Única molécula-Super-Resolution Imaging da fosfatidilinositol 4,5-bifosfato na membrana plasmática com o romance fluorescentes Sondas
15 de outubro de 2016
PI (4,5) P 2 regula várias funções celulares, mas a sua organização em nanoescala na membrana plasmática da célula é mal compreendida. Por rotulagem PI (4,5) P 2 com uma sonda fluorescente de duas cores fundido com o domínio de homologia plecstrina, descrevemos uma nova abordagem para estudar o PI (4,5) P 2 em distribuição espacial da membrana plasmática em escala nanométrica .
O objetivo geral deste trabalho é emitir a distribuição em nanoescala de fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato na membrana plasmática celular usando microscopia de localização de fluorescência de molécula única. Este método ajuda a responder a perguntas-chave sobre a sinalização de fosfoinositídeos. Como qual é a organização em nanoescala de fosfoinositídeos sob o complexo de sinalização na membrana celular?
As principais vantagens desta técnica são a alta resolução espacial e o desvio do tratamento com detergente, que é uma grande preocupação nos estudos morfológicos de fosfolipídios. Essa abordagem inclui três etapas principais. Primeiro passo: A preparação da folha de membrana plasmática a partir de células vivas.
Etapa dois: Marcação de fosfoinositídeos e imagens de florescência de molécula única. Etapa três: Localização de molécula única e reconstrução de imagem. No dia do experimento, lamínulas de cobertura com meio a um mililitro de PDL.
Uma ou duas horas depois, absorva o excesso de PDL com papel de seda da borda da lamínula. Em seguida, guarde as lamínulas em uma placa de metal a quatro graus Celsius. Em seguida, lave as células INS-1 pré-transspectadas que foram cultivadas em lamínulas com meio a um mililitro de PBS gelado contendo um EGTA milimolar.
Repita esta lavagem três vezes e absorva o excesso de PBS. Agora, usando uma pinça, coloque as lamínulas com as células cultivadas nas lamínulas revestidas com PDL, com o lado da célula voltado para baixo. Faça isso na placa de metal resfriada.
Em seguida, transfira a placa para quatro graus Celsius por sete a dez minutos para dar tempo às células de se fixarem. Em seguida, use uma pinça para retirar suavemente a lamínula carregada com células, o que deixará para trás uma fina camada de membrana celular na lamínula revestida com PDL. Em seguida, lave suavemente as folhas de membrana com meio a um mililitro de PBS gelado.
Agora fixe cada folha de membrana em aproximadamente 150 microlitros de PFA gelado a quatro por cento com 0,2 por cento de glutaraldeído em PBS. Deixe as membranas se fixarem por 15 minutos a quatro graus Celsius. Após a fixação, proceda imediatamente à imagem ou cubra as preparações com PBS gelado e armazene-as a quatro graus Celsius.
Se as sondas de pH estiverem em uso, a imagem imediata é altamente recomendada. Para este procedimento, um sistema SMLM baseado em microscópio TIRF é colocado em uso. Antes de obter imagens das membranas, diluir um microlitro de solução fluorescente em 10 mililitros de PBS com 50 milimolares de cloreto de magnésio.
Em seguida, carregue uma amostra na câmara de imagem e adicione 200 microlitros da solução diluída e aguarde 10 minutos. Em seguida, lave a amostra com PBS três vezes. Agora inicie o sistema de imagem PALM.
No software de imagem associado, selecione o botão do canal iRFP. Em seguida, encontre a membrana celular que expressa as sondas de pH no canal iRFP, use as esferas fluorescentes para correção de desvio. Defina um ângulo TIRF normal como 2140, que é 1,5 mais profundo que o ângulo crítico do TIRF e deve ser o ângulo padrão.
Em seguida, use o botão de captura para coletar uma imagem TIRF convencional no canal iRFP como referência. Em seguida, mude para o canal PAm-Cherry1 clicando no botão do canal RFP. Em seguida, ajuste a barra de rolagem no pad AOTF totalmente para a direita para iluminação total e aplique o laser por cerca de 10 a 20 segundos para branquear a florescência da membrana de fundo.
Em seguida, defina a configuração ideal da câmera na guia de formato para dois por dois. Em seguida, defina o protocolo de aquisição rápida na guia ND Sequence Acquisition para 30.000 imagens a 20 hertz. Em seguida, aplique 0,1 a um por cento de potência ao laser de 405 nanômetros durante a aquisição da imagem para que pontos espacialmente isolados em cada quadro sejam facilmente identificáveis.
Agora adquira imagens PAm-Cherry1 clicando no botão Executar agora. O número de moléculas que podem ser ativadas diminuirá gradualmente durante as aquisições. Em resposta, aumente gradualmente a intensidade do laser de 405 nanômetros para manter uma densidade ideal de sinais.
Adquira imagens até que todo o sinal PAm-Cherry1 seja ativado. Posteriormente, ao passar pelo processamento e reconstrução da imagem, identifique e localize os eventos moleculares individuais de cada quadro. Defina o limite de intensidade de filtragem com o número do limite na wavelet.
Mais detalhes são fornecidos no protocolo de texto. A distribuição espacial de PIP2 é sensível a diferentes fixações com fixação adequada descrita no texto, as sondas PIP2 mostraram uma distribuição consistente quando marcadas por anticorpos PIP2 ou domínios de pH específicos. Em comparação, as células vivas marcadas com domínios de pH marcados com EGFP não apresentam imagens muito diferentes.
Todas as amostras apresentaram uma distribuição uniforme das sondas. Em contraste, a fixação não ideal resultou em clusters PIP2 de densidade aguda e uma diminuição na intensidade do sinal. Sob condições ideais de fixação, as imagens de super-resolução de PIP2 em células fixas revelaram uma distribuição homogênea de sondas em uma porção significativa da membrana plasmática com apenas gradientes de concentração limitados.
Alguns remendos de membrana enriquecidos com sondas PIP2 foram esparsamente distribuídos e tinham vários tamanhos. As imagens PALM de células vivas exibiram uma distribuição espacial semelhante às células fixas. A análise detalhada dos sinais PIP2 revelou que sua dinâmica era rápida em áreas locais, mas isso não resultou em mudanças significativas em sua abundância geral.
Esta técnica introduz uma nova maneira para os pesquisadores no campo dos fosfolipídios explorarem a distribuição e a atividade de outros subtipos de fosfoinositídeos em condições fisiológicas.
Visão Geral
Este estudo investiga a distribuição em escala nanométrica do fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PI(4,5)P2) na membrana plasmática celular utilizando microscopia de localização de fluorescência de molécula única. O método fornece informações sobre o sinalização de fosfoinositídeos e a organização dos fosfoinositídeos nas membranas celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Microscopia de Fluorescência
Contexto
- O PI(4,5)P2 desempenha um papel crucial em diversas funções celulares.
- A organização em nanoescala do PI(4,5)P2 na membrana plasmática não é bem compreendida.
- As técnicas existentes frequentemente envolvem tratamento com detergente, o que pode afetar a morfologia dos fosfolipídios.
- Este estudo tem como objetivo superar essas limitações utilizando uma nova abordagem de imagem.
Objetivo do Estudo
- Elucidar a distribuição em escala nanométrica do PI(4,5)P2 na membrana plasmática.
- Explorar a dinâmica da sinalização por fosfoinositídeos.
- Desenvolver um método que evite o tratamento com detergentes para melhores estudos morfológicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de lâminas de membrana plasmática a partir de células vivas.
- Marcação de fosfoinositídeos e obtenção de imagens usando microscopia de fluorescência de molécula única.
- Aquisição e processamento de imagens para localizar eventos moleculares individuais.
- Comparação de métodos de fixação para avaliar seu impacto na distribuição de PI(4,5)P2.
Resultados Principais
- Condições de fixação ideais revelaram uma distribuição homogênea do PI(4,5)P2 na membrana plasmática.
- A fixação não ideal resultou em aglomerados densos e diminuição da intensidade do sinal.
- A microscopia em tempo real mostrou padrões espaciais semelhantes aos observados em células fixadas.
- As dinâmicas do PI(4,5)P2 foram rápidas em áreas locais, sem alterações significativas na abundância global.
Conclusões
- O estudo apresenta um novo método para explorar a distribuição de fosfoinositóis.
- Os resultados aprimoram a compreensão da sinalização por fosfoinositóis em condições fisiológicas.
- Essa técnica pode ser aplicada para investigar outros subtipos de fosfoinositóis.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a organização em escala nanométrica de fosfoinositídeos como o PI(4,5)P2 é essencial para reduzir os riscos na validação de alvos em vias de transdução de sinal. Este método permite obter informações mecanicistas sobre a dinâmica dos lipídios da membrana sem artefatos induzidos por detergentes, aumentando a confiança preditiva no estágio inicial da descoberta. Ele aborda um ponto crítico na validação de alvos ao esclarecer a organização espacial relevante para as interações fármaco-alvo na membrana plasmática.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao revelar a organização espacial do PI(4,5)P2, um regulador-chave de canais iônicos e complexos de sinalização.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos biológicos por meio da visualização direta da organização de nanodomínios lipídicos em ambientes de membrana semelhantes aos naturais.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer clareza mecanicista sobre alvos dependentes de fosfoinositídeos em condições fisiológicas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados (lâminas de membrana fixadas e células vivas) para ensaios de triagem posteriores direcionados a compostos que modulam fosfoinositóis.
- Valor Operacional: Fornece leituras espaciais quantitativas de super-resolução que aprimoram a padronização e reprodutibilidade dos ensaios.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma entre subtipos de fosfoinositóis, permitindo avaliação consistente de compostos em pipelines de descoberta.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Mantém a fidelidade do sistema relevante para doenças ao preservar a distribuição de PI(4,5)P2 na imagem de células vivas, apoiando a extrapolação para modelos pré-clínicos.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece se os efeitos de sinalização observados decorrem da reorganização dos lipídios e não de alterações na abundância, refinando a confiança no alvo.
- Confiança Preditiva: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao vincular a dinâmica de lipídios em escala nanométrica a desfechos funcionais em contextos fisiopatológicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação da hipótese do alvo até o desenvolvimento de ensaios e a validação mecanicista pré-clínica, especialmente para alvos envolvendo sinalização por fosfoinositóis.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao resolver a organização em escala nanométrica do PI(4,5)P2 em microdomínios da membrana plasmática.
- Triagem: Fornece dados espaciais quantitativos prontos para ensaios e reprodutíveis, essenciais para triagem confiável de compostos frente a alvos que modulam lipídios.
- Análises: Oferece localização de moléculas individuais e saídas de reconstrução que permitem comparar a distribuição de lipídios sob diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica por meio de imagem em tempo real de células vivas que reflete os padrões de distribuição em células fixadas sob condições fisiológicas.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de imagem reutilizável para investigar múltiplos subtipos de fosfoinositídeos, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante entre projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de sinalização mediadas por fosfoinositídeos.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos otimizados para fixação e imagem individual de moléculas corrigida para desvios.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao esclarecer mecanismos dependentes de lipídios, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados do desenvolvimento de alvos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na organização espacial validada de lipídios sinalizadores chave nas membranas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microscopia de localização de molécula única e preparação de lâminas de membrana plasmática.
- Requer um sistema SMLM baseado em TIRF com ativação a laser e correção de deslocamento usando microesferas fluorescentes.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de fixação para evitar agrupamentos artificiais dos sinais de PI(4,5)P2.
- Requer considerações de adaptação ao estender o método a outros subtipos de fosfoinositídeos ou modelos celulares relevantes para doenças.
- Limitação prática: A interpretação do sinal deve levar em conta as dinâmicas locais rápidas que não alteram a abundância total do lipídio, conforme observado em dados de células vivas.
