Name: Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a criar matrizes cardíacas neonatais a partir de tecido murino para estudos de cardiologia regenerativa. Este método permite investigar interações célula-matriz e as propriedades únicas da matriz extracelular neonatal.

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Os autores agradecem à Sra. Cynthia DeKay pela preparação das figuras.

Todas as experiências de rato foram realizados de acordo com o Animal Welfare Act dos EUA e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Minnesota. 1. Método para coração mouse Isolamento <ol><li> Euthanize um rato neonatal por decapitação com uma única lâmina de uso. </li><li> Pincelar o tórax com 70% de etanol. </li><li> Dissecar a pele do peito, cortando-o afastado da parede torácica com uma tesoura padrão enquanto puxa a pele lateralmente com um par de # 5 fórceps. </li><li> Perfurar o abdômen logo abaixo do esterno com a tesoura de corte através da parede abdominal. Agarrando o processo xifóide com # 5 fórceps, retrair o esterno rostral a partir do corpo durante o corte que as nervuras de ambos os lados da caixa com a tesoura. A caixa torácica é refletida superiormente com a pinça para revelar o coração. </li><li> Sem rodeios dissecar os dois principais lóbulos do timo puxando lateralmente com # 5 fórceps, expondoo arco da aorta, bem como as veias cavas e pulmonares. </li><li> Transecto as principais artérias do arco aórtico e da própria aorta, com a tesoura primavera 10 cm. Reter a aorta entre a base do coração e a artéria inominada. Segure as extremidades dos vasos rompidos com o # 5 fórceps para refletir o coração para a frente, separando-a da traquéia e esôfago. </li><li> Transecto a vasculatura pulmonar e outras veias principais, através do corte entre os pulmões e o coração em ambos os lados do coração com a tesoura de mola 10 cm. As veias permanecer aberta para fornecer drenagem. </li><li> Tiraram o coração do mediastino com o # 5 fórceps, segurando as extremidades cortadas dos grandes vasos. Colocar o coração num prato de cultura de 60 mm contendo solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para a cateterização. </li></ol> 2. Método para Decelularização por Langendorff Perfusão <ol><li> Prepare o conjunto de cateter com antecedência. Desenhar uma secção 4 centímetrosde PE 50 tubos em uma pequena chama de álcool para criar um cateter menores, mais finos. Aparar as extremidades com uma lâmina para satisfazer as dimensões (aprox. OD 300 mm de diâmetro exterior com uma flange de aprox. OD 500 mm) mostrado na Figura 1. Isto irá proporcionar dois cateteres simétricos de ambos os lados do puxar. </li><li> O ponto final do corte do tubo para dentro da chama brevemente, para derreter uma flange para a abertura na extremidade mais fina. </li><li> Encher a seringa de 12 ml com PBS e montar o cateter, colocando uma torneira de passagem de 3 vias em a seringa. Adicionar um 22 G x 1 agulha para a torneira e conduzir a agulha através do septo. Deslize o tubo do cateter PE arrastado para cima da agulha (fig. 1). </li><li> Lavar as peças montadas com PBS, assegurando que todas as bolhas de ar foram removidas. </li><li> Insira o cateter, preparado como descrito acima, para a aorta do coração isolado, não se estendendo para além da válvula aórtica e ligar com um empate de 7-0 sutura. Coloque o flange de tele cateter proximal contra o empate, fazendo um selo apertado e impedindo o coração de saindo do cateter. </li><li> Observe o cateterismo sob ampliação, enquanto suavemente perfusão do coração utilizando a seringa contendo PBS. Certifique-se de que não há vazamentos no sistema e o tecido homogeneamente empalidece como sangue latente é removido. </li><li> Colocar o septo para dentro do gargalo do adaptador para entrada e selá-lo, dobrando os lados sobre o vidro. </li><li> Anexar o reservatório cheio com 60 ml de sulfato de dodecilo de sódio a 1% (SDS) em água destilada (dH2O) através de uma linha de comprimento suficiente para produzir uma coluna que gera 20 mmHg de pressão, como mostrado na Fig. 1. Calcula-se a pressão da altura da coluna de líquido com base na relação de 1 mm Hg é igual a 1,3595 centímetros H 2 O. Cuidado: SDS é um pó altamente flocculent com propriedades irritantes. O contacto deve ser evitado. Lidar com o pó usando vestuário de protecção adequado. </li><li> Perfundir o coração com 1% SDS, durante 14 horas. O coração será translúcido na aparência sem tecido restante observável. </li><li> Lave o sistema até a torneira da solução SDS restante e substituí-lo com 10 ml dH 2 O. Perfundir o coração com 10 ml de 1% de Triton X-100 (diluídos em água destilada), seguido de 10 ml de dH 2 O, seguido por 60 ml de PBS contendo 1x penicilina estreptomicina (Pen-Strep). </li><li> Armazenar o coração em PBS 1x com Pen-Strep a 4 ° C. Se a aplicação de pós descelularização destina a perfusão requer, então, deve ser mantido o cateter na aorta, de outra forma reduzir o laço de sutura e o remover do cateter. </li></ol> Determinação 3. DNA <ol><li> Prepara-se uma digestão de ECM o coração ou o controlo descelularizado utilizando 200 ug / ml de proteinase K em KCl 50 mM, MgCl2 2,5 mM, 0,45% de Tween 20 em 10 mM de Tris (pH 8,3). </li><li> Incubar o tecido a 55 ° C com agitação até que o tecido é dissolvido,tipicamente 4-5 h. </li><li> Quantificar o teor de ADN do homogeneizado com um ADN de ensaio de ligação de 4,11. </li></ol> 4. Fixação e secção de tecido <ol><li> Fix descelularizados, corações repovoados ou P3 controlo em paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar o tecido 3x em PBS. </li><li> Colocar o tecido numa solução de 7,5% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M a 4 ° C até que se afunda. </li><li> Mudar a solução a 15% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M a 4 ° C, novamente, até que se afunda. </li><li> Aquecer o tecido a 37 ° C, substituir metade do volume com solução de gelatina em 15% de sacarose e tampão de fosfato 0,1 M e equilibrar durante a noite. Concentrações de gelatina são aumentadas por passos através de 1%, 2,5%, 5% e, finalmente, 7,5%, duas vezes. </li><li> Coloque as amostras em cryomolds usando fresco gelatina 7,5%. Para restaurar o formato das amostras descelularizados, gelatina líquido pode ser perfundida para dentro das câmaras como tele corações são moldados. Congelar, flutuando os cryomolds em nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Cut (10 mm de espessura) seções com um criostato. Trazer o slide perto da superfície da seção e observe a seção de se mover para fora da faca na superfície devido à carga nos slides eletrostaticamente tratados. Secam-se as lâminas durante a noite e armazenar a -80 ° C para análise futura. </li><li> Retirar as lâminas do congelador, equilibrar à temperatura ambiente e, em seguida, colocar num frasco Coplin contendo PBS durante 20 min a 37 ° C para dissolver a gelatina. </li><li> Manchar as seções de corte a partir do Passo 4.7 com Hematoxilina e Eosina. Colocar as lâminas em um frasco Coplin. Expor as lâminas hidratados no passo 4.8 a hematoxilina durante 45 segundos, a água da torneira durante 1,5 min, tampão durante 3 min, a água da torneira durante 1 min, agente anil durante 1,5 min, 80% de etanol durante 1 min, alcoólica eosina Y durante 8 segundos, etanol a 80% durante 1 minuto, 100% de etanol durante 1 min 2x, agente de compensação (substituto de xileno) 3x durante 1 min, a lamela com resinameio de montagem com base. Examine os slides microscopicamente. </li><li> Para confirmar a retenção de reactividade proteína da MEC do ECM coração, mancha para proteínas estruturais de ECM tais como colagénio IV, colocando os diapositivos hidratadas numa câmara humidif içada e trata-se com 10% de soro de burro normal (NDS) em salino tamponado com fosfato com 0,1% de Triton -X100 (PBST) durante 1 h à temperatura ambiente (TA). Utilizar um volume suficiente para cobrir as secções de tecido. </li><li> Substituir a solução com o anticorpo primário de escolha para uma diluição determinada empiricamente em 5% NDS / PBST. Por exemplo, o anticorpo do colagénio IV foi diluído a 1: 150. Incubar durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavam-se as lâminas com PBST 3x e aplicar um anticorpo secundário de escolha conjugado com um corante fluorescente. Dilui-se o anticorpo por uma quantidade determinada empiricamente. Incubar durante 1 h à TA. Lavar 3x com PBS. </li><li> Corar as lâminas com um corante de ligação a ADN, tais como DAPI para verificar a ausência de núcleos celulares usando uma mounti contendo DAPIng médio quando a tampa deslizando os slides. </li><li> Examinar as lâminas com um microscópio de fluorescência a 50 a 400x. </li></ol> 5. P1 Neonatal Murino Ventricular Cardiomyocytes para Recellularization <ol><li> Spray de cada filhote com 70% de etanol e decapitar com uma única lâmina de uso. </li><li> Segure cada filhote entre o polegar eo indicador, enquanto o tórax é dividido na linha média com pequenas tesouras estéreis para expor a cavidade torácica. Aplicar pressão para permitir que o coração se projetam livremente do peito, enquanto ele é cortado livre dos grandes vasos e os átrios deixando apenas o tecido ventricular. </li><li> Colocar cada coração directamente para um tubo de 50 ml contendo 20 ml de cálcio arrefecido com gelo, solução salina tamponada de Hank livre de bicarbonato com 4- (2-hidroxietil) 20 mM -1-piperazinoetanossulfónico (CBFHH) até que todos os corações são recolhidos. </li><li> Aspirar o CBFHH e adicionar 10-15 ml de CBFHH fresca (gelada) para o tubo. Lavar o tecido por agitação do tecido em tele tubo várias vezes. </li><li> Decantar a solução contendo os corações em um 60 milímetros de plástico de Petri. </li><li> Dissecar qualquer tecido atrial latente dos corações sob ampliação no gelo aparando-lo longe dos corações com a tesoura primavera. Picar-se os ventrículos em pedaços pequenos tamanho homogéneo. Remover qualquer tecido não-ventricular separado do prato com # 5 fórceps. </li><li> Pipetar tanto da solução CBFHH como é necessário para transferir os fragmentos de tecido em um pequeno frasco esterilizado que contém uma barra de agitação micro estéril. </li><li> Permitir que o tecido para sedimentar para o fundo do frasco e remover a solução CBFHH. </li><li> Perfaz-se 50 ml de uma solução de enzima de 1,75 mg / ml de tripsina, 20 ug / ml de DNase II em CBFHH. Pipetar 5 ml desta solução de enzimas e adicioná-lo para um tubo contendo o tecido ventricular e picada lugar num agitador magnético. Agita-se a uma taxa constante (340 rpm) à temperatura ambiente durante 8 min. NOTA: A ação agitação deve ser suave e ainda permitirpara a suspensão da pasta. </li><li> Retirar o frasco da placa de agitação e permitir que a pasta fluida a sedimentar durante 3 min. Pipeta e descartar o sobrenadante inicial digerir, pois ele contém principalmente células do sangue e restos de tecido. </li><li> Pipetar uma segunda alíquota de 5 ml da solução de enzima e adicioná-lo ao ventrículo digestão. Agita-se durante 8 minutos e permitir que a sedimentar durante mais 3 min. Antes de iniciar as digestões, preparar dois tubos de 50 mL (rotulados 1 e 2), cada um contendo 12 ml de soro fetal de bovino gelada (FBS). Coloque um filtro de células 40 mm no topo de cada tubo. Pipet esse sobrenadante para o filtro no tubo 1. </li><li> Repetir o processo de digestão um adicional de 8 vezes, alternando-se a colocação do sobrenadante Digest entre os dois tubos contendo FBS. Dividir o último sobrenadante igualmente entre tubos 1 e 2 para garantir volumes iguais em cada tubo. NOTA: Cada tubo de recolha de agora irá conter 32,5 ml volume total de suspensão de células. </li><li> Centrifugar os tubos contêmção do sobrenadante a 150 xg durante 6 minutos a 4 ° C. </li><li> Durante a recolha das alíquotas de digestão, preparar cinco placas de cultura de tecidos de 100 mm com 6 ml de meio (de Eagle Modificado por Dulbecco meios (DMEM) com 10% FBS, 1x Pen-Strep, 1x L-glutamina) por placa. Incubar estas alíquotas a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 minutos para equilibrar os meios de comunicação. </li><li> Aspirar a mistura de enzimas CBFHH e ressuspender as células em 30 ml de meio de cultura preparado acima, combinando as células de ambos os tubos de recolha. </li><li> Retorno de 6 ml de suspensão celular a cada uma das placas de 100 mm e incubar durante 45 min a 37 ° C. </li><li> No final da incubação, transferir as células não aderentes a 5 novos pratos e re-incubar durante 45 minutos (a fracção de fibroblastos terá começado a aderir aos pratos e podem ser cultivadas separadamente, se desejado). </li><li> No final da segunda rodada de pré-chapeamento, recolher os meios de comunicação e as células não aderentes de pratos e girar os meios de comunicação em 150xg durante 6 min. </li><li> Colhem-se o excesso de meios para levar as células à concentração desejada aproximada, (4,0 x 10 5 células por construto em 100 ul de perfusato). Retirar uma alíquota para contagem e ou a viabilidade de testes 14. </li></ol> 6. biorreator Recellularization de P3 coração Matrix <ol><li> Pretreat a matriz de coração isolado com meios de cultura (ver Passo 5,15) durante a noite antes de adicionar as células. </li><li> Montar os elementos de um sistema de Langendorff, como mostrado na Fig. 2. Autoclave as peças de vidro e óxido de etileno esterilizar as peças de plástico para garantir a esterilidade. Vários sub-unidades do sistema pode ser montado numa câmara de fluxo laminar antes de ser montado no cavalete de suporte. Circulating banho de água e trajecto de escoamento de água aquecida foi omitida para maior clareza. </li><li> Encha o sistema montado com 120 ml de meio de cultura de tecidos (ver passo 5.15). </li><li> Colocar a matriz de coração cateterizada do Passo 2,14 em um cul 60 milímetrostura Prato sob ampliação e ligar uma seringa de 1 mL com 22 L x 1 agulha carregada com suspensão de células a partir do Passo 5,20 para o cateter. Certifique-se de que esta montagem é livre de bolhas de ar para evitar embolizante o coração. </li><li> Suavemente perfundir os 100 ul de suspensão de células no interior da matriz do coração através das artérias coronárias. Depois de concluído, retire a combinação seringa / agulha. NOTA: A perfusão lenta de aprox. 20? L por min é necessária para impedir que as células se escoe para fora das veias, que transitam pelo coração. </li><li> Com um topo romba 22g fixada ao encaixe de Luer sobre o lado de baixo da tampa frasco de biorreactor coração, empurrar o cateter para o topo. </li><li> Iniciar a bomba peristáltica e observa-se que o fluxo procede conforme descrito na Figura 2. Rendimentos fluir a partir do reservatório através da bomba através do borbulhador para o cateter colocado na aorta no Passo 2.5 (vermelho caminho na Fig. 2). Observar o fluxo da circulação cardíaca fora da veias e gotejamento a partir do vértice, para recirculação do reservatório meios. NOTA: A taxa de fluxo de perfusão é dependente de factores individuais, tais como a resistência vascular da construção, e o tamanho do coração, mas uma taxa de 50 a 100 ul / min é um bom ponto de partida. Em pontos de tempo intermédios, avaliação funcional pode ser executado. A escala de tamanho do coração repovoados neonatal limita as avaliações, o que pode ser realizado, mas nós determinamos que os sistemas baseados opticamente pode ser utilizado para quantificar a bater comportamento do mesmo modo que foram usadas em corações de ratos adultos. 4 A construção pode ser perfundido para estendida períodos de tempo (até 23 h). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A dependência desta técnica em perfusões repetidas do coração faz a prevenção de uma embolia um componente crítico de um bom resultado. A partir do cateterismo do coração inicial nos Passos 2,2-2,6, para as mudanças de solução entre as etapas 2.8-2.14, existem manipulações que podem permitir a introdução de bolhas de ar que comprometem o fluxo de perfusato no miocárdio. Devido ao tamanho diminuto do coração neonatal, mesmo minúsculas bolhas na vasculatura pode causar um enfarte técnica, tornando assim a descelularização...

A insuficiência cardíaca é comum e mortal. É uma doença progressiva que resulta na diminuição da contractilidade do coração, o que prejudica o fluxo sanguíneo para os órgãos e deixa as necessidades metabólicas do corpo não satisfeitas. Estima-se que 5,7 milhões de americanos têm insuficiência cardíaca e é a principal causa de hospitalização nos Estados Unidos 9. O custo coletivo de tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca nos Estados Unidos ultrapassa os US $ 300 bilhões de dólares por ano 9-10. O único tratamento definitivo para a insuficiência cardíaca em fase terminal é o transplante cardíaco ortotópico. Cada ano, estima-se que mais de 100.000 corações transplantados são necessários para os procedimentos de transplante cardíaco nos Estados Unidos 1-2. Devido ao número limitado de doadores, apenas cerca de 2.400 transplantes são realizados a cada ano em os EUA 2. Claramente, esta escassez de órgãos precisa ser tratada como outras estratégias são necessários para produzir órgãos adicionais para transplantação e, idealmente, estes órgãos seriam autóloga, de modo a evitar as complicações associadas com a rejeição e imunossupressão vida. Cardiomiócitos adultos mamíferos demonstrar uma capacidade de regeneração limitada após lesão, mas evidências recentes sugerem que os corações neonatais mamíferos manter uma notável capacidade de regeneração após lesão 5-8. Especificamente, após a ressecção cirúrgica parcial, uma janela de regeneração foi descoberto entre o dia do nascimento e pós-natal 7. Este período de regeneração é caracterizada por uma falta de cicatriz fibrótica, formação de neo vascularização, libertação de factores angiogénicos a partir do epicárdio, e proliferação de cardiomiócitos 8/5 , 11. Esta janela de tempo regenerativa fornece o potencial para a utilização do coração neonatal como uma nova fonte de material para o desenvolvimento de um coração bioartificial. A matriz extracelular é conhecida por fornecer pistas importantes para promover cardiomyocyte a proliferação e crescimento. Diferenças distintas na disponibilidade de moléculas nas matrizes neonatais e adultos de 12 e sua capacidade para promover a regeneração foram exploradas 13. matrizes adultos descelularizados têm sido utilizados em vários estudos para fornecer um andaime ECM para repovoamento celular e a geração de um coração bioartificial. Embora esses estudos, e novas descobertas em tecnologias de células-tronco, estão avançando rapidamente, vários obstáculos ainda precisam ser cumpridos. Por exemplo, as limitações em preservando a estrutura nativa da matriz, a integração celular na parede da matriz, e capacidade para suportar a proliferação e crescimento de todos os limites do sucesso desta abordagem. Enquanto atributos regenerativos superiores têm sido atribuídas ao coração neonatal, os aspectos práticos da utilização de um tecido tal têm limitado a sua exploração. Com base na capacidade regenerativa demonstrada do coração neonatal, desenvolvemos novas matrizes através do desenvolvimento de umtécnica de descelularização para o coração do rato P3. O coração P3 foi escolhido para estes estudos, uma vez que está dentro da janela de regeneração cardíaca como anteriormente determinada 6 mas o coração é suficientemente grande para colheita, decellularize e recellularize. O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da criação de uma matriz de um coração neonatal mouse. Os nossos estudos fornecem evidência para a viabilidade de um minuto descelularizante, coração neonatal, mantendo a integridade estrutural e proteinácea do ECM. Nós também demonstrar a capacidade de recellularize este ECM cardíaca com mCherry cardiomiócitos expressam e examinamos esses cardiomiócitos para a expressão de vários marcadores cardíacos seguintes recelularização. Esta tecnologia permitirá que para o ensaio da superioridade de uma matriz neonatal para o desenvolvimento de um coração bioartificial.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Materiais para isolamento do coração de camundongos</filhotes de</td></tr> <tr><td>camundongos strong>P1 (conforme mostrado; B6; D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>21577</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>60 mm Placa de cultura</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Tampão fosfato solução salina pH 7,4 (estéril)</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Lâmina de uso único</td><td>Stanley</td><td>28-510</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Tesoura padrão</td><td>Moria Bonn (Fine Science Tools)</td><td>14381-43</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Tesoura de mola 10 cm</td><td>Ferramentas de ciência fina</td><td>15024-10</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Tesoura de mola Vannas - Ferramentas de ciência fina de ponta de 3 mm</td><td></td><td>15000-00</td><td>ou equivalente</td></tr> <tr><td># 5 Fórceps</td><td>Dumnot (Ferramentas de ciência fina)</td> <td>11295-00</td><td>ou equivalente</td></tr> <tr><td colspan = "4 "><forte>2. Materiais para descelularização</forte></td></tr><tr><td>Adaptador de entrada</td><td>Chemglass</td><td>CG-1013</td><td>autoclavável</td></tr><tr><td>Septo</td><td>Chemglass</td><td>CG-3022-99</td><td>autoclavável</td></tr><tr><td>1/8 pol. ID x 3/8 OD C-Flex tubulação</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06422-10</td><td>autoclavável</td></tr><tr><td>Macho luer para adaptador de barb de mangueira de 1/8"</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K33</td><td>autoclavável</td></tr><tr><td>Female luer para adaptador de barb de mangueira de 1/8"</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K26</td><td>sutura</td></tr><tr><td>cirúrgica autoclavável Prolene 7-0&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>8648G</td><td>ou suporte de</td></tr><tr><td>anel</td> equivalente <td>Fisher Scientific</td><td>S47807</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Clamp</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-769-6Q</td><td>ou suporte</td></tr><tr><td>regular de clamp</td> equivalente <td>Fisher Scientific</td><td>05-754Q</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente 60 cc seringa barrel&nbsp;</td><td>Coviden</td><td>1186000777T</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Beaker</td><td>Kimble</td><td>14000250</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>22 G x 1 Seringa Agulha</td><td>BD</td><td></td><td>305155 ou equivalente</td></tr><tr><td>Seringa de 12 cc</td><td>Coviden</td><td>8881512878</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Torneira de parada de 3 vias</td><td>Smith Medical</td><td>MX5311L</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Tubo PE50</td><td>BD Clay Adams Intramedic</td><td>427411</td><td>Deve ser moldável pelo calor. Polietileno recomendado.</td></tr><tr><td>1% SDS</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>Grau ultrapuro recomendado. Prepare a solução fresca e esterilize com filtro antes de usar.</td></tr><tr><td>1% Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Prepare a solução fresca a partir de um estoque de 10% e filtre esterilize antes de usar.&nbsp;</td></tr><tr><td>Água purificada estéril dH2O</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td>Ou sistema MilliQ.</td></tr><tr><td>1x Caneta/Strep</td><td>Corning CellGro</td><td>30-001-Cl</td><td>ou equivalente &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">3. Materiais para quantificação de DNA</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Fisher</td><td>BP1700</td><td>>30 U/mg atividade</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente MgCl2&#183; 6H2O</td><td>Mallinckrodt</td><td>5958-04</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Tris base/cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503/T5941</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Pico-Green kit de ensaio dsDNA</td> Life <td>Technologies&nbsp;</td><td>P7589</td><td>requer fluorímetro para ler</td></tr><tr><td colspan="4">4. Método de fixação e secção de tecido</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>ou Gelatina equivalente</td></tr><tr><td>Tipo A de pele suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>deve ter 300 flores ou mais</td></tr><tr><td colspan="4">5. Método para histologia tecidual</td></tr><tr><td>Cryomolds 10 x 10 x 5 mm</td><td>Tissue-Tek</td><td>4565</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Hacker/</td><td>Bright Model OTF</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Lâminas de microscópio&nbsp; 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-19</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Hematoxilina 560&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801570</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Definir</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3803590</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Buffer azul&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3802915</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Alcoólico Eosina Y 515&nbsp;</td><td>Surgipath/Leica Selectech&nbsp;</td><td>3801615</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente Fórmula 83 Substituto do xileno&nbsp;</td><td>CBG Biotech&nbsp;</td><td>CH0104B</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium&nbsp;</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Anticorpo de colágeno IV</td><td>Rockland</td><td>600-401-106.1</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>&alfa;-Actinina</td><td>Anticorpo Abcam</td><td>AB9465</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>anticorpo mCherry</td><td>Abcam</td><td>AB205402</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>NKX2.5 Anticorpo Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>SC-8697</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Burro anti-rato AF488 Antibody</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Anticorpo Anti-frango Donkey AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>703-585-155&nbsp;</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-cabra CY5 para burros</td><td>Jackson Immunoresearch&nbsp;</td><td>705-175-147</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-587-003</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant com DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td colspan="4">6. Isolamento de cardiomiócitos ventriculares neonatais usando pré-plaqueamento</forte></td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg Free)</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Corning CellGro</td><td>25-060-Cl</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente tubo de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Primeria 100 mm placas</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>superfície Primeria melhora a fixação de fibroblastos promovendo uma maior pureza de miócitos</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Difco</td><td>215240</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8764</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Vitamina B12&nbsp;</td>Placas revestidas <td>com Fibronectina Sigma-Aldrich</td><td>V6629</td><td>ou</td></tr><tr><td>equivalente&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>354501</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>ou equivalente</td></tr><tr><td>Vidraria biorreator cardíaco</td><td>Tecnologia de vidro Radnoti</td><td>120101BEZ</td><td>Deve ser esterilizável por autoclavagem ou gás.</td></tr></tbody></table>

neonatal cardiac scaffolds: matrizes novas para estudos regenerativa

Neonatal Cardiac Scaffolds: Novel Matrices for Regenerative Studies

A única terapia definitiva para insuficiência cardíaca em estágio terminal é o transplante cardíaco ortotópico. A cada ano, estima-se que mais de 100.000 corações de doadores sejam necessários para procedimentos de transplante cardíaco nos Estados Unidos1-2. Devido ao número limitado de doadores, apenas aproximadamente 2.400 transplantes são realizados a cada ano nos EUA2. Inúmeras abordagens, desde estudos de terapia celular até a implantação de dispositivos de assistência mecânica, foram realizadas, isoladamente ou em combinação, na tentativa de persuadir o coração a se reparar ou descansar o coração com insuficiência3. Apesar desses esforços, os dispositivos de assistência ventricular ainda são amplamente utilizados com o objetivo de fazer a ponte para o transplante e a utilidade das terapias celulares, embora tenham alguma promessa curativa, ainda é limitada a ensaios clínicos. Além disso, o xenotransplante direto foi tentado, mas o sucesso foi limitado devido à rejeição imunológica. Claramente, outra estratégia é necessária para produzir órgãos adicionais para transplante e, idealmente, esses órgãos seriam autólogos para evitar as complicações associadas à rejeição e imunossupressão ao longo da vida. A descelularização é um processo de remoção de células residentes dos tecidos para expor a matriz extracelular nativa (MEC) ou andaime. A descelularização por perfusão oferece preservação completa da estrutura tridimensional do tecido, deixando intacta a maior parte das propriedades mecânicas do tecido4. Esses andaimes podem ser utilizados para repovoamento com células saudáveis para gerar modelos de pesquisa e, possivelmente, órgãos muito necessários para transplante. Expusemos os andaimes de camundongos neonatais (P3), conhecidos por reter notáveis capacidades regenerativas cardíacas,5-8 à descelularização mediada por detergente e repovoamos esses andaimes com células cardíacas murinas. Esses estudos apóiam a viabilidade de projetar uma construção de coração neonatal. Eles ainda permitem a investigação sobre se a MEC de corações pós-natais precoces pode abrigar pistas que resultarão em melhores estratégias de recelularização.

decelularização Em média, o tempo para a descelularização de um coração P3 utilizando este protocolo é de aproximadamente 14 horas. dado um peso médio do coração de 23 mg para o recém-nascido P3. acelularidade Figura 3a mostra um coração neonatal P3 totalmente intacto (conjunto de montagem). Figura 3b mostra o mesmo coração seguinte descelularização. As F...

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation.  Each year, it is estimated that more than 100,000 donor ...

O objetivo geral desta metodologia é gerar novos esqueletos a partir de tecido cardíaco miriânico neonatal para seu uso em estudos regenerativos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na cardiologia regenerativa. Oferece um modelo inovador para o estudo das interações entre células e matriz, já que a matriz extracelular é derivada de tecido cardíaco com capacidade de proliferação.A principal vantagem desta técnica é que ela permite a descoberta de novidades na matriz extracelular neonatal. O procedimento será demonstrado por Stefan Kren, um técnico do meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento, passe uma seção de quatro centímetros de tubo PE 50 sobre uma pequena chama de álcool para criar um cateter menor e mais fino.Retalhe as extremidades nas dimensões apropriadas para obter dois cateteres simétricos de cada lado do PO e, brevemente, coloque uma extremidade cortada do tubo na chama para fundir uma palheta na abertura da extremidade fina. Em seguida, encha uma seringa de 12 mililitros com PBS e acople uma torneira de três vias à seringa. Fixe uma agulha de calibre 22 na torneira e introduza a agulha através do septo.Em seguida, deslize o cateter de tubo de PE sobre a agulha e irrigue o conjunto com PBS. Quando o conjunto do cateter estiver pronto, limpe o tórax do neonato com etanol a 70%. Em seguida, use uma tesoura padrão para remover a pele do tórax, puxando o tecido lateralmente com uma pinça número cinco.Em seguida, perfure a parede abdominal logo abaixo do esterno e segure o processo xifoide com a pinça. Retrai o esterno em direção rostral em relação ao corpo enquanto corta as costelas em ambos os lados do tórax e reflita a caixa torácica para cima. Quando o coração ficar visível, puxe lateralmente o timo para dissecar os dois lobos principais, expondo o arco da aorta e as veias cavas e pulmonares.Usando tesoura de mola de 10 centímetros, seccionar as artérias principais a partir do arco aórtico, bem como a própria aorta. Segurar as extremidades dos vasos seccionados para refletir o coração para frente, separando-o da traqueia e do esôfago, e cortar entre os pulmões e o coração e em ambos os lados do coração para seccionar a vasculatura pulmonar e outras veias principais. Em seguida, segurar as extremidades seccionadas dos vasos principais e remover o coração do mediastino, colocando o coração em uma placa de cultura de 60 milímetros contendo PBS estéril.Para descelularizar o coração, coloque a placa de cultura sob um microscópio estereoscópico e insira a agulha do conjunto do cateter na aorta até, mas sem ultrapassar, a válvula aórtica. Fixe a agulha com um laço de sutura 7-0, apoiando a falange do cateter proximalmente contra o laço e fazendo um selo hermético, e perfunda suavemente o coração com PBS. Se não houver vazamentos, o tecido ficará homogeneamente pálido à medida que o sangue residual for removido.Coloque o septo no pescoço do adaptador de entrada e dobre as bordas do septo sobre o vidro. Em seguida, conecte um reservatório contendo 60 mililitros de dodecilsulfato de sódio a 1% em água destilada por meio de uma tubulação de comprimento suficiente para gerar uma coluna que produza 20 milímetros de mercúrio de pressão, e perfunda o coração com SDS por 14 horas. Ao final da perfusão, o coração estará translúcido, sem tecido remanescente visível.Enxágue o sistema até a torneira com a solução restante de SDS e preencha o reservatório com 10 mililitros de água deionizada. Em seguida, enxágue o coração com perfusões consecutivas de 10 mililitros de Triton X-100 a 1%, 10 mililitros de água deionizada e 60 mililitros de PBS contendo penicilina e estreptomicina. Após a última perfusão, armazene o coração em PBS com antibióticos a quatro graus Celsius.Para recelularizar o tecido, transfira a matriz cardíaca com cateter para uma placa de cultura de 60 milímetros sob um microscópio estereoscópico e conecte uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 22 gauge carregada com as células apropriadas de interesse ao cateter. Confirme que a montagem está livre de bolhas e perfunda suavemente 20 microlitros da suspensão celular por minuto na matriz cardíaca através das artérias coronárias. Quando 100 microlitros das células tiverem sido administrados, desconecte a seringa e empurre o cateter para um stub rombo de 22 gauge fixado ao encaixe tipo lure na parte inferior da tampa do frasco do biorreator cardíaco.Agora, inicie a bomba peristáltica e confirme que o fluxo prossegue do reservatório através da bomba, passando pelo captador de bolhas, até o cateter, e que a circulação cardíaca flui para fora das veias e goteja a partir do ápice, recirculando para o reservatório de meio. Nestas imagens, é mostrada a coloração com hematoxilina e eosina de corações intactos e descelularizados. Observe a ausência de núcleos positivos para hematoxilina e a redução das estruturas eosinofílicas no coração descelularizado.Para avaliar o conteúdo da matriz extracelular em corações neonatais intactos e descelularizados, a imunomarcação demonstra que o colágeno IV é robustamente expresso tanto no coração intacto quanto no descelularizado, e que a localização desta proteína é mantida após a remoção celular, enquanto os núcleos positivos para DAPI são efetivamente removidos. O conteúdo de DNA também é reduzido nos corações neonatais após a descelularização baseada em detergentes, consistente com relatos que utilizam descelularização baseada em detergentes em outros tecidos. Nessas imagens, podem ser observados cardiomiócitos recelularizados que migraram para a parede do ventrículo esquerdo.Até 23 dias após a perfusão, essas células migradas podem ser positivas para marcadores de células progenitoras cardíacas, mCherry, marcadores de cardiomiócitos diferenciados ou DAPI, com a maioria das células expressando os quatro marcadores. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em 34 horas se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que não se embolize o coração introduzindo ar através do aparelho de perfusão.Após seguir este procedimento, a produção de géis e a impressão 3D podem ser utilizadas para criar enxertos proliferativos ou até corações tridimensionais in vitro. Esta técnica pode abrir caminho para que pesquisadores promovam a regeneração cardíaca. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como descelularizar e recelularizar um coração de camundongo neonatal.Não se esqueça de que trabalhar com dodecilsulfato de sódio pode ser perigoso, e precauções como máscara N-95 ou capela de exaustão devem sempre ser utilizadas ao manipular o reagente em pó seco.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Métodos para a preparação de um gel matriz injetável a partir de tecido decelularizado e injetá-lo em rato...

Biologicamente fabricação de materiais derivados injetável para Engenharia de Tecidos do Miocárdio

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de substratos biomiméticos de cultura de células cardíacas feitos de dois materiais poliméricos distintos usando litografia de força capilar.  Os métodos descritos fornecem uma técnica escalável e econômica para projetar a estrutura e a função dos tecidos cardíacos macroscópicos para aplicações in vitro e in vivo.

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Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

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Este protocolo descreve um modelo altamente reprodutível de regeneração cardíaca por indução cirúrgica de infarto do miocárdio no ventrículo esquerdo de camundongos pós-parto no dia 1. O método envolve indução de anestesia hipotérmica e ligadura da artéria coronária descendente anterior.

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Este protocolo descreve a decellularization completa do miocárdio humano preservando seus componentes de matriz extracelular. Transformação dos resultados da matriz extracelular na produção de micropartículas e um hidrogel de auto-montagem de tilacoides.

Processamento do tecido cardíaco humano em direção a matriz extracelular auto montagem hidrogel para In Vitro e In Vivo de aplicações

A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Este protocolo descreve um método baseado em molde líquido para criar tecidos cardíacos livre de andaime tridimensionais com integridade estrutural satisfatória e comportamento batendo síncrono.

Um método baseado em molde líquido de criação livre de andaime tridimensional de tecido cardíaco

Decellularized andaimes derivado de cartilagem podem ser usados como um andaime para guia de reparação da cartilagem e como um meio para regenerar o tecido osteocondral. Este documento descreve o processo de decellularization em detalhes e fornece sugestões para usar estes andaimes em configurações in vitro.

Fabricação de matriz de cartilagem-derivado Decellularized andaimes

Apresenta-se aqui um conjunto de protocolos para a geração e criopreservação de esferoides cardíacos (CSs) de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos cultivados em um formato multidimensional de alto rendimento. Esse modelo tridimensional funciona como uma plataforma robusta para modelagem de doenças, rastreios de alto rendimento e mantém sua funcionalidade após a criopreservação.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Este trabalho apresenta um modelo animal de fibrose induzida pela transição endotelial-mesenquimal, como visto em defeitos cardíacos congênitos, como estenose aórtica crítica ou síndrome do coração esquerdo hipoplásico, que permite a avaliação histológica detalhada do tecido, a identificação de vias de sinalização regulatórias e o teste de opções de tratamento.

Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Neonatal em Rato para Estudo da Transição Endotelial-Mesenquimal

Fibroblastos isolados do coração humano adulto foram cultivados para confluir em placas revestidas de gelatina para produzir a matriz extracelular específica do miocárdio. Após a descelularização, esse substrato pode ser utilizado para o cultivo e estudo de outras células cardíacas e interações célula-matriz.

Produção de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para Revestimento de Placa de Cultura

Aprenda a criar matrizes cardíacas neonatais a partir de tecido murino para estudos de cardiologia regenerativa. Este método permite investigar interações célula-matriz e as propriedades únicas da matriz extracelular neonatal.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

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