Citoplasmática microinjeção no gado zigotos assistida laser

O objetivo geral deste procedimento é fornecer soluções eficazes no citoplasma de zigotos de gado usando uma agulha de ponta romba com o auxílio de um laser. Este método é utilizado em pesquisas e no campo da transgênese animal, uma vez que se está associado a uma ferramenta de edição de genoma, como um sistema CRISPR Cas9, pode criar novas vacas para estudar a função gênica e animais transgênicos de uma forma muito simples e confiável. A principal vantagem desta técnica é que ela pode ser usada para entregar qualquer solução em um citoplasma de zigotos de animais grandes.

Com uma pessoa prática, a eficiência da injeção minimiza as taxas de lomotil do fígado animal. Primeiro, prepare a micropipeta de injeção colocando um capilar de vidro borossilicato em um extrator de micropipeta e travando-o no lugar. Use um programa apropriado para puxar o capilar para que resulte em uma ponta fina com um cone longo.

Em seguida, remova cuidadosamente as pipetas puxadas do dispositivo e coloque-as em uma microforja na posição horizontal. Traga a pipeta puxada e o filamento do aquecedor microforge, com seu grânulo de vidro, em foco. Use o retículo da ocular para medir a espessura desejada e mova a pipeta horizontalmente até que o filamento do aquecedor atinja o diâmetro interno alvo de cinco micrômetros.

Ajuste o calor para cerca de 45% e abaixe suavemente a pipeta para que toque o filamento. Em seguida, ative brevemente o aquecedor. Isso derreterá levemente a pipeta para que ela adira ao filamento e, ao esfriar, a pipeta quebrará no ponto de contato, gerando um corte reto.

Definir a temperatura certa é fundamental nesta etapa. Temperaturas muito altas dobrarão a pipeta, enquanto temperaturas muito baixas não serão suficientes para cortar a pipeta. Em seguida, faça um ângulo aproximado de 30 graus perto da ponta da pipeta, posicionando a ponta a cerca de 10 micrômetros de distância do filamento do aquecedor.

Defina a temperatura para 60%e ative o aquecedor para que a pipeta se dobre sobre o filamento no ângulo desejado. Usando as configurações mostradas aqui, puxe um capilar de vidro que resulte em uma micropipeta com uma ponta fina com paredes longas e uniformes e paralelas. Remova cuidadosamente a pipeta puxada do dispositivo extrator e coloque-a no suporte da microforja na posição horizontal.

Use o retículo da ocular para medir o diâmetro da pipeta e mova a pipeta até que seu diâmetro sobre o filamento atinja 180 micrômetros. Marque o capilar de vidro com uma caneta com ponta de diamante e, em seguida, pressione suavemente a ponta puxada para quebrar o vidro. Isso deve resultar em um corte reto.

Em seguida, mova a pipeta para a posição vertical, com a ponta próxima ao filamento. Defina a temperatura da microforja para 60% e polir a ponta da pipeta, usando técnicas padrão até que o diâmetro interno atinja o tamanho desejado. Meça o diâmetro interno da pipeta, que deve ser de 40 micrômetros.

Usando o mesmo procedimento de antes, dobre a ponta em um ângulo de 30 graus. Insira a pipeta de retenção no suporte esquerdo do micromanipulador e a pipeta de injeção no suporte direito da micromanipulação. Em seguida, encha a pipeta de injeção com óleo.

Use os controles do micromanipulador para trazer as pipetas para o centro do campo de visão do microscópio. Usando uma ampliação de 4X, verifique se as pontas da micropipeta estão no ângulo correto para que fiquem paralelas ao fundo do prato. Coloque uma gota de 50 microlitros de solução SOF-HEPES de 37 graus Celsius, que é suplementada com 20% de FBS no centro da tampa de uma placa de Petri de 100 milímetros.

Em seguida, coloque uma gota de um a dois microlitros da solução a ser injetada perto da gota de injeção. Em seguida, cubra as gotas e a placa de injeção usando aproximadamente 10 mililitros de óleo mineral. Coloque a placa no microscópio stage e use um microdispensador para carregar cerca de 20 a 30 zigotos na parte superior da gota de injeção.

Usando a objetiva 4X, carregue a solução a ser injetada na pipeta de injeção aplicando pressão negativa no microinjetor. Carregue uma quantidade suficiente de solução para injetar dois a três zigotos e, em seguida, vá para a gota de injeção. Dentro da gota de injeção, mova a pipeta de retenção para que a ponta se aproxime de um zigoto.

Aplique pressão negativa com o microinjetor de retenção para que o zigoto seja fixado à pipeta de retenção. Quando o zigoto estiver seguro, mude para uma objetiva de 20X. Verifique se a pipeta de injeção está posicionada no plano médio do embrião, tocando suavemente o zigoto no local da injeção.

Se não estiver em seu plano médio, a agulha tenderá a fazer o embrião girar, em vez de perfurar. Em seguida, use um software para colocar o laser na vertical na zona pelúcida onde o furo será feito. Uma vez posicionado corretamente, use a janela de controle do laser e clique no botão FIRE.

Certifique-se de que o tamanho do orifício seja grande o suficiente para criar uma abertura na zona pelúcida para a passagem da agulha sem danificar a membrana plasmática. Passe a agulha de injeção pelo orifício na zona pelúcida e entre em contato com a membrana plasmática. Continue empurrando a pipeta para frente até que a agulha esteja a 3/4 do caminho para dentro do embrião.

Observe a posição do menisco na interfase do óleo da solução. Isso será usado para controlar consistentemente o volume de injeção. Aplique pressão negativa na pipeta de injeção para aspirar a membrana plasmática e o citoplasma para a agulha de injeção.

Continue até que o movimento do citoplasma na agulha acelere ou quando o conteúdo do citoplasma, misturando-se com a solução injetável, possa ser visto. Isso indicará a quebra da membrana plasmática. Injete de volta o conteúdo citoplasmático, seguido pela solução no citoplasma do zigoto, aplicando pressão positiva até que o menisco na interfase do óleo da solução tenha avançado o diâmetro equivalente de um zigoto além do ponto inicial.

Em seguida, mude para uma objetiva 4X e mova o embrião injetado para o lado inferior da gota de injeção. Libere o embrião aplicando pressão positiva no microinjetor de retenção. Colete os embriões injetados usando um microdispensador.

Lave os embriões injetados movendo-os através das três gotas de SOF-HEPES e cultive-os, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. A entrega bem-sucedida da solução é visível na imagem fluorescente, onde o vermelho dexion é usado para rastrear o local da injeção e a eficiência e precisão da injeção. Aqui, o corante é distribuído de forma homogênea no citoplasma, o que é típico ao usar essa técnica.

Este protocolo tem taxas mínimas de lise em zigotos bovinos e ovinos. Poucos dos embriões injetados foram lisados em bovinos ou ovinos como resultado da microinjeção. Além disso, não há diferenças estatisticamente significativas nas taxas de desenvolvimento de blastocisto nos grupos controle versus injetado para embriões bovinos e ovinos.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita a uma taxa de dois embriões por minuto. Com uma eficiência de injeção de pessoa prática, minimiza as taxas de blastocisto animal. Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como realizar a microinjeção intracitoplasmática assistida por laser em zigotos de gado.

E também como usar pressão de sucção positiva e negativa para garantir a ruptura da membrana plasmática para uma entrega eficiente.