Name: Micropatterning e Montagem de microvasos 3D (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Aprenda a fabricar microvasos 3D por moldagem por injeção para estudar biologia vascular e fisiologia endotelial. Este método permite criar redes vasculares patentes com condições personalizáveis de fluxo e composição celular.

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Os autores gostariam de reconhecer a Lynn e Mike Garvey imagem Laboratório do Instituto de Células Estaminais e Medicina Regenerativa, bem como o Mecanismo de Washington Nanofabricação da Universidade de Washington. Eles também agradecem o apoio financeiro do Instituto Nacional de Saúde concede DP2DK102258 (para YZ) e formação concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).

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Os autores não têm nada para revelar.

Engineered microvasos são um modelo in vitro onde as características fisiológicas, tais como a geometria do lúmen, as forças hidrodinâmicas, e interacções multi-celulares estão presentes e sintonizável. Este tipo de plataforma é poderosa na medida em que oferece a capacidade para modelar e estudar o comportamento endotelial numa variedade de contextos em que as condições de cultura in vitro podem ser combinados com a do microambiente em questão. Por exemplo, os mecanismos de condução processos endoteli...

A microvasculatura em cada órgão ajuda a definir o microambiente tecido, manter a homeostase do tecido e regular a inflamação, a permeabilidade, a trombose, e fibrinólise 1,2. Endotélio microvascular, em particular, é a interface entre o fluxo de sangue e o tecido circundante e, por conseguinte, desempenha um papel crítico na modulação da função do órgão e vascular em resposta a estímulos, tais como as forças hidrodinâmicas e citoquinas e hormonas circulantes 3 ​​- 5. Compreendendo as interacções específicas entre o endotélio, o sangue, e o microambiente circundante do tecido é importante para o estudo da biologia vascular e a progressão da doença. No entanto, o progresso em estudar essas interações tem sido dificultada pela limitação em ferramentas in vitro que não recapitulam na estrutura microvascular vivo e função 6,7. Como resultado, o campo e avanço terapêutico tem se baseou fortemente em caro e tempo-consumir modelos animais, que muitas vezes não conseguem traduzir para o sucesso em seres humanos 8 - 10. Enquanto modelos in vivo são de valor inestimável no estudo dos mecanismos da doença e funções vasculares, eles são complexos e muitas vezes não têm controle preciso do indivíduo celulares, bioquímicos e biofísicos pistas. Vasculatura por todo o corpo possui uma estrutura hierárquica madura em conjunto com leitos capilares expansivas, proporcionando perfusão otimizado e transporte de nutrientes simultaneamente 11. Inicialmente, as formas vasculatura como um plexo primitiva, que reorganiza a uma rede hierarquicamente ramificada durante o desenvolvimento precoce 12,13. Embora muitos dos sinais envolvidos nestes processos são bem compreendidos 14-16, permanece elusiva como tal modelação vascular é determinada 15. Por sua vez, recapitulando este processo in vitro para projetar redes vasculares organizados tem a abelhan. Muitas in vitro plataformas difíceis existentes para modelar vasculatura, tais como culturas de células endoteliais duas dimensões, não têm características importantes, tais como a proximidade de multi-celular, três luminal geometria dimensional, fluxo, e a matriz extracelular. Tubo de ensaios de formação em hidrogéis 3D (colágeno ou fibrina) 17 - 19 ou invasão ensaios 20,21 têm sido utilizados para estudar a função endotelial em 3D e suas interações com outros vasculares 17,22 ou de células do tecido tipos 23. No entanto, montados em lúmens estes ensaios não têm interconectividade, fluxo hemodinâmico, e perfusão adequada. Além disso, a propensão para a regressão vascular nestes ensaios de formação de tubo 24 evita a cultura a longo prazo e a maturação o que limita o grau de estudos funcionais que podem ser executadas. Assim, há uma necessidade crescente de engenheiro em plataformas in vitro de redes microvasculares que podem modelar adequadamente enendotelial características e são capazes de cultura a longo prazo. Uma variedade de técnicas de engenharia vasculares têm surgido ao longo dos anos para aplicações médicas para substituir ou vasos de bypass afetados em pacientes com doença vascular. Vasos de grande diâmetro feitas de materiais sintéticos, tais como tereftalato de polietileno (PET), e politetrafluoroetileno (ePTFE) tiveram sucesso terapêutico considerável com permeabilidade longo prazo (média desobstrução de 95% mais de 5 anos) 25. Apesar de pequeno diâmetro enxertos sintéticos (&lt;6 mm) geralmente enfrentam complicações como a hiperplasia da íntima e trombopoiese 26 - 28, da engenharia de tecidos enxertos de pequeno diâmetro feitos com material biológico fizeram progressos significativos 29,30. Apesar dos avanços desse tipo, vasos de engenharia em microescala mantiveram-se um desafio. Para modelar adequadamente a microcirculação, é necessário para gerar padrões de rede complexos com sufficiente de resistência mecânica para manter a desobstrução, e com uma composição da matriz que permite tanto a permeação de nutrientes para as células parenquimatosas e remodelação celular. Este protocolo apresenta um romance rede de vasos perfusable artificial que imita um nativo in vivo configuração com um ajustável e controlável microambiente 31-34. O método descrito gera microvasos artificiais, com diâmetros na ordem de 100 um. microvasos engenharia são fabricados por perfusão células endoteliais através de um canal microfluídico que está incorporado dentro do tipo macio I colágeno hidrogel. Este sistema tem a capacidade de gerar redes estampados com estrutura luminal aberta, replicar interações multi-celulares, modular a composição da matriz extracelular, e aplicar forças hemodinâmicas fisiologicamente relevantes.

<table><tbody><tr><td><forte>Fabricação de Wafer</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Plasma AutoGlow</td><td>AutoGlow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Headway Spin Coater</td><td>Headway Research, Inc&nbsp;</td><td>PWM32 Revestidor de Rotação</td><td></td></tr><tr><td>Alinhador de contato ABM</td><td>AB-M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Step Profilometer</td><td>Tencor</td><td>Alpha Step 200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Desenvolvedor</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Resist</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>8" wafer</td><td>de silício Wafer World Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gerador de Micro Padrão de Mesa</td><td>Heidelberg Instruments</td><td>&mu; PG 101</td><td>Para geração de fotomáscara</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>VWR</td><td>97042-646</td><td></td></tr><tr><td>Álcool ispropílico</td><td>Avantor Performance Materials</td><td>9088</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (120 x 120 mm, quadradas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z617679</td><td></td></tr><tr><td>Tricloro(3,3,3-trifluoropropil)silano</td> Base de elastômero <td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBG3805V</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Misturado a 10:1 (p/p)</td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Forno Sigma-Aldrich</td><td>Z119024-1EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>9120976</td><td></td></tr><tr><td><forte>Fabricação e cultura de dispositivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poli(metacrilato de metila) (PMMA)</td><td>Plexiglas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corona Treater</td><td>Produtos Electro-Technic, Inc.</td><td>BD-20</td><td>Dispositivo portátil para tratamento de plasma de dispositivos PMMA e moldes PDMS</td></tr><tr><td>Ferro de Solda</td><td>Weller&nbsp;</td><td>Parafuso de</td> Máquina Ranurado de Cabeça de Truss de Aço Inoxidável WTCPS <td></td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>91785A096</td><td></td></tr><tr><td>Pinos de aço inoxidável</td><td>McMaster-Carr&nbsp;</td><td>93600A060</td><td></td></tr><tr><td>Pinças&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>24-572</td><td>Qualquer pinça semelhante pode ser usada</td></tr><tr><td>Espátula (Micro Colher)</td><td>Serviços de Microscopia Eletrônica</td><td>62410-01</td><td></td></tr><tr><td>Chave</td><td></td><td></td> de fenda <td>Qualquer chave de fenda de cabeça chata pode ser usada, autoclavada</td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>Clorox</td><td>4460030966 placas de</td><td></td></tr><tr><td>Petri (150 x 25 mm)</td><td>Corning</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri (100 x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>2909</td><td></td></tr><tr><td>Algodão, cortado em pedaços</td><td></td><td></td> de 1 cm x 3 cm Polietilenoimina <td>autoclavada</td></tr><tr><td>(PEI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td>Diluir a 1% em água de grau de cultura de células</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Diluir a 0,1% em água</td></tr> <tr><td>de grau de cultura de célulasEsterilizado H2O</td><td></td><td></td><td>DI autoclavado H2O</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I, dissolvido em ácido</td><td></td><td></td> acético a 0,1% <td>Isolado de caudas de rato conforme descrito em Rajan et. al. 2006 (ref #37)</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 ml</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 30 ml</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>M199 10x Media&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>1 N NaOH (estéril)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>Diluir para 1 N em água de grau de cultura de células</td></tr><tr><td>HUVECs</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meios de crescimento endotelial</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>Thermofisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano de Leuconostoc spp. (70&nbsp; kDa)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Hausser Scientific Co.</td><td>3200</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de carregamento de gel</td><td>VWR</td><td>37001-152</td><td></td></tr><tr><td>18 G Agulha de enchimento sem corte</td><td>BD&nbsp;</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 G Agulha de Dispensação de Aço Inoxidável</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A123</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 1/32" ID, Tubulação de Silício OD 3/32"</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-00</td><td></td></tr><tr><td>Acoplamento Tubo-a-tubo de 1/16"</td><td>McMaster-Carr</td><td>5116K165</td><td></td></tr><tr><td>90&deg; Conectores de Cotovelo, Tubo-a-Tubo</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K901</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Coupling (Fêmea, 1/16" ID)</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K211</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps de Plástico, com Garras de Mandíbula Serviços de</td><td>Microscopia Eletrônica</td><td>72971</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Seringa Dupla</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Poliestireno Tubo de fundo redondo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>Device Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-hCD31</td><td>Abcam</td><td>ab32457</td><td>diluição</td></tr> <tr><td>de trabalho 1:25Anticorpo conjugado FITC anti-von Willebrand Factor</td><td>Abcam</td><td>ab8822</td><td>1:100 anticorpo</td></tr><tr><td>secundário anti-coelho 568 de cabra</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A-11011</td><td>1:100 diluição de trabalho</td></tr><tr><td>Hoescht</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Ressuspenso em DMSO</td></tr><tr><td>Cacodilato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Para fazer tampão de cacodilato de 0,2 M</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR International</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>40 kDa Dextran conjugado com FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><reagentes de cultura fortes>adicionais&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chem</td><td>S2924</td><td>Inibidor de GSK-3 de molécula pequena</td></tr><tr><td>VEGF recombinante humano</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>bFGF recombinante humano</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterning e montagem de microvasos 3d

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels 

Em plataformas in vitro para estudar as células endoteliais e biologia vascular são largamente limitadas à cultura de células endoteliais 2D, câmaras de fluxo com o polímero ou com base substratos de vidro, e ensaios de formação de tubos à base de hidrogel. Estes ensaios, enquanto informativo, não recapitular geometria luz, matriz extracelular adequada, e proximidade multi-celular, que desempenham um papel-chave na modulação da função vascular. Este manuscrito descreve um método de moldagem por injeção para gerar vasos artificiais, com diâmetros da ordem de 100 mm. Microvasos são fabricados semeando células endoteliais em um canal microfluídico incorporado dentro de um tipo nativo I colágeno hidrogel. Ao incorporar nas células do parênquima dentro da matriz de colagénio antes da formação de canal, microambientes específicos de tecido podem ser modelados e estudados. modulações adicionais de propriedades e meios de comunicação hidrodinâmico composição permitir o controlo da função vascular complexa dentro do microambiente desejado.Essa plataforma permite o estudo de recrutamento perivascular de células, as interacções do sangue do endotélio, a resposta de fluxo, e as interacções de tecidos-microvascular. microvasos Engineered oferecer a capacidade de isolar a influência de componentes individuais de um nicho vascular e controlar com precisão as suas químicas, mecânicas e propriedades biológicas para estudar a biologia vascular na saúde e na doença.

O navio-plataforma projetada cria microvasculatura funcional incorporado dentro de um tipo natural de colágeno I matriz e permite um controlo apertado do ambiente celular, biofísicos e bioquímicos in vitro. Para fabricar microvasos modificadas, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) são perfundidos através da rede microfluídicos embebidos em colágeno onde se fixam para formar um lúmen de patentes e endotélio confluentes. Como ilustrado na Figura 1A-C,</...

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

O objetivo geral do uso de microvasos projetados é replicar a estrutura e a função dos vasos no organismo para estudar a fisiologia vascular em estados normais e patológicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia vascular, como a forma pela qual diferentes células anatômicas respondem ao fluxo, como elas influenciam a função tecidual e como as doenças vasculares se iniciam e progridem ao longo do tempo. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser facilmente modificada para imitar diferentes sistemas orgânicos e estados patológicos.Isso pode ser feito alterando os tipos celulares, a composição da matriz e do meio, e outras variáveis. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades até se familiarizarem com os erros comuns que podem levar à baixa qualidade dos vasos. A demonstração visual deste método é essencial, pois existem várias técnicas importantes para a fabricação bem-sucedida nas etapas de moldagem por injeção e montagem.Para este procedimento, prepare previamente os moldes de PDMS planos e microestruturados e as peças de alojamento de PMMA. Uma descrição de como fabricar essas peças é fornecida no protocolo textual. Autoclave os moldes de PDMS juntamente com os parafusos, pinos, pinças e uma espátula.Não autoclave as peças de PMMA. Elas devem ser esterilizadas com água sanitária sob uma capela. Após deixar as peças de PMMA de molho em água sanitária por pelo menos uma hora, enxágue a água sanitária com água autoclavada duas vezes.Em seguida, coloque as peças em recipientes estéreis. Aspire a água em excesso e deixe secar ao ar. Com tudo limpo, inicie o protocolo tratando as cavidades internas das peças de PMMA superior e inferior com um tratador de plasma portátil por aproximadamente um minuto.Desligue a luz para ajudar a visualizar a cobertura do tratamento com plasma. Em seguida, adicione 1% de PEI nos poços internos. Se o PEI não se espalhar facilmente, aumente o tempo de tratamento com plasma.Após deixar o PEI reagir por 10 minutos, remova a solução e enxágue os dispositivos com água estéril, deixando-os secar ao ar. Uma vez secos, aplique glutaraldeído 0,1% nas superfícies tratadas e deixe o glutaraldeído reagir por meia hora. Em seguida, enxágue as peças duas vezes com água estéril e deixe-as secar ao ar.Agora, prepare uma solução fresca de colágeno neutralizado a 0,75% para a fabricação do vaso, combinando o volume de colágeno estocado previamente com a solução de neutralização contendo meio e hidróxido de sódio. Agite lentamente e com cuidado usando uma espátula até que a solução fique homogênea e com coloração alaranjada. Em seguida, se necessário, adicione as células na concentração desejada e continue agitando a solução até que as células estejam uniformemente distribuídas.Em preparação para o processo de montagem, coloque o molde de PDMS com micropadrão em uma placa de 100 por 20 milímetros e trate o molde com plasma por um minuto. Em seguida, alinhe a peça superior de PMMA sobre o PDMS de modo que os reservatórios quadrados fiquem alinhados com os reservatórios de entrada e saída. Depois, insira pinos de aço inoxidável nos orifícios dos reservatórios de entrada e saída para que permaneçam abertos após a injeção de colágeno.Agora, carregue a mistura de colágeno e células em uma seringa de um mililitro sem introduzir bolhas de ar. Em seguida, usando pinças, pressione suavemente a peça superior de PMMA para fixá-la ao molde de PDMS e injete lentamente cerca de meio mililitro da mistura de colágeno e células na porta de injeção. O colágeno deve preencher a área de 20 por 20 milímetros sobre o molde e não deve vazar.Em seguida, feche cuidadosamente a placa sem sacudir os pinos de fixação. Depois, coloque na peça inferior de PMMA uma lamínula de vidro de 22 milímetros quadrados no poço interno. Então, distribua cerca de 0,25 mililitros de colágeno uniformemente sobre o vidro.Complete a metade inferior abaixando suavemente o PDMS plano para dentro do colágeno, de modo que fique plano contra o PMMA, sem bolhas de ar entre eles. Agora, coloque cuidadosamente ambas as metades do dispositivo em uma incubadora a 37 graus Celsius e deixe a solução de colágeno gelificar por 30 minutos antes de prosseguir. Após a gelificação, adicione quantidade suficiente de PBS para envolver o PDMS na peça inferior.Em seguida, use pin&ccedil;as para remover qualquer col&aacute;geno em excesso ao redor das bordas e desprenda lentamente o peda&ccedil;o plano de PDMS, mantendo o col&aacute;geno hidratado com PBS. Para preparar a pe&ccedil;a superior, use pin&ccedil;as para levantar o conjunto de PMMA e PDMS e vire-o. Em seguida, adicione algumas gotas de PBS &agrave; face interna e remova o molde de PDMS da pe&ccedil;a superior de PMMA, desprezando-o rapidamente e com firmeza.Em seguida, com um segundo par de pinças, remova cuidadosamente os pinos do outro lado da carcaça de PMMA. Certifique-se de que a entrada e a saída estejam livres de excesso de colágeno movendo os pinos para cima e para baixo antes da remoção. Se os pinos saírem por conta própria, basta usar outro pino estéril para garantir que a entrada e a saída estejam desobstruídas.Em seguida, adicione mais PBS sobre a colágeno com microestrutura, vire a peça, e insira os parafusos nos quatro orifícios dos cantos. Agora, posicione suavemente a peça superior sobre a inferior, alinhando os parafusos com os orifícios. Não permita que as duas peças deslizem uma sobre a outra.Em seguida, rosqueie suavemente as peças juntas usando uma espátula e um toque leve para que não fiquem superapertadas. É fundamental ser delicado e preciso durante a montagem. Ao aplicar uma quantidade generosa de PBS, a fricção entre as faces internas é reduzida.Ao apertar os parafusos, prossiga lentamente e pare imediatamente ao sentir qualquer resistência. Em seguida, aspire o PBS ao redor das superfícies de PMMA e coloque um pequeno pedaço de algodão sob uma borda do dispositivo. Depois, aspire qualquer PBS dos reservatórios.Agora, reabasteça os reservatórios com meio de cultura celular e incube o dispositivo por pelo menos uma hora para a gelificação. Uma vez que o dispositivo esteja montado, utilize uma suspensão de células endoteliais a 10 milhões de células por mililitro para semear o dispositivo. Remova o meio dos reservatórios de entrada e saída e, com uma pipeta de 20 microlitros com ponteiras para carregamento de géis, adicione 10 microlitros da suspensão celular ao centro do reservatório de entrada.As células fluirão imediatamente para dentro e revestirão a rede. Uma vez que as células tenham preenchido a rede e o fluxo tenha equilibrado, adicione 150 microlitros de meio em ambos os reservatórios. Em seguida, incube o dispositivo por uma hora ou mais para que as células possam se espalhar e aderir.Para culturas de longo prazo, remova o meio a cada 12 horas e adicione novamente 150 microlitros de meio fresco ao reservatório de entrada e 50 microlitros ao reservatório de saída. Após 24 horas de cultivo, uma bomba de seringa pode ser utilizada para estabelecer condições de fluxo contínuo. Após levar os materiais para a cabine de biossegurança, remova os tubos das bolsas de autoclave e coloque-os em uma placa. Em seguida, prepare um recipiente de fluxo estéril derretendo os orifícios laterais e, depois, passando o tubo através deles. Prepare uma seringa de 10 mililitros com meio de cultura contendo 3,5% de Dextran. Em seguida, acople a seringa cheia ao conector tipo luer lock na extremidade do tubo de entrada.Em seguida, fixe a seringa à bomba e perfunda o meio até que todas as bolhas de ar aprisionadas tenham saído do tubo. Uma vez que o tubo esteja cheio de meio e livre de bolhas, transfira o dispositivo para um novo recipiente e insira a junta do conector de entrada na entrada da carcaça. Em seguida, ajuste a bomba de seringa à taxa de fluxo desejada e inicie a perfusão.Prepare a saída preenchendo o tubo com meio de cultura celular usando uma agulha de 18 gauge e uma seringa de um mililitro. Prenda-o com um grampo e remova a agulha. Em seguida, derreta um orifício na tampa do tubo coletor de saída usando uma solda elétrica.Em seguida, adicione meio ao tubo de coleta, insira o tubo e fixe a junção do conector na saída do alojamento. Durante todo este processo, utiliza-se um grampo para reter o meio no tubo. Após a conclusão, transfira todo o conjunto para uma incubadora.Dependendo das condições experimentais, a seringa pode precisar ser reabastecida após 24 a 36 horas. Durante a substituição da seringa, certifique-se de que bolhas não sejam introduzidas no tubo. Células endoteliais de veia umbilical humana foram perfundidas através da rede microfluídica com colágeno incorporado para formar um lúmen pérvio e um endotélio confluente.Várias geometrias de vaso foram utilizadas para estabelecer diferentes condições de fluxo. Condições de cultivo com fluxo contínuo foram usadas para aplicar estresse cisalhante constante sobre o endotélio. Dispositivos cultivados sob condições de fluxo impulsionado pela gravidade também mantiveram viabilidade e perviedade a longo prazo.Uma característica crítica desses microvasos é a sua capacidade de responder a estímulos inflamatórios. Isso foi investigado perfundindo os microvasos com sangue total. Microvasos não estimulados continham endotélio não ativado e permaneceram quiescentes.Microvasos estimulados tornaram-se ativados e sua resposta iniciou a formação de trombos. Outra aplicação interessante do sistema é estudar alterações fenotípicas na vasculatura formada a partir de diferentes populações de células endoteliais. Por exemplo, microvasos formados a partir de populações únicas de células-tronco exibiram diferentes capacidades de brotamento angiogênico.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar microvasos e utilizá-los para estudar a biologia vascular e construir sistemas de órgãos modelo complexos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a prática melhora a taxa de formação bem-sucedida de vasos e permite resultados mais consistentes. Uma vez dominado, vários dispositivos podem ser produzidos em três a quatro horas.Após este procedimento, outros métodos como a perfusão de sangue total, Dextran ou tratamentos farmacêuticos podem ser realizados para avaliar a quiescência endotelial, permeabilidade, resposta ao fármaco e a morfologia geral de células e vasos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

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Microfabricação de Chip porte Andaimes para tridimensional de cultivo celular

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Processo de fabricação de microestruturas tridimensionais usando vaporização de um componente sacrificial

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Dispositivo micro centrífuga baseada capilar para a Formação tamanho controlável de Monodisperse microgotas

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guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

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Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

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