Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

O objetivo geral deste procedimento é formar, padronizar e encapsular células dentro de matrizes extracelulares à base de polímeros sintéticos. Este método pode ser usado para abordar questões biológicas críticas relacionadas à identificação de pistas extracelulares que regulam as respostas celulares em microambientes heterogêneos. A principal vantagem desta técnica é que uma matriz sintética robusta é gerada para encapsulamento e cultura celular usando protocolos e materiais acessíveis.

Este método pode ser usado para cultura de células controladas e para estudar a resposta celular in vitro. Pode ser aplicado a outros sistemas, incluindo administração de medicamentos e engenharia de tecidos. Prepare os materiais para a formação de hidrogel conforme descrito no protocolo de texto.

Conecte uma lente colimadora na extremidade da guia de luz cheia de líquido para garantir uma intensidade de luz relativamente uniforme em todas as amostras. Ajuste a distância da guia de luz das amostras para obter um tamanho de ponto que cubra as amostras de interesse. Para fazer hidrogéis não padronizados, prepare hidrogéis espessos moldados nas pontas das seringas pipetando 10 a 20 microlitros da solução precursora de gel na ponta de uma seringa de corte estéril.

Faça um único gel por seringa com aproximadamente 0,5 a 1,5 milímetros de espessura, com base no volume e no diâmetro da seringa. Prepare hidrogéis finos em moldes de lâmina de vidro colocando a junta de borracha ao redor das bordas da lâmina de vidro não revestida. Em seguida, pipete de cinco a 10 microlitros da solução precursora de gel na lâmina de vidro não revestida.

E coloque a lâmina de vidro revestida com antiadesivo em cima da solução de gel. Prenda as lâminas de vidro com pequenos clipes de fichário para estabilizar. Defina a intensidade da lâmpada para atingir 10 miliwatts por centímetro quadrado na superfície do gel para moldes de ponta de seringa ou moldes de lâmina de vidro.

Usando um radiômetro para detectar intensidade. E coloque os moldes sob a lâmpada. Aplique luz por um a cinco minutos para permitir a polimerização completa dos géis.

Use um tempo de polimerização mais curto para géis com maior teor de tereftalato de polietilenoglicol. E um tempo maior para géis com menor teor produzirem hidrogéis totalmente polimerizados com módulos dentro da faixa de tecidos moles. Coloque os géis dos moldes da ponta da seringa em uma placa estéril não tratada de 48 poços e coloque as lâminas de vidro em um prato estéril.

Para preparar hidrogéis padronizados, prepare a solução precursora conforme descrito no protocolo de texto e pipete vigorosamente a solução para garantir uma mistura uniforme da solução. Em seguida, cubra os géis pré-formados com um peptídeo penton na solução fotoiniciadora de fosfato de lítio e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova o excesso de solução.

Se os géis forem moldados na ponta de uma seringa, use uma espátula para transferir cuidadosamente da placa de 48 poços para uma lâmina de vidro estéril para padronização. Coloque uma máscara fotográfica com o padrão desejado diretamente em cima da seringa e dos géis moldados em lâminas de vidro. Certifique-se de que a parte impressa da máscara toque o gel para obter a fidelidade ideal do padrão.

Coloque as amostras sob a lâmpada e irradie por um minuto. Após a padronização, coloque os géis moldados com seringa em uma placa estéril tratada com 48 poços sem cultura de tecidos. Coloque os géis moldados em lâminas de vidro que estão aderidos às lâminas de vidro em um prato estéril.

Enxágüe três vezes, 15 minutos com meio cultivado ou o tampão apropriado com base nos experimentos planejados. Para realizar a detecção e quantificação de tióis livres em hidrogéis fotopadronizados, primeiro prepare as soluções e execute os cálculos conforme descrito no protocolo de texto. Forme hidrogéis finos para padronizar como antes.

Especificamente, faça géis com excesso de tióis livres e padronize metade dessas amostras com o peptídeo penton usando uma lamínula transparente para expor totalmente todo o gel com luz. Coloque géis padronizados e não padronizados em poços de uma placa de 48 poços. Enxágüe por 15 minutos, três vezes com o tampão de reação de Ellman, para permitir a difusão das espécies reagidas para fora do gel e o inchaço de equilíbrio ocorra.

Adicione o tampão de reação extra de Ellman aos géis de enxágue, de modo que o volume de gel inchado com o tampão de reação seja um múltiplo de 20 microlitros. Por exemplo, se o volume de gel inchado previsto for de 15 microlitros, adicione cinco microlitros de tampão de reação. E se o volume previsto de gel inchado for de 30 microlitros, adicione 10 microlitros de tampão de reação.

Pipetar os padrões sistina em poços individuais de uma placa de 48 poços em múltiplos de 20 microlitros. Dependendo do volume usado na etapa anterior. Por exemplo, se a etapa anterior teve um volume de gel inchado, mais tampão de reação extra igual a 40 microlitros, adicione 40 microlitros de cada padrão a poços vazios individuais.

Em seguida, dilua o reagente de Ellman e o tampão de reação. Adicione o reagente de Ellman diluído a poços contendo padrões e amostras. Para amostras de 20 microlitros, adicione 183,6 microlitros de solução a cada poço.

Incubar ou colocar em um agitador por uma hora e trinta minutos, ou até que a cor da solução corresponda à cor dos géis por inspeção visual, para garantir difusão suficiente do diânion amarelo 2-Nitro-5-tiobenzóico, que é gerado após a reação do reagente de Ellman com tióis livres do gel. Pegue 100 microlitros de solução das amostras e padrões e coloque em poços de uma placa de 96 poços. Leia a absorção em 405 nanômetros em um leitor de placas.

Para visualizar os padrões fotográficos, remova o excesso de tampão de reação limpando suavemente as bordas do hidrogel com um lenço de papel. Pipete o reagente de Ellman diretamente na superfície do gel. Imagem imediata em um microscópio de luz a 10x ou em um microscópio estéreo com uma câmera colorida.

Colete as células e prepare-as para encapsulamento conforme descrito no protocolo de texto. Imediatamente após a aspiração do PBS, suspender as células peletizadas na solução precursora até uma concentração final de cinco mil células por microlitro. Deixe uma concentração adequada de tióis livres para posterior reação com o peptídeo penton.

Se desejar o padrão de fotos. Molde, polimerize e padronize hidrogéis como antes. Enxágue os géis por 10 minutos, três vezes, em meio de crescimento após a padronização para remover as espécies que não reagiram e o excesso de fotoiniciador de fosfato de lítio.

Incube os géis em meio de crescimento a 37 graus Celius e cinco por cento de CO2 até o ponto de tempo desejado para análise posterior. Reabasteça o meio a cada 48 horas ou conforme determinado pelas aplicações. Para determinar a viabilidade celular encapsulada, primeiro remova o meio de crescimento dos géis e enxágue por 15 minutos, três vezes, com PBS para permitir a difusão do meio dos géis.

Adicione dois microlitros do homodímero de etídio-1 de dois milimolares descongelados e 0,5 microlitros das soluções descongeladas de AN de cálcio de quatro milimolares a um mililitro de PBS estéril. Vórtice para garantir uma mistura completa. Adicione 300 microlitros de solução permanente a cada gel de molde de seringa nas placas de 48 poços, ou o suficiente para cobrir a superfície do gel em uma lâmina de vidro em um prato estéril.

E incube por 45 minutos. Remova o excesso de solução em pé e enxágue para remover o excesso de corante dos géis. Visualize as células em um microscópio confocal.

Ou em um microscópio de epifluorescência com capacidade de 10x. E excitação de 488 nanômetros e emissão de 525 nanômetros. A concentração de tióis livres de hidrogéis não padronizados e padronizados quantificados com Ellman demonstrou que os hidrogéis inicialmente poliméricos por um minuto e por cinco minutos têm concentrações de tióis livres estatisticamente semelhantes, indicando reação rápida e gelificação completa em um minuto.

A padronização subsequente em massa dos géis incubados com peptídeos penton por 30 minutos e por uma hora e 30 minutos tem uma redução de 60 a 80 por cento na concentração de tióis livres, indicando modificação eficiente do excesso de tiol. Padrões fotográficos formados pela luz brilhante através de amostras cobertas com máscaras, impressas aqui com linhas, podem ser observados em duas dimensões com a aplicação do reagente de Ellman. Ou, em três dimensões com a incorporação de peptídeos fluorescentes em imagens subsequentes.

Células-tronco humanas adultas encapsuladas em hyrogels foram tratadas com corantes de viabilidade e hidrotoxicidade. E fotografado com microscopia confocal. As células viáveis sem danos à membrana são rotuladas em verde e indicam a sobrevivência das células um dia após o encapsulamento.

As células começam a se espalhar dentro da matriz seis dias após o encapsulamento. Como mostrado na imagem inserida. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter procedimentos de manuseio estéreis e cuidadosos para evitar danos às células após o encapsulamento por meio da introdução de contaminantes ou pura mecânica.

Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo de imunocoloração e expressões gênicas, podem ser realizados para estudar a função e o destino celular em resposta ao ambiente extracelular. Esta técnica abre caminho para pesquisadores nas áreas de biologia, bioengenharia e medicina, estudarem a erosão da região tecidual ou a progressão da doença em matrizes extracelulares sintéticas com controle de propriedade definido pelo usuário, para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como encapsular células e padronizar matrizes macias para estudos de cultura de células controladas.