Name: Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a formar e padronizar hidrogéis por luz para cultura celular tridimensional. Esta técnica utiliza química fotoclick citocompatível para encapsular células em matrizes sintéticas controladas.

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Este trabalho foi financiado pelos programas de Delaware Cobre em Drug Discovery e em Biomateriais Avançados financiados pelo Prêmio de Desenvolvimento Institucional do Instituto Nacional de generais Ciências Médicas no National Institutes of Health (P20GM104316 e GM110758-01 P30, respectivamente), a Pew Charitable Trusts (00026178), um Prémio Carreira National Science Foundation (DMR-1253906), o Fundo Burroughs Wellcome (1.006.787), e do programa de Ciência da Fundação Nacional IGERT SBE2 na Universidade de Delaware (comunhão de L. Sawicki). Os autores agradecem a bioimaging Centro de Delaware Biotechnology Institute da Universidade de Delaware para a formação e acesso a microscopia confocal, a Sra Katherine Wiley para a assistência durante a filmagem do vídeo, o Sr. Matthew Rehmann para generosamente fornecer hMSCs isoladas de medula óssea, Prof. Christopher J . Kloxin e Mr. Stephen Ma para generosamente fornecem máscaras e Prof. Wilfred Chen para o uso do leitor automático de placas. </p&gt;

<ol><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+-+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chemie - Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
<li>Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+in+Materials+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry in Materials Science.</a> Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).</li>
<li>Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+click+chemistry%3A+An+indispensable+tool+to+create+multifaceted+cell+culture+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Lett%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds.</a> ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).</li>
<li>Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+control+of+the+alkyne-azide+cycloaddition+by+photoinitiated+Cu%28II%29+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction.</a> Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).</li>
<li>Hoyle, C. E., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+-+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene click chemistry.</a> Angew Chemie - Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).</li>
<li>Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+forming+hydrogels+via+catalyst-free+and+bioorthogonal+%26%2334%3Btetrazole-Alkene%26%2334%3B+photo-click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal &#34;tetrazole-Alkene&#34; photo-click chemistry.</a> Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).</li>
<li>Burdick, J. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+from+static+to+dynamic+complexity+in+hydrogel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design.</a> Nat Commun. 3, 1269(2012).</li>
<li>Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+and+dynamic+soft+materials+for+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture.</a> Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).</li>
<li>Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+well-defined+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+prepared+by+thiol-ene+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Polym+Sci+Part+A+Polym+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry.</a> J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+synthetic+extracellular+matrix+mimic+via+thiol-norbornene+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization.</a> Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).</li>
<li>Roberts, J. J., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+photopolymerizable+thiol-ene+PEG+and+acrylate-based+PEG+hydrogels+for+cartilage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development.</a> Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).</li>
<li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).</li>
<li>Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-norbornene+photoclick+hydrogels+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications.</a> J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).</li>
<li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+thiol-ene+photoclick+hydrogels+using+facile+techniques+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications.</a> Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).</li>
<li>Patterson, J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+proteolytic+degradation+of+molecularly+engineered+PEG+hydrogels+in+response+to+MMP-1+and+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2.</a> Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable%2C+photoadaptable+hydrogels+via+radical-mediated+disulfide+fragmentation+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction.</a> Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+incorporating+RGD+adhesive+peptide+in+polyethylene+glycol+diacrylate+hydrogel+on+osteogenesis+of+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells.</a> Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).</li>
<li>Wacker, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+migration+on+RGD-peptide-containing+PEG+hydrogels+in+the+presence+of+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate.</a> Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+well-defined+peptide-hydrogel+spacing+and+concentration%3A+impact+on+epithelial+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior.</a> Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).</li>
<li>Qiong Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+biodegradable+polyethylene+glycol%2F+RGD+peptide+hybrid+hydrogels+for+in+vitro+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stern+cellsa%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa.</a> Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+biological+materials+and+their+impact+on+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Soft biological materials and their impact on cell function.</a> Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).</li>
<li>Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogels+formed+by+thiol-ene+photo-click+chemistry+and+their+effect+on+the+formation+and+recovery+of+insulin-secreting+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids.</a> Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+encapsulation+in+3D+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering.</a> J Vis Exp. (32), e1590(2009).</li>
<li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH%2F3T3+fibroblasts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).</li>
<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks+Controlled+Degradation+and+Mechanical+Behavior+of+Photopolymerized+Hyaluronic+Acid+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Society%22%5BJournal%5D)">Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks.</a> Society. 6 (1), 386-391 (2005).</li>
<li>Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+of+gels+based+on+%28hydroxypropyl%29+cellulose+methacrylate%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+%28Guildf%29%22%5BJournal%5D)">Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate.</a> Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).</li>
<li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+of+Hydrogel+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Scaffolding+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds.</a> Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+hydrogels+in+three+dimensions+towards+controlling+cellular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions.</a> Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).</li>
<li>Mosiewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+cell+manipulation+through+enzymatic+hydrogel+photopatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning.</a> Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).</li>
<li>Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+cytocompatibility+of+six+cell+lines+with+photoinitiators+used+for+polymerizing+hydrogels+and+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation.</a> Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).</li>
<li>Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNimmo%2C+CM+%22Diels+-+Alder+Click+Cross-Linked+Hyaluronic+Acid+Hydrogels+for+Tissue+Engineering%22">Diels - Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering</a>. , 824-830 (2011).</li>
<li>DeForest, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytocompatible+click-based+hydrogels+with+dynamically+tunable+properties+through+orthogonal+photoconjugation+and+photocleavage+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions.</a> Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+rates+and+mechanisms+for+radical%2C+photoinitated+addition+of+thiols+to+alkynes%2C+and+implications+for+thiol-yne+photopolymerizations+and+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions.</a> Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Wylie, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li>
<li>Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+growth+factors+on+solid+supports+for+the+modulation+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).</li>
<li>Hudalla, G. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+that+regulate+growth+factor+activity+via+bioinspired+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions.</a> Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).</li>
<li>Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+micropatterning+of+bioactive+hydrogels+via+two-photon+laser+scanning+photolithography+for+guided+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration.</a> Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O procedimento aqui apresentado demonstra técnicas para photoencapsulate células dentro de hidrogéis formados por tiol-eno clique química e posteriormente photopattern os géis com sinais bioquímicos. A utilização de luz para formar hidrogeles inicialmente permite que a mistura homogénea e a suspensão das células na solução de polímero antes da polimerização. Polimerização rápida fechaduras &#39;&#39; o gel na forma do molde definido e encapsulando células dentro da rede de hidrogel suspensa. Os géis podem também ser moldado em numerosas formas diferentes (por exemplo, lâminas de vidro ou de pontas de seringa), dependendo da aplicação final desejada. Por exemplo, as células encapsuladas para a cultura em 3D hidrogeles ligados a lâminas de vidro são particularmente úteis para aplicações de imagem de atenuação da luz é limitado dentro de uma amostra fina. moldes de seringa pode ser utilizada para encapsulamento de células rápida, permitindo que um maior número de amostras a serem preparadas em um curto período de tempo (em relação à lâmina de vidros) que pode ser utilizado para experiências que requerem um grande número de células, tais como citometria de fluxo ou qPCR. Subsequentemente, estes géis podem então ser modelado com sinais bioquímicos para desencadear respostas celulares desejados, tais como a diferenciação ou invasão 30,31. Os ensaios para a viabilidade e a actividade metabólica indicam a sobrevivência das células para o sistema de materiais e condições de modelação apresentados. Note-se que a actividade metabólica foi monitorizado até o dia 3 em geles não degradáveis ​​(RGKGRK reticulação péptido) para avaliar os efeitos iniciais de condições de polimerização e modelação sobre a função celular. Além disso, um ensaio de integridade da membrana (ao vivo / morto viabilidade / citotoxicidade coloração) de hMSCs em 1 e 6 dias pós-encapsulamento em géis formulados com uma reticulação peptídeo degradável (GPQGIWGQ) suporta que as células permaneçam viáveis ​​e difundidos a 1 semana de cultura. A viabilidade de linhas celulares adicionais foi avaliado para as condições photopatterning 32 semelhantes aosutilizado aqui e podem ser avaliados para o sistema de hidrogel descrito utilizando coloração vivo / morto e ensaios de actividade metabólica. Embora não tenhamos observado problemas com a viabilidade celular utilizando este sistema de materiais e procedimentos conexos (4.2 e 4.3), alguns tipos de células podem ser sensíveis aos radicais livres e / ou exposição à luz. Neste caso, os usuários podem considerar o uso de sistemas de materiais não-fotoiniciada, como azida-alcino, 12 FXIII, 31 ou químicos de formação de hidrogel à base de Alder Diels. 33 Facile técnicas para detectar e quantificar a padronização de sinais bioquímicos dentro geles também são apresentados (3.1 e 3.2). Ensaio de Ellman é de particular interesse porque os reagentes estão comercialmente disponíveis e não há passos de processamento extra ou sintética reagentes mais dispendiosos (por exemplo, de péptido marcado fluorescentemente) são necessários. ensaio de Ellman pode ser utilizado para determinar com precisão a modificação de tióis livres com sinais bioquímicos sob difereNT photopatterning condições, assim como para visualizar rapidamente padrões. Para quantificar a incorporação de péptidos, a concentração do grupo funcional tiol antes e depois da modelação, como uma medida quantitativa da incorporação de péptido, está directamente avaliadas com ensaio de Ellman. Embora este tipo de quantificação pode ser feita com péptidos marcados com fluorescência, 34 quantificação baseado em imagiologia requer mais de manipulação e análise de passos que consomem tempo (por exemplo, a síntese de um péptido fluorescentemente marcado e geração de uma curva de calibração para relacionar fluorescência a concentração de peptídeo usando análise de imagem). Para imagem de incorporação de péptidos, reagente de Ellman pode ser directamente aplicada a amostras e imediatamente visualizado. Embora limitado ao xey planos para visualização padrão, a técnica pode ser utilizada como um método simples, de rotina para determinar se as matrizes que contêm grupos tiol livres têm sido modelado. É importante notar que o ensaio de Ellman não é cConsiderado cytocompatible, Assim, embora possa ser usada para observar e quantificar photopatterns, ele não pode ser feito na presença de células. Para imagiologia de modelação em três dimensões e na presença de células, a conjugação de péptidos fluorescentes dentro de matrizes de hidrogel continua a ser uma abordagem poderosa e amplamente utilizado. Resolução de padrões podem ser avaliadas na x, y, e z-planos utilizando microscopia confocal, e este método é cytocompatible modo que as células dentro das regiões modeladas ou regiões não modelado pode ser identificado. Tomados em conjunto, técnicas de ensaio e com base em imagens de Ellman são ferramentas complementares para pesquisadores para avaliar quantitativa e qualitativamente o photopatterning de pistas bioquímicos dentro do sistema de materiais. Photoclick, ou, mais amplamente fotoiniciada, produtos químicos para a formação de hidrogéis e de modificação, na presença de células são numerosas. A moldagem, encapsulamento e padronização técnicas apresentadas aqui não são limITED para o sistema de material descrito e pode ser aplicado a produtos químicos à base de luz alternativas, tais como tiol-alcino, 35 azida-alcino, 4 e outras químicas de tiol-eno (por exemplo, tiol-norborneno), 10,13, bem como com fotoiniciadores diferentes, tais como Irgacure 2959, Eosina Y, e canforoquinona. Nota, os usuários podem precisar de ajustar parâmetros de procedimento (por exemplo, tempos de incubação, os tempos de polimerização, a densidade celular) para garantir que as condições permaneçam cytocompatible para esses outros sistemas. Uma vez que o processo de modelação requer a difusão do péptido (s) modificado com Alloc no hidrogel (2.2.3-2.2.5), este processo pode ser mais útil para a adição de porções de ligação a integrina (por exemplo, péptidos ou proteínas da matriz extracelular fragmentos) para o hidrogel, em que é necessária a ligação do ligando para a rede para a geração de forças de tracção através da activação de células e integrina completa. 36 Nota, para biomoléculas que podeser igualmente activa em solução ou em cima de imobilização (por exemplo, factores de crescimento ou citoquinas), o passo de incubação para a difusão fracção (~ 1 h) em que o hidrogel pode levar a acontecimentos de sinalização que CONVOLUTE resultados de padronização. Outros métodos foram estabelecidos para fator de crescimento de imobilização ou sequestro local para a sua padronização. 37-39 Além disso, a resolução padrão é ditada pelo controle sobre a exposição à luz. Aqui, máscaras permitir a criação de padrões através da profundidade gel e no xey aviões; no entanto, um maior controlo espacial sobre padrões de sinais bioquímicos dentro de geles pode ser conseguida com métodos alternativos de irradiação, tais como o uso de um microscópio confocal de dois fotões para gerar padrões no x-, y- e z- 34,40 aviões. finalmente, é importante notar que, enquanto o sistema de material utilizado dentro deste processo só é inicialmente modificada com sinais bioquímicos, químicos Photoclick ortogonais pode ser utilizada para permitir alterações em propriedades da matriz ao longo do tempo. 12 do procedimento e técnicas apresentadas aqui incluir a diversidade das abordagens atuais para a criação de matrizes sintéticas com propriedades bem definidas e controladas-espaço-temporalmente. Em particular, a disponibilidade comercial dos reagentes e materiais usados ​​neste processo são úteis para uma ampla gama de investigadores interessados ​​no uso de biomateriais à base de hidrogel para aplicação em cultura de células controlada.

Clique químicas são cada vez mais utilizados na concepção de materiais para diversas aplicações biomédicas, incluindo a entrega de drogas, engenharia de tecidos e cultura de células controlado, devido às suas e eficientes, e muitas vezes reacções cytocompatible seletivos. 1-3 Photoclick químicas que utilizam luz para desencadear ou iniciar reacções (por exemplo, azida-alcino, 4 tiol-eno, e 5-tetrazolo alceno 6) são de particular interesse para a formação ou a modificação de biomateriais. Taxas rápidas sob condições suaves e controle de quando e onde eles ocorrem com luz fazem essas reações bem adequada para o controle dirigido pelo usuário de propriedades de biomateriais na presença de células 7,8, em particular., Têm sido utilizados produtos químicos tiol-eno Photoclick para gerar biomateriais à base de hidrogel com propriedades mecânicas consistentes e 5,9 para o encapsulamento de uma ampla variedade de tipos de células, incluindo, mas nãot limitado a, células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs), fibroblastos, condrócitos, células pancreáticas, e com promessa para cultura de células e de entrega. 10,11 Além disso, estes produtos químicos têm sido utilizados para o padrão espacial de sinais bioquímicos para imitar aspectos fundamentais de microambientes celulares nativas e facilitar as interações célula-matriz apropriadas, incluindo a adesão, diferenciação e invasão. 3,12 Para a construção de hidrogéis tiol-eno com luz, péptidos contendo cisteína (tiol) comumente reagem com polímeros funcionalizados com acrilatos ou norbornenos ( &#39;ene&#39;) para uma rápida, a polimerização fotoiniciada em condições cytocompatible. 13 A expansão desta caixa de ferramentas, procurou-se estabelecer métodos para a formação de hidrogel com novos blocos de construção versátil e acessível que exigiam processamento sintético mínimo ou comercialmente disponíveis para a sua ampla utilização como matrizes extracelulares sintéticas.14 Especificamente, os péptidos foram modificados com aliloxicarbonilo (Alloc)-protegido lisinas: um para pingente, grupos de ligação de integrina para promover a adesão celular [K (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] ou dois para ligações cruzadas não degradáveis ou células-degradáveis [K ( alloc) RGKGRKGK (alloc) G ou KK (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) K = Pep2Alloc, respectivamente]. Com estas sequências, foram estabelecidas as condições de reacção rápida (1-5 min) com quatro braços de poli-tiol modificado (etileno glicol) (PEG4SH) utilizando doses cytocompatible de luz UV de comprimento de onda longo (10 mW / cm2 a 365 nm) e o fotoiniciador lítio fenil-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Os hidrogéis resultantes eram estáveis ​​sob condições de cultura de células para semanas. Para permitir que a degradação e remodelação conduzido de células, um péptido enzimaticamente clivável foi incorporada dentro das ligações cruzadas de gel (isto é, GPQGIWGQ), 15 e uma célula primária modelo, as células estaminais mesenquimais humanas (hMSCs), manteve-se altamente viáveis após encapsulação e durang cultura dentro destas matrizes. Além disso, os péptidos foram espacialmente modelado dentro destes materiais, e hMSCs permanecem viáveis ​​e metabolicamente ativo em condições photopatterning. Sequências peptídicas pingente alternativos, não mostrado aqui (por exemplo, IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc), também podem ser incorporados dentro de matrizes para investigar interacções celulares adicionais com o microambiente circundante. Estes resultados são promissores para a aplicação destes materiais à base de hidrogel para a cultura tridimensional (3D) de células e de entrega e para estudar as interacções célula-matriz directos para uma variedade de tipos de células. Nisto, os métodos para photoencapsulate células e sinais bioquímicos subsequentemente photopattern dentro do sistema proposto hidrogel são apresentados (Figura 1). Técnicas para observar e quantificar estas photopatterns também são demonstradas: nomeadamente, i) a utilização quantitativa e qualitativa do ensaio de Ellman para determinar a modificação de tióis livres dentro substratos estampados e ii) a utilização qualitativa complementar de peptídeos fluorescentes (AF488Pep1Alloc) para observar esses padrões em três dimensões. Além disso, ensaios para determinar a viabilidade (ao vivo / morto viabilidade / citotoxicidade coloração) e actividade metabólica (MTS; 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazólio) são apresentados para que os usuários podem determinar a citocompatibilidade de condições photoencapsulation e photopatterning para diferentes linhas de células dentro de matrizes de hidrogel. Enquanto que o protocolo é demonstrado por um sistema Photoclick hidrogel à base de luz fácil, as técnicas podem ser aplicadas a vários outros sistemas de hidrogel radicalmente-iniciadas para photoencapsulation photopatterning e na presença de células.

<table><tbody><tr><td>Peptídeos personalizados</td><td>Vários fornecedores</td><td>----</td><td>peptídeos também podem ser sintetizados por meio de técnicas SPPS padrão com materiais de fornecedores como ChemImpex e ChemPep.</td></tr><tr><td>4-arm PEG Thiol, MW 20k</td><td>JenKem USA</td><td>4ARM-SH</td><td>Listado em Multi-arm Homofunctional PEGs. O PEG4SH também pode ser sintetizado conforme referenciado anteriormente.</td></tr><tr>Soluções de <td>fotopolímero</td> de <td>lítio fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato</td><td>Colorado Li-TPO</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Fenilfosfonita</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470</td><td>Cuidado, causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos. Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.</td></tr><tr><td>Cloreto de 2,4,6-trimetilbenzoíla</td><td>Sigma Aldrich</td><td>682519</td><td>Cuidado, causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos. Use luvas de proteção, roupas e proteção para os olhos.</td></tr><tr><td>Brometo de Lítio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>2-Butanona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360473</td><td></td></tr><tr><td>Frasco, Fundo Redondo, 100&nbsp; ml</td><td>Chemglass</td><td>CG-1506-05</td><td></td></tr><tr><td>80 ml Funil de Filtro, Buchner, Frita Média</td><td>Chemglass</td><td>CG-1402-L-02</td><td>Papel de filtro dentro de um funil de vidro comum pode ser usado se desejado.</td></tr><tr><td>Barras de agitação magnética</td><td>Vários fornecedores</td><td>----</td><td></td></tr> <tr><td>Agitação magnética e placa quente</td><td>Vários fornecedores</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>Dessecador a vácuo</td><td>Vários fornecedores</td><td>----</td><td></td></tr> <tr><td>óxido de deutério</td><td>Acros Organics</td><td>16630</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Selecione o meio e a tripsina apropriados, dependendo do tipo de célula.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Vários fornecedores</td><td>----</td> <td>tamanhos de 1,5 ou 2 ml, estéreis.</td></tr><tr><td>Seringa BD com Pontas Deslizantes (Luer) (Sem Agulha)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td>O número do produto listado aqui é para uma seringa de 1 ml (16H), Vários tamanhos estão disponíveis (14-823-XX).</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio de Vidro Liso Premium Fisherfinest Borracha</td> de Silicone de Alta Pureza <td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>, 0.010" de Espessura, Folha de 6" x 8", Durómetro (Junta)</td> <td>McMaster Carr</td><td>87315K62</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Provas</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>RainX, Original</td><td>Amazon</td><td>800002243</td><td>Pode ser comprado de outros fornecedores.</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Photomasks</td><td>Advance Reproductions Corporation</td><td>----</td><td>Photomask Division, diferentes designs podem ser impressos conforme desejado.</td></tr><tr><td>DTNB; Reagente de Ellman; 5,5-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzóico)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PI-22582</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio, Pellets/Certificado ACS</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Ortofosfórico</td><td>Alfa Aesar</td><td>33266</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de cisteína monohidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit de viabilidade/citotoxicidade, para células de mamíferos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 Ensaio de uma solução aquosa Centrífuga</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vários fornecedores</td><td>----</td><td>Capaz de velocidades de 90-110 x g.</td></tr><tr><td>Leitor de placas multipoços</td><td>Vários fornecedores</td><td>----</td><td>Capaz de ler absorbância a 405 nm em uma placa de 96 poços.</td></tr><tr><td>Microscópio Epifluorescente ou Confocal</td><td>Vários Fornecedores</td><td>----</td><td>Para visualizar padrões de peptídeos e células dentro de hidrogéis.</td></tr><tr><td>Omnicure Exfo Series 2000</td><td>Excelitas Technologies</td><td>----</td><td>Sistemas de luz alternativos podem ser usados para polimerizar hidrogéis.</td></tr><tr><td>Software Zeiss Zen Lite</td><td>Zeiss</td><td>----</td><td>Disponível em zeiss.com; compatível com imagens tiradas em microscópios Zeiss</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>----</td><td>Disponível em imagej.nih.gov; aplicável para análise geral de imagens</td></tr></tbody></table>

formação light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Clique químicos têm sido investigados para utilização em numerosas aplicações biomateriais, incluindo a entrega de drogas, engenharia de tecidos, e cultura de células. Em particular, as reacções de clique luz-mediadas, tais como reacções de tiol-eno-ino e tiol fotoiniciada, proporcionar controlo sobre as propriedades do material espaço-temporal e permitir a concepção de sistemas com um elevado grau de controlo das propriedades dirigido pelo utilizador. Fabricação e modificação dos biomateriais à base de hidrogel, utilizando a precisão proporcionada pela luz e a versatilidade oferecido por estes químicos tiol-X Photoclick são de interesse crescente, em particular para a cultura de células dentro bem definidas, microambientes biomiméticos. Aqui, descrevemos métodos para a photoencapsulation de células e subsequente photopatterning de pistas bioquímicos dentro de matrizes de hidrogel usando blocos versáteis e modulares de construção polimerizados por uma reação Photoclick tiol-eno. Especificamente, uma abordagem é apresentada para constructing hidrogéis de aliloxicarbonilo (Alloc) e ligações cruzadas de péptidos -functionalized unidades peptidicas pendente funcionalizado e poli-tiol (etileno glicol) (PEG), que polimeriza rapidamente na presença de fotoiniciador acylphosphinate lítio e doses cytocompatible de longo comprimento de onda ultravioleta (UV). Facile técnicas para visualizar e quantificar a photopatterning concentração de péptidos adicionados são descritos. Além disso, os métodos são estabelecidos para as células de encapsulação, especificamente as células estaminais mesenquimais humanas, e determinar a sua viabilidade e actividade. Enquanto a formação e padronização inicial de hidrogéis tiol-Alloc são mostradas aqui, estas técnicas podem ser amplamente aplicada a um número de sistemas de materiais de outra fonte de luz e radicais iniciados (por exemplo, tiol-norborneno, tiol-acrilato) para gerar substratos padronizados.

A configuração e procedimento para photoencapsulate células e géis subsequentemente photopattern contendo células encapsuladas está representado na Figura 1, e um exemplo para a preparação de soluções de estoque para formar um gel a 10% em peso é fornecida na Tabela 1. Utilizando a Tabela 1, a quantidade de monómeros (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) e fotoiniciador (LAP) necessária para polimerizar hidrogeles é calculado. Com base nestes cálculos, as soluções concentradas de PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, e LAP são preparados e misturados com e sem Pep1Alloc para a formação de géis e photopatterning, respectivamente (Figura 1A). Subsequentemente, as células são recolhidas a partir de placas, contadas e centrifugadas em quantidades adequadas para encapsulamento (Figura 1B). O sedimento de células é re-suspenso em solução de formador de gel (péptido / polímero / LAP em PBS), e as misturas de células / monómero são transferidos para uma seringa de vidro ou molds. As células são encapsulados dentro do hidrogel aquando da aplicação de luz (1-5 minutos de 10 mW / cm2 a 365 nm) (Figura 1C). Para photopatterning (Figura 1D), géis são embebidas com Pep1Alloc e LAP durante 30 min a 1 h e 30 min, permitindo a difusão do peptídeo e do iniciador na matriz polimerizada. Estes geles de péptido-carga, são cobertos com máscaras com padrões desejados e exposto a uma segunda dose de luz (1 min) para conjugar os péptidos a tióis livres no interior da matriz. Amarras pingente só são covalentemente ligados ao gel em regiões expostas à luz, o que facilita as interacções célula-matriz apropriados e imitando principais propriedades mecânicas e bioquímicas do microambiente celular nativo para sondar a função de células e destino in vitro. ensaio de Ellman proporciona um método fácil e pouco dispendioso para quantificar modificação gel e incorporação péptido dentro photopattesubstratos rned. Estampados e géis não-padrão (ou seja, géis com ou sem modificação peptídeo) são embebidos em tampão de reação pós-polimerização de Ellman. Em seguida, os padrões de cisteína e os géis embebidos em tampão são colocados em placas de 48 poços e incubou-se com reagente de Ellman (Figura 2A, esquerda). Após 1 hora e 30 minutos, aliquotas de amostras são colocadas em cavidades individuais de uma placa de 96 poços, e a absorvância é registada a 405 nm. Uma curva de calibração (Figura 2A, direita) a partir dos padrões de cisteína é traçada (absorvância vs concentração, ajuste linear), e a quantidade de tióis livres em géis pode ser determinada com base no seu factor de diluição. Estas concentrações tiol livres para várias condições de polimerização e photopatterning de um gel a 10% em peso são apresentados na Figura 2B. Géis polimerizada durante 1 ou 5 minutos, sem Pep1Alloc (barras azuis, I = 1 min e II = 5 min) têm concentrações tiol livres estatisticamente semelhantes, indicando tchapéu ocorre uma reacção rápida e de gelificação está completa dentro de 1 min (bicaudal teste t, p&gt; 0,05). Assim, a exposição adicional a luz (2-5 minutos) não resulta em mais de conversão de grupos funcionais. Géis polimerizados durante 1 minuto sem Pep1Alloc foram embebidos com Pep1Alloc (3 mg / ml) e LAP (2,2 mM) durante 30 min e 90 min (barras verdes, II = 30 min e IV = 90 min) e exposto a uma segunda dose de luz durante 1 min. A diminuição em tióis livres (60-80% no que diz respeito à condição de 1 min) indica a modificação eficiente dos géis com pistas pingente sob estas condições. Se maior modificação é desejada, o aumento das concentrações de solução Pep1Alloc pode ser utilizado como a acessibilidade de Pep1Alloc a tióis livres em soluções mais diluídas de péptidos podem limitar a conversão; Por exemplo, verificou-se que concentrações de até 20 mg / ml Pep1Alloc produzem&gt; 90% de conversão de tióis livres. Excepcionalmente, os padrões de péptidos adicionados ao hidrogel podeser rapidamente visualizados com reagente de Ellman (Figura 3A, sob 5 min). No entanto, a visualização do padrão é perdido ao longo do tempo (maior do que 5 minutos), devido à difusão do amarelo TNB 2- dianião através do gel. Para melhorar a resolução de imagem e observar os padrões em três dimensões (x, y, e z-planos) e na presença de células, a adição de péptido fluorescente (AF488Pep1Alloc) pode ser utilizada. Na Figura 3B x, y e z-projeções de pilhas de imagens tiradas com um microscópio confocal são mostrados, demonstrando resolução padrão (escala mm). Aproximadamente (94 ± 2)% e (94 ± 1)% de hMSCs encapsulados dentro de géis degradáveis ​​(Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) permanecem (corpos de células verdes) viáveis ​​1 e 6 dias após o encapsulamento, respectivamente, com as células mortas alguns (núcleos vermelhos ) observada (Figura 4A). Além disso, hMSC espalhamento é observada a 6 dias pós-encapsulação ( <st<html> Rong&gt; Figura 4A, inserção), o que indica que as células podem remodelar e interagir com estas matrizes MMP-degradáveis modificados com RGDS de ligação â integrina. Ensaios de actividade metabólicos realizados em células encapsuladas em géis não degradáveis (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 e 3 dias pós-encapsulação (Figura 4B) proporcionar uma segunda medida de viabilidade celular e demonstram que as células permanecem activas para as várias condições photoencapsulation e photopatterning testados com ensaio de Ellman (Figura 2B). Em particular, não existe nenhuma diferença significativa na actividade metabólica entre 30 min e 90 min incubações com Pep1Alloc + LAP (condições III e IV) e a encapsulação inicial (condições I e II), indicando que o procedimento é adequado para aplicações de photopatterning em a presença de células encapsuladas (bicaudal teste t, p&gt; 0,05). 2fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Configuração para encapsular células dentro de hidrogéis e, posteriormente, photopatterning com sugestão bioquímica (A) As soluções de macrï¿½eros e fotoiniciador são preparados e mista (PEG4SH = backbone, Pep2Alloc = reticulação, Pep1Alloc = pingente porção adesiva (RGDS), LAP = fotoiniciador ). (B) As células são recolhidas para encapsulamento. (C) As células são misturadas com soluções de macrómeros sem ou com péptidos de ligação a integrina (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP ou PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, respectivamente) e são encapsulados por exposição à luz. (D) Os géis que contêm grupos tiol em excesso durante a formação de gel (aqui, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, formado com 2 mM de excesso de tiol) pode ser modelado com sinais bioquímicos através da adição subsequente de péptidos funcionalizados com um único grupo alloc (Pep1Alloc, por exemplo, RGDS, IKVAV, etc.) para promover a adesão celulardentro de regiões específicas do gel. Aqui, padronização de géis com RGDS marcados com fluorescência é mostrado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig2.jpg" /> Figura 2:. Configuração do ensaio e resultados quantitativos de Ellman para avaliar a alteração de hidrogéis estampados Gel (A) e padrões de cisteína são incubadas em placas de 48 poços com o reagente de Ellman. Uma curva padrão é traçada linear para determinar a concentração de cisteína em amostras de gel. (B) tióis livres em excesso são incorporadas dentro de hidrogéis durante a formação do gel e consumido sobre a modelação com um pingente de Alloc-péptido (I = 1 min de polimerização; II = 5 min de polimerização; III = 30 min de incubação com Pep1Alloc; Wi incubação IV = 90 min<html> th Pep1Alloc; tanto III e IV polimerizado e modelado com luz durante 1 min). Os dados apresentados ilustram a média (n = 3) com barras de erro que mostram o erro padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig3.jpg" /> Figura 3:. Ensaio da Ellman e imagens fluorescentes para visualizar hidrogéis photopatterned reagente (A) de Ellman pode ser usado para detectar rapidamente padrões (linhas) em X e Y planos (amarelo = região unpatterned, Escala da barra = 1 mm). (B) os péptidos fluorescentes podem ser usados para observar padrões na x, y, e z-aviões (verde = região modelada; 200 bar mm escala; 10X de água-dipping objetiva; Ex / Em 488/525 nm).large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54462/54462fig4.jpg" /> . Figura 4: Viabilidade e atividade metabólica das células dentro hidrogéis photopatterned não degradáveis (A) Exemplo confocal z-stack (z-projeção; 10X de água-dipping objetiva) do viáveis (verde; Ex / Em 488/525 nm) e mortos hMSCs (vermelho; Ex / Em 543/580 nm) encapsulado dentro de hidrogéis 24 horas pós-encapsulamento (barra de escala = 200 mm). As células se espalham dentro desses hidrogéis 6 dias após o encapsulamento (imagem inserir, Scale bar = 50 mm). (B) As células são metabolicamente activa 1 e 3 dias (barras escuras e claras, respectivamente) pós-encapsulação para os diferentes polimerização (I = 1 min de polimerização; II = 5 min a polimerização) e em condições de modelação (III = 30 min de incubação com Pep1Alloc ; IV = 90 min incubatioN com Pep1Alloc; tanto polimerizado e modelado com luz durante 1 min). Os dados apresentados ilustram a média (n = 3) com barras de erro que mostram o erro padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54462/54462fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54462/54462tbl1.jpg" /> Tabela 1: Exemplo de configuração para calcular volumes de soluções de estoque para fazer hidrogéis células dentro da planilha que estão destacadas em azul indicam parâmetros definidos pelo usuário;. as outras quantidades são calculadas com base nessas definições. Os volumes finais para cada solução de estoque para fazer um gel são destacadas de laranja. As células brancas contêm fórmulas usadas para calcular os volumes finais com base nos parâmetros definidos pelo usuário. Note-se que uma concentração de 2,2 mM LAP é equivalente a 0,067% em peso.

Descrevemos um processo sequencial para formação mediada por luz e subsequente padronização bioquímica de matrizes de hidrogel sintético para aplicações de cultura de células tridimensionais. A construção e modificação de hidrogéis com química de fotoclique citocompatível é demonstrada. Além disso, são apresentadas técnicas fáceis para quantificar e observar padrões e determinar a viabilidade celular dentro desses hidrogéis.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

O objetivo geral deste procedimento é formar, padronizar e encapsular células dentro de matrizes extracelulares sintéticas baseadas em polímeros. Este método pode ser utilizado para abordar questões biológicas fundamentais relacionadas à identificação de sinais extracelulares que regulam as respostas celulares em microambientes heterogêneos. A principal vantagem desta técnica é que uma matriz sintética robusta é gerada para encapsulação e cultivo celular utilizando protocolos e materiais acessíveis.Este método pode ser utilizado para o cultivo celular controlado e para estudar a resposta celular in vitro. Pode ser aplicado a outros sistemas, incluindo entrega de fármacos e engenharia de tecidos. Prepare os materiais para a formação do hidrogel conforme descrito no protocolo textual.Acople uma lente colimadora à extremidade do guia de luz preenchido com líquido para garantir uma intensidade de luz relativamente uniforme em todas as amostras. Ajuste a distância do guia de luz em relação às amostras para obter um diâmetro de feixe que cubra as amostras de interesse. Para produzir hidrogéis não padronizados, prepare hidrogéis espessos moldados em pontas de seringa pipetando de 10 a 20 microlitros da solução precuradora do gel na ponta de uma seringa estéril cortada.Prepare um único gel por seringa, com espessura aproximada de 0,5 a 1,5 milímetros, com base no volume e no diâmetro da seringa. Prepare hidrogéis finos em moldes de lâminas de vidro colocando a junta de borracha ao redor das bordas da lâmina de vidro não revestida. Em seguida, pipete de cinco a dez microlitros da solução precursora do gel sobre a lâmina de vidro não revestida.E coloque a lâmina de vidro revestida com antiaderente sobre a solução de gel. Fixe as lâminas de vidro com clipes pequenos para estabilizar. Ajuste a intensidade da lâmpada para obter 10 miliwatts por centímetro quadrado na superfície do gel para moldes de ponta de seringa ou moldes de lâmina de vidro.Usando um radiômetro para detectar a intensidade. E posicione os moldes sob a lâmpada. Aplique luz por um a cinco minutos para permitir a polimerização completa dos géis.Utilize um tempo de polimerização mais curto para géis com maior teor de tereftalato de polietileno glicol. E um tempo mais longo para géis com menor teor, a fim de produzir hidrogéis completamente polimerizados com módulos dentro da faixa dos tecidos moles. Coloque os géis dos moldes na ponta da seringa em uma placa estéril de 48 poços não tratada e coloque lâminas de vidro em um recipiente estéril.Para preparar hidrogéis padronizados, prepare a solução precursora conforme descrito no protocolo textual e pipete a solução vigorosamente para garantir uma mistura homogênea. Em seguida, cubra os géis pré-formados com peptídeo de penton com solução de fotoiniciador de fosfato de lítio e incube por uma hora a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova a solução em excesso.Se os géis forem moldados na ponta de uma seringa, use uma espátula para transferi-los cuidadosamente da placa de 48 poços para uma lâmina de vidro estéril para a confecção do padrão. Coloque uma máscara fotográfica com o padrão desejado diretamente sobre a seringa e os géis moldados na lâmina de vidro. Certifique-se de que a parte impressa da máscara entre em contato com o gel para obter fidelidade ideal do padrão.Coloque as amostras sob a lâmpada e irradie por um minuto. Após a padronização, coloque os géis moldados na seringa em uma placa estéril de 48 poços não tratada para cultura de tecidos. Coloque os géis moldados em lâmina de vidro, que estão aderidos às lâminas, em um recipiente estéril.Lave três vezes, durante 15 minutos, com meio de cultura ou tampão apropriado, conforme os experimentos planejados. Para realizar a detecção e quantificação de tióis livres em hidrogéis fotopadronizados, primeiro prepare as soluções e realize os cálculos conforme descrito no protocolo textual. Forme hidrogéis finos para padronização como anteriormente.Em particular, prepare géis com excesso de tióis livres e padronize a metade dessas amostras com o peptídeo pentônico usando uma lamínula transparente para expor completamente todo o gel à luz. Coloque os géis padronizados e não padronizados em poços de uma placa de 48 poços. Lave durante 15 minutos, três vezes, com tampão da reação de Ellman, para permitir a difusão das espécies reagidas para fora do gel e a ocorrência da hidratação em equilíbrio.Adicione tampão extra de reação de Ellman aos géis de lavagem, de modo que o volume do gel inchado com o tampão de reação seja um múltiplo de 20 microlitros. Por exemplo, se o volume previsto do gel inchado for de 15 microlitros, adicione cinco microlitros de tampão de reação. E se o volume previsto do gel inchado for de 30 microlitros, adicione 10 microlitros de tampão de reação.Pipete os padrões de cisteína em poços individuais de uma placa de 48 poços em múltiplos de 20 microlitros. Dependendo do volume utilizado na etapa anterior. Por exemplo, se na etapa anterior o volume do gel inchado, mais o tampão de reação adicional, foi igual a 40 microlitros, adicione 40 microlitros de cada padrão em poços vazios individuais.Em seguida, dilua o reagente de Ellman e o tampão de reação. Adicione o reagente de Ellman diluído às poças contendo os padrões e as amostras. Para amostras de 20 microlitros, adicione 183,6 microlitros de solução a cada poça.Incube ou coloque em agitação por uma hora e trinta minutos, ou até que a cor da solução corresponda à cor dos géis pela inspeção visual, para garantir difusão suficiente do dianion amarelo 2-Nitro-5-tiobenzoico, gerado pela reação do reagente de Ellman com tióis livres provenientes do gel. Transfira 100 microlitros da solução das amostras e padrões para os poços de uma placa de 96 poços. Leia a absorbância em 405 nanômetros em um leitor de placas.Para visualizar os padrões fotográficos, remova o excesso de tampão de reação limpando suavemente as bordas do hidrogel com um lenço de papel. Pipete o reagente de Ellman diretamente sobre a superfície do gel. Imagem imediatamente em um microscópio óptico a 10x ou em um microscópio estereoscópico com câmera colorida.Colete as células e prepare-as para encapsulação conforme descrito no protocolo textual. Imediatamente após a aspiração do PBS, suspenda as células em pellet na solução precursora até uma concentração final de cinco mil células por microlitro. Deixe uma concentração apropriada de tióis livres para reação posterior com o peptídeo pentônico.Se for desejado o confinamento por fotoimpressão, modele, polimerize e padronize os hidrogéis como antes. Lave os géis por 10 minutos, três vezes, em meio de crescimento após a padronização para remover espécies não reagidas e excesso de fotoiniciador de fosfato de lítio.Incubar os géis em meio de crescimento a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2 até o ponto de tempo desejado para análises adicionais. Reabastecer o meio a cada 48 horas, ou conforme determinado pelas aplicações. Para determinar a viabilidade das células encapsuladas, primeiro remover o meio de crescimento dos géis e lavar por 15 minutos, três vezes, com PBS para permitir a difusão do meio a partir dos géis.Adicione dois microlitros da solução descongelada de etídio homodímero-1 a dois milimolares e 0,5 microlitros da solução descongelada de AN de cálcio a quatro milimolares a um mililitro de PBS estéril. Agite em vórtex para garantir a mistura completa. Adicione 300 microlitros da solução preparada a cada molde de gel em seringas nas placas de 48 poços, ou quantidade suficiente para cobrir a superfície do gel em uma lâmina de vidro em um recipiente estéril.E incubar por 45 minutos. Remover a solução em excesso e lavar para remover o corante excedente dos géis. Imagens as células em um microscópio confocal.Ou em um microscópio de epifluorescência com capacidade em 10x e excitação em 488 nanômetros e emissão em 525 nanômetros. A concentração de tióis livres de hidrogéis não padronizados e padronizados quantificada com o teste de Ellman demonstrou que hidrogéis polimerizados inicialmente por um minuto e por cinco minutos possuem concentrações de tióis livres estatisticamente semelhantes, indicando reação rápida e gelificação completa dentro de um minuto.Os géis submetidos posteriormente à padronização em lote, incubados com peptídeos de pentona por 30 minutos, e por uma hora e 30 minutos, apresentam redução de 60 a 80 por cento na concentração de tióis livres, indicando modificação eficiente do tiol em excesso. Os padrões fotográficos formados pela exposição à luz de amostras cobertas com máscaras, impressas aqui com linhas, podem ser observados em duas dimensões com a aplicação do reagente de Ellman. Ou, em três dimensões, com a incorporação de peptídeos fluorescentes na imagem subsequente.Células-tronco humanas adultas encapsuladas em hidrogéis foram tratadas com corantes de viabilidade e hidrotoxicidade. E foram analisadas por microscopia confocal. Células viáveis sem danos na membrana são marcadas em verde e indicam a sobrevivência das células um dia após a encapsulação.As células começam a se espalhar pela matriz seis dias após a encapsulação. Conforme mostrado na imagem inserida. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter procedimentos estéreis e cuidadosos de manipulação para evitar danos às células após a encapsulação, por meio da introdução de contaminantes ou cisalhamento mecânico.Após este procedimento, outros métodos como citometria de fluxo com imunomarcação e expressão gênica podem ser realizados para estudar a função e o destino celular em resposta ao ambiente extracelular. Esta técnica abre caminho para pesquisadores nas áreas de biologia, bioengenharia e medicina, possibilitando o estudo da erosão de regiões teciduais ou da progressão de doenças em matrizes extracelulares sintéticas com controle de propriedades definido pelo usuário, visando o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como encapsular células e padronizar matrizes macias para estudos de cultura celular controlada.

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Bioengineering

Bioengenharia

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Técnicas simples são descritos para a produção rápida de microfabricated sistemas de cultura neural usando um dispositivo de microespelhos digitais para litografia dinâmica máscara de projeção em substratos de cultura de células regulares. Estes sistemas cultura pode ser mais representativo da arquitectura biológica natural, e as técnicas descritas podem ser adaptadas para inúmeras aplicações.

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