ml de meio / cultura de DMEM F12. Manter em gelo até que todas as medulas espinhais lombares foram isolados. </li></ol></li><li> Dissecção da medula espinhal <ol><li> Verter o meio de cultura com a medula espinal em um disco de 6 cm (não-tratado de cultura de células). </li><li> Sob um microscópio estereoscópico, remover os gânglios da raiz dorsal e dos vasos sanguíneos em torno do segmento da espinal medula, agarrando os vasos sanguíneos e dos gânglios utilizando dois pares de NO. 5 pinças e puxando-os para longe da medula espinhal. Transferir o segmento da medula espinhal para um disco de 6 cm com nenhum meio e pique finamente o tecido usando uma lâmina de bisturi. </li><li> Transferência tecido moído para tubo de 15 ml contendo 1 ml de meio de dissociação neuroesfera (ver Tabela 2). Colocar o tubo em gelo e repita os passos 4.2.1 - 4.2.2 até que todas as medulas espinhais foram processadas. </li><li> Incubar os tubos contendo tecido picada em meio de dissociação a 37 ° C durante 10 min, passe rapidamente o tubo no lado de misturar e, em seguida, incuba-se a 37 ° C durante mais 10 min. Após a digestão enzimática, triturar com pipetas polido-fogo de diminuir diâmetros para a dissociação mecânica. Nota: Preparar pipetas fogo-polido de diminuir diâmetros antes de realizar experimentos. Tome um copo Pasteurpipeta e ligue a grande final com algodão limpo. Usando uma lâmpada de álcool, fogo polonês as pontas das pipetas na chama para criar diferentes diâmetros: &quot;regular&quot;, &quot;fino&quot; e &quot;extra fino&quot;. Para pipetas polidas &quot;regulares&quot;, girar a extremidade da pipeta na chama de volta das bordas sem diminuir o diâmetro (~ 1 mm). Gire a extremidade da pipeta na chama por períodos um pouco mais para criar &quot;fino&quot; (~&gt; 1 mm e&gt; 5 mm de diâmetro) e &quot;extra fino&quot; (~ 0,5 mm) pipetas polidas. Não utilizar pipetas com diâmetros inferiores a 0,5 mm. </li></ol></li><li> Cultura neurosphere <ol><li> Spin down tubos contendo dissociada tecido da medula espinhal a 200 xg durante 10 min. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio de cultura neuroesfera (ver Tabela 2). Tritura-se com uma pipeta P1,000 seguido por uma pipeta P200 para facilitar a dissociação. Nota: Evite bolhas de introdução,que iria diminuir a viabilidade celular. </li><li> Transferir 10 uL de células dissociadas num hemocitómetro e obter uma contagem de células. As células em placas a uma densidade de 1x10 5/10 ml num frasco T25 com 10 ml de meio de cultura neuroesfera. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 7 dias, até aparecer 24 neuroesferas. </li></ol></li><li> neurosphere dissociação <ol><li> Recolha cultura neurosphere e transferir para tubos de 15 ml. Girar a 200 xg durante 10 min. Remover a maior parte do sobrenadante deixando atrás de 1 ml. Tritura-se com uma pipeta P1,000 para ressuspender o sedimento celular e dissociar neuroesferas em células individuais. Transferir 10 uL de células dissociadas num hemocitómetro e obter uma contagem de células. </li><li> Placa 1 x 10 5 células dissociadas neuroesferas sobre um poço de F9 RARO-LacZ em uma placa de 96 poços (ver secção 5.1 para plaqueamento F9 RARO-LacZ na placa de 96 poços). Placa 3 poços como repetições. Cultura O / N a 37 ° C e 5% de CO 2.</li></ol></li></ol> 5. RA Ensaio de E8.5 embriões e Medula Espinhal neuroesferas <ol><li> Chapeamento F9 RARE-LacZ na placa de 96 poços <ol><li> Um dia antes da colheita de embriões E8.5 ou dissociação de neuroesferas, revestimento de uma placa de 96 poços com 100 ul de 0,2% de gelatina por poço, durante 30 min à temperatura ambiente. Aspirar a gelatina e lavar duas vezes com 200 ul de água destilada. </li><li> Trypsinize F9 raras células-LacZ mantidas em placas de 10 cm, conforme detalhado na etapa 2.2.2. Placa 1 x 10 5 células / poço de células LacZ F9-raras, mas desta vez usando meio de cultura sem G418. </li><li> Prepare o suficiente para poços de co-cultura de embriões (~ 12-20, dependendo do tamanho da ninhada), neuroesferas (3 poços / genótipo), bem como para uma curva padrão em triplicado (27 poços). </li></ol></li><li> Co-cultura de F9 RARE-LacZ e E8.5 embriões ou da medula espinhal neuroesferas <ol><li> embriões de colheita, conforme detalhado na seção 3.2 e placa em cima da F9Rare-LacZ na placa de 96 poços de secção 5.1. De um modo semelhante, se dissociam neuroesferas e placa no topo de F9 RARO-LacZ na placa de 96 poços como detalhado no passo 4.4. Cultura O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Gerando uma curva padrão <ol><li> Para gerar uma curva padrão, preparar todo-trans retinóico (AR-em) soluções com as seguintes concentrações: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, por diluição em série da em- estoque RA (ver Tabela 1) com meio de cultura RARE-LacZ F9. </li><li> Adicione 100 ml de estes diferentes at-RA concentrações de raras células-LacZ F9 da secção 5.1. Atribuir poços contendo F9 não tratada células RARE-LacZ como controle negativo. Prepare triplicados de cada concentração de AR e poços de controlo negativo. Cultura O / N a 37 ° C e 5% de CO 2. Nota: raras células F9-LacZ responder de uma forma linear dependente da dose, a concentrações variáveis ​​de RA todo-trans. </li></ol></li><li> Ensaio RA <ol><li> Após a cultura D / N da placa de 96 cavidades contendo a curva padrão e co-culturas, remova o material e corrigir as culturas por adição de 100 ul de glutaraldeído a 2,5% (ver Tabela 2) durante 15 min, TA. Remover o fixador e lava-se duas vezes com 200 ul de 1x PBS, 10 min por lavagem. </li><li> Remover PBS e lavar três vezes com 200 ul da solução de lavagem de LacZ (ver Tabela 2), 10 min por lavagem. Durante a terceira lavagem, preparar a solução de coloração com X-gal em um tubo de 15 ml envolvido em folha (ver Tabela 2). Calcular a quantidade de solução de coloração é necessário preparar e a quantidade apropriada (200 ul / poço). Nota: solução de coloração X-gal é sensível à luz. Use a solução de coloração dentro de 15 minutos após a preparação. </li><li> Prepara-se uma câmara humidificada, colocando uma toalha de papel humedecido com água destilada para um recipiente de plástico grande o suficiente para segurar uma placa de 96 poços. Adicionar 200 uL de Xsolução de coloração -gal por poço da placa de 96 poços e colocar a placa numa câmara humidificada. </li><li> Incubar câmara humidificada contendo a placa de 96 poços a 37 ° C para permitir o desenvolvimento de um precipitado de cor azul. Para os embriões E8.5, incubar a placa de O / N (12 - 16 horas). Para culturas de neuroesferas, incubar a placa durante 4-8 horas. </li></ol></li><li> Leitura da absorvância a 610 OD e imagem <ol><li> Após a reação de cor, remova a solução de coloração LacZ e substituir com 200 ul 1x PBS. Medir a absorvância a 610 nm utilizando um leitor de placas ELISA padrão para quantificar a resposta repórter para RA. Imagem poços individuais usando um microscópio estereoscópico padrão equipado com uma câmera. </li></ol></li></ol> 6. Subclonagem de F9 raras células-LacZ <ol><li> Verificando F9 RARE-LacZ rResponse à AR <ol><li> Antes de iniciar quaisquer experiências, testar a resposta das células RARE-LacZ F9 para RA. Placa F9 RARE-LacZ cells em placas de 96 poços (ver secção 5.1), e adicione 1 nM all-trans ácido retinóico (veja o passo 5.3). Incubar numa câmara humidificada a 37 ° CO / N. </li><li> Visualize desenvolvimento de precipitado de cor azul usando um microscópio. Se o desenvolvimento de cor não é uniforme por todas as células no poço (ver Figura 1B, à esquerda), efectuar a subclonagem detalhado abaixo. </li></ol></li><li> Subclonagem de F9 raras células-LacZ <ol><li> Dividir as células RARE-LacZ F9 cultivadas em placas de 10 cm, conforme detalhado na etapa 2.2.2. Em vez de uma razão de 1:10, chapear uma baixa densidade de semeadura de 1 x 10 5 células / 10 ml numa placa de 10 cm para permitir o crescimento de colónias isoladas de tal modo que cada colónia surge a partir de uma célula RARO-LacZ único F9. </li><li> Após dois dias, revestimento de uma placa de 24 poços com 500 ul de 0,2% de gelatina por poço, durante 30 min. Remoção da solução de gelatina e lavar os poços duas vezes com 500 mL de água destilada. Substituir a água com 500 mL de meio de cultura celular RARE-LacZ F9. </li><li> Escolha uma colónia utilizando uma ponta de pipeta estéril P10 ea transferência para um poço; fazer isso 24 vezes para obter 24 colónias individuais. Cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 3 - 4 dias. </li><li> Dividir as colónias individuais em duas placas de 24 poços. Após 2 dias em cultura, adicionar 1 nM de RA para cada poço de uma placa de 24 poços e cultura D / N. Execute coloração LacZ, conforme detalhado na seção 5.4 para testar altos respondedores. Visualizar reacção de cor de cada poço sob um microscópio para determinar respondedores fortes e uniformes. </li><li> Uma vez que uma resposta forte do subclone é determinada, expandir a cultura correspondente de outra placa de 24 poços. Expandir ainda mais que a colônia em uma placa de 10 cm, congelar-se vários frascos conforme detalhado na seção 2.3, e descartar todas as outras colônias. Nota: Apenas cerca de um quarto das colônias originais resultar em altos respondedores. Normalmente, a primeira rodada de subclonagem não resulta em coloração LacZ uniforme e uma rodada subseqüente de subclonagem precisa ser feito paraalcançar respondedores fortes uniformes. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Vilhais-Neto, G. C., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid.</a> Curr Biol. 18 (5), R191-R192 (2008).</li>
<li>Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+the+functioning+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signalling%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in the functioning brain.</a> Science Signalling. 324, 1-3 (2006).</li>
<li>Lane, M. A., Bailey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+retinoid+signalling+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Role of retinoid signalling in the adult brain.</a> Prog Neurobiol. 75 (4), 275-293 (2005).</li>
<li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+signalling+in+the+development+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinoid signalling in the development of the central nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (11), 843-853 (2002).</li>
<li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+and+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Retinoids and spinal cord development.</a> J Neurobiol. 66 (7), 726-738 (2006).</li>
<li>Rhinn, M., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signalling+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signalling during development.</a> Development. 139 (5), 843-858 (2012).</li>
<li>Ang, H. L., Deltour, L., Hayamizu, T. F., Zgombic-Knight, M., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+synthesis+in+mouse+embryos+during+gastrulation+and+craniofacial+development+linked+to+class+IV+alcohol+dehydrogenase+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid synthesis in mouse embryos during gastrulation and craniofacial development linked to class IV alcohol dehydrogenase gene expression.</a> J Biol Chem. 271 (16), 9526-9534 (1996).</li>
<li>Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+premature+retinoic+acid+synthesis+in+Xenopus+embryos+following+premature+expression+of+aldehyde+dehydrogenase+ALDH1%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of premature retinoic acid synthesis in Xenopus embryos following premature expression of aldehyde dehydrogenase ALDH1.</a> Eur J Biochem. 260, 227-234 (1999).</li>
<li>Bastien, J., Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retinoid+receptors+and+the+transcription+of+retinoid-target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes.</a> Gene. 328, 1-16 (2004).</li>
<li>Chatzi, C., Cunningham, T. J., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinoic+acid+function+during+embryonic+brain+development+using+retinaldehyde-rescued+Rdh10+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinoic acid function during embryonic brain development using retinaldehyde-rescued Rdh10 knockout mice.</a> Dev Dyn. 242 (9), 1056-1065 (2013).</li>
<li>Sakai, Y., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+retinoic+acid+catabolism+with+reporter+systems+and+by+in+situ+hybridization+for+CYP26+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of retinoic acid catabolism with reporter systems and by in situ hybridization for CYP26 enzymes.</a> Methods Mol Biol. 652, 277-294 (2010).</li>
<li>Yamamoto, M., Drager, U. C., McCaffery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+retinoic+acid+catabolic+enzymes+shows+high+expression+in+the+developing+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">A novel assay for retinoic acid catabolic enzymes shows high expression in the developing hindbrain.</a> Dev Biol Res. 107, 103-111 (1998).</li>
<li>Rossant, J., Zirngibl, R., Cado, D., Shago, M., Giguere, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+retinoic+acid+response+element-hsplacZ+transgene+defines+specific+domains+of+transcriptional+activity+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a retinoic acid response element-hsplacZ transgene defines specific domains of transcriptional activity during mouse embryogenesis.</a> Genes & Dev. 5, 1333-1344 (1991).</li>
<li>Wagner, M., Han, B., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+retinoid+release+from+embryonic+neural+tissue+detected+by+an+in+vitro+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regional differences in retinoid release from embryonic neural tissue detected by an in vitro reporter assay.</a> Development. 116, 55-66 (1992).</li>
<li>Luo, T., Wagner, E., Crandall, J. E., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic-acid+critical+period+in+the+early+postnatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A retinoic-acid critical period in the early postnatal mouse brain.</a> Biol Psychiatry. 56 (12), 971-980 (2004).</li>
<li>Luo, T., Wagner, E., Grun, F., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+the+brain+marks+formation+of+optic+projections%2C+maturation+of+the+dorsal+telencephalon%2C+and+function+of+limbic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in the brain marks formation of optic projections, maturation of the dorsal telencephalon, and function of limbic sites.</a> J Comp Neurol. 470 (3), 297-316 (2004).</li>
<li>Kelley, M. W., Xu, X. M., Wagner, M. A., Warchol, M. E., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+organ+of+Corti+contains+retinoic+acid+and+forms+supernumerary+hair+cells+in+response+to+exogenous+retinoic+acid+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The developing organ of Corti contains retinoic acid and forms supernumerary hair cells in response to exogenous retinoic acid in culture.</a> Development. 119, 1041-1053 (1993).</li>
<li>McCaffery, P., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+spots+of+retinoic+acid+synthesis+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Hot spots of retinoic acid synthesis in the developing spinal cord.</a> Proc Natl Acad Sci. 91, 7194-7197 (1994).</li>
<li>Hu, L., Gudas, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+analogs+and+retinoic+acid+influence+the+expression+of+retinoic+acid+receptor+alpha%2C+beta%2C+and+gamma+mRNAs+in+F9+teratocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP analogs and retinoic acid influence the expression of retinoic acid receptor alpha, beta, and gamma mRNAs in F9 teratocarcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 10 (1), 391-396 (1990).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratocarcinomas+and+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis.</a> Science. 209 (4458), 768-776 (1980).</li>
<li>Strickland, S., Mahdavi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+induction+of+differentiation+in+teratocarcinoma+stem+cells+by+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The induction of differentiation in teratocarcinoma stem cells by retinoic acid.</a> Cell. 15 (2), 393-403 (1978).</li>
<li>Li, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+GPCR%2C+Gpr161%2C+regulates+the+retinoic+acid+and+canonical+Wnt+pathways+during+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan GPCR, Gpr161, regulates the retinoic acid and canonical Wnt pathways during neurulation.</a> Dev Biol. 402 (1), 17-31 (2015).</li>
<li>Hogan, B., Constantini, F., Lacy, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , 1st, Cold Spring Harbor Laboratory. (1986).</li>
<li>Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+expansion%2C+and+differentiation+of+adult+Mammalian+neural+stem+and+progenitor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation, expansion, and differentiation of adult Mammalian neural stem and progenitor cells using the neurosphere assay.</a> Methods Mol Biol. 549, 91-101 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A linha de células F9 RARO-LacZ 14 é um poderoso sistema que pode ser usado para a detecção de RA produzido por explantes de tecido 12,14,17,18. É sensível a concentrações de RA tão baixas como 100 fM, sem resposta não específica detectada em células não tratadas com RA 12,14,18. Além disso, as células repórter responder aos RA todo-trans de uma forma linear dentro de um intervalo específico de concentração, permitindo assim que a reacção de LacZ a ser quantificado e utilizado para determinar a magnitude de níveis RA 12,14,18. O ensaio de repórter RA rápido e fácil aqui apresentado utiliza a linha F9 de células repórteres RARE-LacZ para visualização (Figura 2) e medição quantitativa relativa (Figura 3) de embriões e adultos cultivadas células-tronco neurais. Este sistema repórter permite a comparação dos níveis endógenos de AR entre amostras individuais, como mostrado na Figura 2. É sensível o suficiente para ser capaz de detectar RAgerado por embriões E8.5 individuais (Figura 2A), bem como RA produzidos por neuroesferas cultivadas (Figura 2B). A resposta dose-dependente desta linha de células em diferentes concentrações de RA permite a quantificação dos níveis de RA (Figura 3A) nas amostras, bem como a comparação dos níveis relativos entre as amostras de RA (Figura 3B). É importante observar que a linhagem de células repórter RARO F9 mede a quantidade total de RA gerado pelas amostras de tecido ao longo do tempo de incubação. Isto é equivalente ao saldo líquido de síntese de RA e catabolismo. Enquanto o sistema repórter de células F9 RARE-LacZ é altamente sensível e versátil, existem várias etapas críticas de solução de problemas que temos incorporadas a fim de garantir a fiabilidade deste sistema. Em primeiro lugar, como se mostra na Figura 1, é importante para manter a saúde destas células através de passagens regulares sem que elas glinha até à confluência. Em segundo lugar, temos observado mais tarde passagens tendem a resultar em respostas RA inconsistentes, mesmo se as culturas são constantemente mantidos sob selecção com G418. Para solucionar isso, recomenda-se a descartar culturas após 20 passagens e descongelar um novo frasco. Além disso, os controlos regulares devem ser realizados para assegurar que as células repórter ainda apresentam uma resposta forte para a presença de RA nos meios de comunicação. Em terceiro lugar, se as primeiras passagens exibir fraca resposta ou não-uniforme para RA (Figura 1B, à esquerda), uma ou várias rondas de subclonagem podem ser necessários até respondedores fortes são obtidos (Figura 1B, righ t). Finalmente, antes da co-cultura, recomenda-se que as amostras de tecidos, tais como embriões e neuroesferas dissociadas são para células individuais. Temos observado que a dissociação das amostras Resultados das medições colorimétricas mais consistentes. Isto pode ser devido a uma distribuição mais uniforme da AR em poços de cultura, tal como as células dissociadas são em uniformulário de contato com as células repórter. Várias modificações também foram feitas para o protocolo original de 14. Em primeiro lugar, a resposta RA das células F9 RARO-LacZ foram quantificadas directamente através da fixação das células e a medição da absorvência a 610 nm em vez de células de recolha e análise de lisado para a actividade de b-galactosidase 14. Outra modificação é a co-cultura directa de amostras dissociadas com F9 RARO-LacZ antes da quantificação da resposta RA. Métodos anteriores relataram a cultura de amostras separado e adicionando apenas a mídia a partir destas culturas a F9 RARE-LacZ 16,18. Apesar de ser um sistema poderoso, o ensaio repórter RARE-LacZ F9 tem várias limitações. Uma limitação desta linha celular repórter é que, embora ele responde fortemente para a presença de todo-trans RA, que também responde a outros isómeros do ácido retinóico, incluindo 9-cis-RA e 13-cis-RA; no entanto, eles são 100 vezes mais sensíveis à all-trans-RA compavermelho para os outros isómeros 18. Uma outra limitação deste sistema é que a resposta dependente da dose linear só cai entre 10 -13 M a 10 -7 M a RA-14,18; Assim, se a comparação dos níveis de RA fora destes limites, pode ser necessário efectuar uma diluição de série da amostra até que as medições estão dentro do intervalo linear. Por último, uma vez que este é essencialmente um ensaio colorimétrico, o ponto final do desenvolvimento da cor pode variar entre amostras e experimentos. Assim, é importante que uma curva padrão estar sempre banhado em paralelo para cada experiência de forma a utilizá-lo para a quantificação da resposta das células repórter. Em conclusão, nós relataram o uso da linha celular repórter RARE-LacZ RA F9 para medir os níveis de AR quantitativamente em embriões E8.5 e, anteriormente não declarada, em neurospheres. A versatilidade deste sistema repórter pode permitir que a quantificação dos níveis de RA em virtualmente qualquer tipo de célula ou tecido, e may resultar no desenvolvimento de aplicações variadas no futuro.

O ácido retinóico (RA) é um derivado metabolito de retinol ou vitamina A e é produzida através da actividade sequencial de várias desidrogenases celulares 1. Devido à sua natureza química anfifático, que atravessa facilmente membranas lipídicas e podem actuar como um factor morfogenético de 1 solúvel. É uma molécula essencial que regula numerosos processos celulares de desenvolvimento e adultos, actuando como um ligando para os receptores de retinóide nuclear e activação da expressão do gene de 10/02. Sem RA, estes receptores de AR (RAR) Rares ligamento no DNA e atuam como repressores; RA se ligar a esses receptores os transforma em activadores transcricionais, resultando na expressão do gene alvo 1,5,6. Embora a via de sinalização RA está bem caracterizado, o tamanho pequeno (~ 300 Da) e da natureza anfipática da AR faz a visualização histológica direta e medição de RA atualmente tecnicamente inviável 11. O único método para direct medição de níveis de AR é através do isolamento de AR a partir de amostras de tecido, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) 11. Este método normalmente requer grandes quantidades de tecido, facilitados através da partilha de amostras diferentes 12. Assim, esta técnica é pouco adequado para a medição de níveis de AR em embriões individuais ou pequenas quantidades de amostra / tecido. A fim de investigar a função celular de RA, vários métodos têm sido desenvolvidos para inferir indirectamente a presença de RA. Esses métodos fazem uso de sistemas repórter contendo o RAR-beta altamente responsivo RARO dirigir a expressão da beta-galactosidase ou luciferase 11,13,14. O ratinho transgénico repórter LacZ-RARA gerado por Rossant et ai. 13 é um sistema ideal para a visualização de regiões espaço-temporais da sinalização de AR in situ 11,13,15,16, mas não é adequada para medições quantitativas. A linha F9 celular RARE-LacZ 14, em tele outro lado, é útil para a detecção de RA e medições quantitativas dos níveis de RA em explantes de tecido 11,12,14,17,18. Células de teratocarcinoma F9 expressam alfa endógeno, beta-, e gama-ácido retinóico receptores 19, e iniciar a diferenciação em endoderme parietal após exposição a RA 19-21. células F9 foram há muito estabelecida como um modelo para a diferenciação celular induzida por RA, o que é por isso que foi escolhido como uma linha celular ideal para um ensaio de repórter de RA. A linhagem de células repórter Sil-15 RA-F9 derivado gerado por Wagner et ai. 14 contém uma E. coli&#39;LacZ gene a jusante de uma cópia do elemento retinóico 64-pb resposta ácido (raro) do gene (RAR-beta) beta-receptor do ácido retinóico humano. A fim de seleccionar e manter os clones estáveis, o construto também contém o gene de aminoglicósido fosfotransferase (neor) como um marcador seleccionável na presença de G418. Esta co construtonfers expressão indutível de b-galactosidase na presença de RA, o que pode ser visualizado por meio de coloração LacZ e esta resposta pode ser subsequentemente quantificado utilizando métodos colorimétricos 11,12,14,18. Esta linha de células relatora extremamente versátil, tem sido amplamente utilizado na detecção da produção endógena de RA por meio de co-cultura de amostras de tecido com as células repórter, tais como a cóclea e 17 embrionárias explantes placa de fundo 14. Além disso, esta linha repórter foi utilizada para a quantificação dos níveis de RA na medula espinal em desenvolvimento, a cultura de secções de dados agregados de medulas espinais embrionários separadamente e adicionando meio condicionado a partir destas culturas de células F9 RARO-LacZ 18. A quantificação foi realizada após coloração LacZ através da leitura colorimétrica utilizando um leitor de placas ELISA padrão 11,12,18. Por último, esta linha de células relatora foi usado na detecção da presença de enzimas metabólicas RA por monitoring muda em níveis RA 12,18. Aqui mostramos que a sensibilidade desta linhagem de células repórter também permite a medição dos níveis de RA gerada a partir de embriões E8.5 co-cultivadas individuais. Isto permite a comparação entre os embriões individuais de diferentes genótipos. Como um exemplo específico, Gpr161 é um GPCR órfãos que regula neurulação em parte, através da via de sinalização RA 22, e que relatam o uso desta linha de células relatora para investigar o efeito de uma mutação recessiva no Gpr161 (Gpr161 VL) sobre os níveis globais de RA no embrião. Além disso, a versatilidade e a facilidade de utilização deste sistema repórter permite a liberdade para medir e comparar os níveis de RA em amostras de tecido diferentes, mesmo em culturas de neuroesferas obtidos a partir de células estaminais de medula espinal adulta. Aqui descrevemos a determinação quantitativa dos níveis de AR relativas em embriões e culturas de neuroesferas através de co-cultura directa com o RA representante LacZ-RARE F9linha de células orter.

<table><tbody><tr><td>Cepa de camundongo C3H / HeSn-Gpr161vl / J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000316</td><td></td></tr><tr><td>linha</td><td></td><td></td> celular repórter F9 RARE-LacZ <td>do Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) e Ben Thiede (laboratório do Dr. Jeff Corwin, Universidade da Virgínia)</td></tr> <tr><td>DMEM / F-12 (com L-glutamina e HEPES)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS), qualificado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td>Loja a -20 &deg; C em alíquotas de 10 ml, para evitar a repetição da congelação e descongelação; quente em 37 > C para preparação de meios</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Armazene a -20 &deg; C em alíquotas de 10 ml, para evitar a repetição da congelação e descongelação; sensível à luz</td></tr><tr><td>G418</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-027</td><td>Loja em 4 &deg; C; </td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td> sensível à luz 2% <td>Loja a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Suplemento B-27 (solução estoque a 2%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Armazenar a -20 &graus; C em alíquotas de 1 ml para evitar o congelamento e descongelamento repetidos; quente à temperatura ambiente para preparação de meios</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Epidérmico Murino (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td>Prepare 100 &mu; g/ml de solução estoque em albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% em 1xPBS; preparar concentrações de trabalho diluindo com 1x PBS; armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Fibroblastos Murinos (FGF)-básico</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td>Prepare 100 &mu; g/ml de solução estoque em albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% em PBS 1x; preparar concentrações de trabalho diluindo com 1x PBS; armazene a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>50% glutaraldeído</td><td>Amresco</td><td>M155</td><td>Armazenar a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Desoxicolato de sódio monohidratado (C24H39NaO4 &middot; H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5670</td><td>Loja em RT</td></tr><tr><td>X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-d-galactopiranosídeo)</td><td>Promega</td><td>V3941</td><td>Estoque da loja em -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>41639</td><td>Armazene na RT</td></tr><tr><td>all-trans Retinoic Acid (at-RA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R-2625</td><td>Armazene alíquotas de 1 ml de estoque em -80 &deg; C; extremamente sensível à luz</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12605-010</td><td>Armazenar a</td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td>alternativa ao TrypLE Express; alíquota e armazenar a -20 &deg; </td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de C Hank (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170-112</td><td>Armazene em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>10x solução tamponada com fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Armazene a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LK003176</td><td>Store em 4 >C.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington</td><td>LS003703</td><td>Armazenar em alíquotas de 1 ml a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Ácido hialurônico</td><td>Calbiochem</td><td>385908</td><td>Store 200 &mu; l alíquotas a -20 &deg;C.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td>Store em 200 &mu; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ácido Kynurênico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K3375</td><td>Loja em 200 &mu; l alíquotas em -20 &deg; C</td></tr><tr>Etanol <td></td><td></td><td></td><td>95%</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Recipiente de congelamento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 10 cm (não tratada para cultura de células)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 10 cm (tratada para cultura de células)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 6 cm (não tratada para cultura de células)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 96 poços</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Tubos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de microcentrífuga âmbar de 1,5</td></tr><tr><td>ml Crioviais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 1,5 ml 37 &deg; C Tesoura cirúrgica em banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td>cirúrgica fina</tr><tr><td>nº 5 Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sem corte</td> Lâmina <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de<td>bisturi</td></tr><tr><td>Pasteur de vidro Pipetas de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>algodão</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>estereomicroscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>leitor de placas</td><td></td><td></td><td></td>ELISA</tr> <tr><td>com lâmpada</td><td></td><td></td><td></td>para álcool</tr></tbody></table>

medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em e8.5 embriões e neurosphere culturas usando a f9 rare-lacz baseado em células de ensaio reporter

Quantitative Measurement of Relative Retinoic Acid Levels in E8.5 Embryos and Neurosphere Cultures Using the F9 RARE-Lacz Cell-based Reporter Assay

O ácido retinóico (AR) é um importante morfogênio do desenvolvimento que coordena a padronização dos eixos anteroposterior e dorsoventral, diferenciação somítica, neurogênese, padronização do rombencéfalo e da medula espinhal e o desenvolvimento de múltiplos sistemas de órgãos. Devido à sua natureza química como um pequeno lipídio anfipático, a detecção e visualização diretas da AR histologicamente permanecem tecnicamente impossíveis. Atualmente, os métodos utilizados para inferir a presença e localização da AR fazem uso de sistemas repórteres que detectam a atividade biológica da AR. A maioria dos sistemas repórteres estabelecidos, tanto camundongos transgênicos quanto linhagens celulares, fazem uso do elemento de resposta RA altamente potente (RARE) a montante do gene RAR-beta para impulsionar a expressão induzível por RA de genes repórteres, como beta-galactosidase ou luciferase. O camundongo transgênico RARE-LacZ é útil na visualização de mudanças espaço-temporais na sinalização da AR, especialmente durante o desenvolvimento embrionário. No entanto, ele não mede diretamente os níveis gerais de AR. Como um sistema repórter, a linhagem celular F9 RARE-LacZ pode ser usada de várias maneiras, desde a simples detecção de AR até medições quantitativas dos níveis de AR em explantes de tecidos. Aqui descrevemos a determinação quantitativa dos níveis relativos de AR gerados em embriões e culturas de neuroesferas usando a linhagem celular repórter F9 RARE-LacZ.

O LacZ-RARA F9 repórter é uma linha de células de carcinoma embrionário aderentes cultivadas na superfície revestida de gelatina. A construção repórter permite que as células respondam quantitativamente a RA com uma indução proporcional de beta-galactosidase. 11,12,14,18. Estas células exibem uma morfologia epitelial (Figura 1A). Devido à sua elevada taxa de duplicação, recomenda-se que estas células sejam divididas a cada 2 - 3 dias a uma razão de 1:10. Durante o nosso trabalho com esta linha de células relatora, observou-se que mesmo com a adição de G418 no meio de cultura, a resposta destas células a RA enfraquece depois de várias passagens (Figura 1B, à esquerda), e isso pode afectar a capacidade de repórter de esta linha de células. Esta perda de capacidade de resposta pode ser devida à perda parcial do transgene em passagens posteriores. Como tal, a subclonagem periódica é necessária para assegurar respondedores fortes e uniformes de RA (Figura1B, à direita). Embora várias utilizações desta linha celular foi publicado anteriormente 12,14-18, aqui relatado é o uso desta linha de células para medir os níveis endógenos de AR a partir de embriões E8.5 individuais com diferentes genótipos. Os resultados Gpr161 VL / VL mutação no diminuiu RA embrionário de sinalização 22. Tal como mostrado por co-cultura de embriões dissociadas com raras células F9-LacZ, estes Gpr161 VL / VL embriões reduziram endógena RA em comparação com crias da mesma ninhada de tipo selvagem (Figura 2A). Devido à versatilidade desta linha de células relatora, também aqui relatado é uma nova utilização dessas células para detectar níveis RA produzidos por culturas de neuroesferas obtidos a partir de ratinhos adultos Gpr161 wt / wt (Figura 2B). Esta linha de células repórter foi capaz de demonstrar que as culturas de neuroesferas de células-tronco da medula espinhal adultos produzir RA endógeno. A grande diffrência na intensidade de coloração indica uma resposta de células repórter maior para neurospheres da medula espinhal, em comparação com embriões E8.5. Isto pode ser devido aos níveis muito mais elevados de AR gerados pelos neuroesferas ao longo do tempo em comparação com os embriões E8.5, o que pode ser devido ao facto de neuroesferas culturas são mais homogéneo do que os embriões E8.5 e, assim, conter mais células RA-produtoras. A adição de diferentes concentrações de resultados a-AR em uma resposta linear dependente da dose das células repórter. Esta resposta pode ser medida colorimetricamente por leitura da absorvância a 610 nm. A curva padrão gerada pode então ser utilizada para quantificar os níveis de AR em amostras, tal como em culturas de tipo selvagem neuroesferas (Figura 3A) ou de embriões E8.5 (Figura 3B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig1.jpg" /> Figura 1. Manutenance e Subclonagem de raras células-LacZ F9. (A) Uma imagem de contraste de fase de células RARE-LacZ F9 é mostrado. Estas células têm um tempo de duplicação de 10 h ~ e tem de ser transmitido a cada 3 dias. (Aproximadamente 70 - 80% de confluência) com uma razão de 01:10 (B) controlo periódico de culturas com a adição de 1 nm a-AR e LacZ subsequente coloração deve ser feito para garantir culturas permanecem respondedores fortes e uniformes de RA (direita). Em caso de maus respondedores e não-uniformes (esquerda), deve ser realizada subclonagem. Escala de barras 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig2.jpg" /> Amostras Figura 2. LacZ Coloração de Co-cultura (dissociado E8.5 Embriões / neuroesferas) e F9 raras células-LacZ. (A) embrião de rato E8.5<html> s de vários genótipos foram dissociadas e semeadas em cima de raras células-LacZ F9. LacZ coloração 24 horas mais tarde permite a visualização de resposta das células F9 RARE-LacZ a RA endógena produzidos por amostras co-cultivadas. O Gpr161 vl mutação resulta na diminuição da RA endógena como visualizadas pela resposta reduzida das células repórter. (B) Esquerda. Uma imagem de contraste de fase de neuroesferas cultivadas a partir da medula espinhal células-tronco neurais adultas é mostrado. Certo. Neurospheres derivados de adulto Gpr161 medula espinhal p / p foram dissociadas e semeadas em cima de raras células-LacZ F9. A presença de precipitado azul após coloração LacZ indicar a presença de RA endógena nestes neuroesferas. A diferença na intensidade de coloração entre neuroesferas e embriões E8.5 co-culturas indicam maiores níveis de RA presente em neurospheres do que embriões E8.5. Escala das barras 100 um.target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54443/54443fig3.jpg" /> Figura 3. Curva padrão e Colorimétrico quantificação dos níveis de RA. A resposta da linhagem de células repórter F9 RARO-LacZ pode ser medido colorimetricamente a 610 nm utilizando um leitor de placas ELISA padrão. (A) Curva padrão representativo, utilizado para quantificar os níveis relativos de RA tipo selvagem neurosphere cultura s. (B) Quantificação dos níveis relativos de AR a partir de embriões E8.5 co-cultivadas. N = 3; * P &lt;0,05, teste t de estudante. As barras de erro SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54443/54443fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> StoBuffers ck / Soluções </td><td> componentes </td><td> Condições de armazenamento </td></tr><tr><td> 10% de desoxicolato de sódio mono-hidratado (C 24 H 39 NaO 4 · H2O) </td><td> 10 ml em 100 ml de dH2O </td><td> 4 ºC </td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio 1 M (MgCl2) </td><td></td><td> RT </td></tr><tr><td> 100x ferrocianeto de potássio (K 4 [Fe (CN) 6] · 3 H 6 O) </td><td> 2,12 g em 10 ml de dH2O </td><td> RT no escuro </td></tr><tr><td> 100x ferricianeto de potássio (K 3 [Fe (CN) 6]) </td><td> 1,64 g em 10 ml de dH2O </td><td> RT no escuro </td></tr><tr><td> 20 mg / ml de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-galactopiranósido) </td><td> adicionar 5 ml de dimetil formamida para fazer 20 mg solução estoque / ml </td><td> -20 ºC </td></tr><tr><td> 10 mM de (3 mg / ml), todos os trans ácido retinóico </td><td> Dissolve-se 50 mg em 16,67 ml de etanol absoluto. Prepare a aliquotas de 1 mL. </td><td> -80 ºC no escuro, em tubos de 1,5 ml âmbar microcentrífuga </td></tr><tr><td> papaína </td><td> dissolver um frasco em 7 ml de HBSS </td><td> 4 ºC </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Tampões e Soluções composições. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Trabalhando Buffers / Soluções </td><td> componentes </td><td> Condições de armazenamento </td></tr><tr><td> meio de cultura de células F9 RARE-LacZ </td><td> 50 mL de soro bovino fetal (FBS) (concentração final 10%) </td><td> Filtrar-esterilizar. </td></tr><tr><td></td><td> 5 ml de 100 x penicilina estreptomicina (final de 1X conc) </td><td> Armazenar a 4 ºC. </td></tr><tr><td></td><td> 4ml 50 mg / ml de G418 (final de conc 0,4 mg / ml) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> para 500 ml de DMEM / F-12 (com L-glutamina e HEPES) </td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de gelatina </td><td> 25 ml de 2,0% de gelatina </td><td> Armazenar a 4 ºC. </td></tr><tr><td></td><td> 80 ml de água destilada </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Misture bem </td><td></td></tr><tr><td> 70% de etanol </td><td> 30 ml de etanol a 95% </td><td> Coloque no frasco de spray. </td></tr><tr><td></td><td> 70 ml de água destilada </td><td> Armazenar a RT </td></tr><tr><td> meio de dissociação Neurosphere </td><td> 1 ml 20U papaína </td><td> preparar, de fresco cada vez </td></tr><tr><td></td><td> 100 ul 13 mg / ml de tripsina </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 100 ul de 7 mg de ácido hialurónico / ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 28 ul de 10 mg / ml de ADNasel </td><td></td></tr><tr><td></td><td>50 ul de 4 mg / ml de ácido quinurï¿½ico </td><td></td></tr><tr><td> meio de cultura Neurosphere </td><td> DMEM / F-12 (com L-glutamina e HEPES) </td><td> preparar, de fresco cada vez </td></tr><tr><td></td><td> 2% suplemento B-27 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 factor de ng / mL de crescimento de fibroblastos (FGF) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> factor de crescimento epidermal 20 ng (EGF) </td><td></td></tr><tr><td> 2,5% de glutaraldeído </td><td> 250 ul 50% de glutaraldeído </td><td> preparar, de fresco cada vez </td></tr><tr><td></td><td> 4750 ul de 1x PBS </td><td></td></tr><tr><td> solução de lavagem LacZ </td><td> 0,5 ml de 10% de desoxicolato (concentração final 0,1%) </td><td> Armazenar a 4 ºC. </td></tr><tr><td></td><td> 1,0 ml de 100% de NP-40 (concentrado final de 0,2%) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 50 ml de PBS 10X </td><td></td></tr><tr><td></td><td> água destilada para 500 ml </td><td></td></tr><tr><td> solução de coloração X-gal </td><td> ferrocianeto de potássio 1x </td><td> preparar, de fresco cada vez </td></tr><tr><td></td><td> ferricianeto de potássio 1x </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1 mg / ml de X-gal </td><td></td></tr><tr><td></td><td> ao volume apropriado usando solução de lavagem LacZ </td><td></td></tr><tr><td> F9 LacZ RARO de médio congelamento </td><td> F9 meio de cultura RARE-LacZ + 5% de DMSO </td><td> preparar, de fresco cada vez </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Os tampões de Trabalho e Solution composições.

Não existem métodos para medir com precisão os níveis de ácido retinóico (AR) em pequenas quantidades de tecido. Este protocolo descreve a medição fácil e quantitativa dos níveis relativos de AR em embriões e neuroesferas E8.5 usando uma linha de células repórter de AR.

Medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em E8.5 embriões e neurosphere culturas Usando a F9 RARE-Lacz baseado em células de Ensaio Reporter

Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, ...

O objetivo geral deste procedimento é medir quantitativamente os níveis relativos de ácido retinóico em preparações de tecidos, como embriões de camundongo E8.5 ou culturas de neuroesferas adultas, utilizando um ensaio com repórter baseado em células. Embora a via de sinalização do ácido retinóico seja bem caracterizada, a medição histológica direta do ácido retinóico é tecnicamente inviável. Este ensaio pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre como mutações genéticas podem afetar os níveis de ácido retinóico.A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente sensível e versátil, com a capacidade de medir uma ampla faixa de concentrações de RA em diversos tipos de amostras de tecidos. Embora este método possa fornecer uma visão direta para determinar os níveis de RA em várias amostras de tecidos, ele também pode ser aplicado a outros estudos, como determinar a presença ou ausência de enzimas metabólicas de RA por meio do monitoramento de alterações nos níveis de RA. Antes de iniciar qualquer experimento, teste a resposta das células F9 RARE-LacZ ao RA. Adicione um nanomolar de RA all-trans a células F9 RARE-LacZ cultivadas em uma placa de 96 poços.Em seguida, incube a placa e cultive a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, realize a coloração com LacZ e verifique a presença de um precipitado azul nas células. Se a coloração não for uniforme em todo o citoplasma celular, prossiga para subclonar as células.Divida as culturas selecionadas em placas de 10 centímetros com 100.000 células por 10 mililitros. Após dois dias de cultivo, prepare uma placa de 24 poços com 500 microlitros de gelatina 0,2% por poço e deixe a placa em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova a gelatina e lave os poços duas vezes com 500 microlitros de água destilada.Agora, adicione 500 microlitros de meio de cultura F9 RARE-LacZ aos poços. Em seguida, selecione colônias de células F9 utilizando uma ponteira estéril P10 e transfira cada uma para um poço. Após três ou quatro dias de cultivo, divida as colônias em duas placas de 24 poços revestidas com gelatina, uma para testes e a outra para expansão.Após mais dois dias de cultivo, adicione um nanomolar de RA a cada poço de uma placa de 24 poços e cultive-a durante a noite. No dia seguinte, realize uma coloração com LacZ para testar os respondentes altos e expanda o cultivo correspondente. Um dia antes de colher os embriões E8.5 ou dissociar os neuroesferas, recubra uma placa de 96 poços com 100 microlitros de gelatina 0,2% por poço e deixe a placa em repouso por 30 minutos.Em seguida, aspire a gelatina e enxágue os poços duas vezes com 200 microlitros de água destilada. A seguir, faça a tripsinização das células F9 RARE-LacZ selecionadas mantidas em placas de 10 centímetros. Então, plaque 100.000 células em cada poço de uma placa de 96 poços utilizando meio de cultura sem G418.Carregue um número suficiente de poços para co-cultivar cada embrião, ou prepare três poços por genótipo se estiver trabalhando com neuroesferas. Prepare também 24 poços para a curva padrão. Em seguida, incube a placa por 24 horas.Para o cultivo conjunto de células embrionárias, inicie a dissecação de embriões E8,5. Em seguida, adicione um novo tubo de 1,5 mililitro com 10 microlitros de tripsina e, utilizando uma ponteira P20 de orifício alargado, transfira o embrião inteiro para o tubo e coloque o tubo no gelo. Após todos os embriões terem sido isolados, incube todos os tubos a 37 graus Celsius por cinco minutos para dissociar os tecidos.Após cinco minutos, triture suavemente o conteúdo de cada tubo usando uma ponteira P20 e transfira 10 microlitros para um poço da placa de 96 poços preparada com células F9 RARE-LacZ. Incube a placa durante a noite. Para co-cultivos de neuroesferas, comece transferindo um cultivo de neuroesferas para tubos de 15 mililitros.Centrifugue os tubos a 200 g por 10 minutos e remova todo o sobrenadante, exceto um mililitro. Em seguida, triture o conteúdo com uma pipeta P1000. Agora, use um pequeno volume para determinar a densidade das células dissociadas.Em seguida, plaque 100.000 células de neuroesferas dissociadas sobre as células F9 RARE-LacZ. Distribua três poços para cada tipo de cultura de neuroesfera. Agora, certifique-se de preparar os poços para a curva padrão.Em triplicata, adicione 100 microlitros de soluções de RA todo-trans preparadas por diluição seriada em sete concentrações diferentes em meio de cultura F9 RARE-LacZ. Inclua controles negativos de células não tratadas. Por fim, cultive a placa de 96 poços completamente carregada durante a noite.No dia seguinte, remova o meio e fixe as culturas utilizando 100 microlitros de glutaraldeído 2,5% por poço. Deixe a placa em incubação à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, remova o fixador e lave os poços duas vezes com 200 microlitros de PBS, durante 10 minutos por lavagem.Em seguida, lave as cavidades três vezes com 200 microlitros de solução de lavagem LacZ durante 10 minutos por lavagem. Durante a terceira lavagem, prepare a solução de coloração X-gal em um tubo de 15 mililitros envolto em papel alumínio. Além disso, prepare uma câmara umidificada para a placa de 96 poços.Agora, adicione 200 microlitros da solução de coloração X-gal a cada poço. Coloque a placa dentro da câmara umidificada e incube a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova a solução de coloração LacZ e substitua por 200 microlitros de PBS.Em seguida, meça a absorbância a 610 nanômetros e image a placa. A linhagem celular repórter F9 RARE-LacZ é composta por células de carcinoma embrionário aderentes que respondem quantitativamente ao ácido retinóico com uma indução proporcional da beta-galactosidase. Elas também possuem uma morfologia epitelial.Apesar do cultivo com seleção por G418, a resposta dessas células ao RA enfraquecerá após várias passagens. Assim, subclonagens periódicas são necessárias para garantir células respondentes fortes e uniformes ao RA. Espera-se que embriões E8.5 homozigóticos para a mutação vl em Gpr161 apresentem sinalização embrionária de RA reduzida. Utilizando o ensaio de co-cultivo descrito, com embriões dissociados e células F9 RARE-LacZ, essa expectativa foi confirmada.O co-cultivo de neuroesferas derivadas de adultos selvagens com células F9 RARE-LacZ também foi utilizado para testar a presença de RA nas culturas de neuroesferas. O aumento da coloração, em comparação com as células do estágio E8.5, pode ser devido à homogeneidade das culturas de neuroesferas. Ao gerar uma curva padrão para os níveis de RA, o nível de RA foi quantificável nas culturas de neuroesferas selvagens e nos embriões E8.5.Ao realizar este procedimento, lembre-se de manter, por meio de subclonagens periódicas, células F9 RARE-LacZ que respondam fortemente ao RA. Além disso, certifique-se de dissociar completamente sua amostra para facilitar a distribuição homogênea e a medição consistente de RA. Após este procedimento, os efeitos de mutações genéticas nos níveis de RA podem ser investigados, e outros métodos podem então ser realizados para investigar quais componentes da via de sinalização de RA são diretamente afetados.

quantitative-measurement-relative-retinoic-acid-levels-e85-embryos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve uma maneira simples e barata para quantificar a atividade de cis-regulatórias elementos (ie, enhancer / promotores) na vida retinas do mouse via eletroporação explante. Preparação de DNA, a dissecção da retina, eletroporação, a cultura de explantes de retina, e pós-fixação análise e quantificação são descritos.

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Este vídeo demonstra uma técnica simples para neurogênese induzida por ácido retinóico em células de carcinoma embrionário de camundongo P19. O ácido retinóico ativa fatores de transcrição e desencadeia a expressão gênica para diferenciação neuronal.

Neurogênese induzida por ácido retinóico usando células de carcinoma embrionário de camundongo

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a atividade do ácido retinóico em embriões de camundongos. Ao isolar as células dos embriões de camundongo, as células são co-cultivadas com células repórteres de ácido retinóico (RA). As células embrionárias produzem AR, que induz a expressão de beta-galactosidase nas células repórteres, indicando atividade de AR nas células embrionárias.

Empregando células repórter em uma co-cultura para estudar a produção de ácido retinóico por células embrionárias de camundongos

Este vídeo demonstra a medição da secreção de ácido retinóico (AR) de células da neuroesfera usando células repórter RA. Ele descreve as etapas envolvidas na co-cultura de células da neuroesfera com células repórter de AR e na realização de um ensaio colorimétrico de AR para medir os níveis de AR.

Medindo os níveis de ácido retinóico em neuroesferas usando uma linha celular repórter de ácido retinóico

Um método para quantificar o tamanho e forma orofacial de embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Neste protocolo, as medições de tamanho tradicional são combinados com morfometria geométrica para permitir análises mais sofisticadas de desenvolvimento orofacial e defeitos.

Quantificação de Orofacial nos fenótipos Xenopus

Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho experimental de como os intensificadores ativos podem ser identificados e validados experimentalmente.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

A eletrofisiologia é o padrão-ouro para investigar a atividade do canal iônico. No entanto, existem muitas abordagens alternativas, incluindo métodos ópticos. Aqui, descrevemos um método para monitorar a atividade da repetição rica em leucina contendo canais de ânions formados por 8 canais (LRRC8) usando um método baseado em transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre subunidades.

Monitoramento da atividade de 8 canais (LRRC8/VRAC) de repetição rica em leucina usando transferência de energia de ressonância de Förster de emissão sensibilizada (SE-FRET)

RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Aprenda a medir níveis de ácido retinóico em embriões E8.5 e neuroesferas usando ensaio reporter com células F9 RARE-LacZ. Este método sensível permite quantificar concentrações de RA em diversas amostras teciduais.

Medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em E8.5 embriões e neurosphere culturas Usando a F9 RARE-Lacz baseado em células de Ensaio Reporter (Vídeo) | JoVE Journal

Medição quantitativa de níveis relativos ácido retinóico em E8.5 embriões e neurosphere culturas Usando a F9 RARE-Lacz baseado em células de Ensaio Reporter

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