Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia
30 de setembro de 2016
as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.
O objetivo geral deste procedimento é isolar de forma eficiente um RNA específico com as proteínas que estão associadas a ele in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o metabolismo e a regulação do RNA, como, por exemplo, quais são o conjunto distinto de proteínas de ligação ao RNA ligadas a um transcrito particular. A principal vantagem desta técnica é a alta eficiência de isolamento, o que permite a identificação subsequente de proteínas associadas ao RNAm de interesse.
A metodologia rápida utiliza uma linhagem de levedura que coexpressa ARNm marcado com MS2 e uma proteína de fusão de uma proteína ligante de MS2 e uma proteína ligante de estreptavidina. Cultive 500 mililitros de células de levedura a 30 graus Celsius em meio seletivo dextrose sintético ou SD até uma OD600 de 0,8 a 1,0. Quando as células estiverem prontas, centrifugue a 3000 vezes G durante 4 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
Lave as células com PBS e centrifugue novamente. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em um volume igual de SD sem metionina. Incube por 45 a 60 minutos a 30 graus Celsius para induzir a expressão da proteína de fusão.
Após 45 a 60 minutos, reserve 10 mililitros das células para extração de RNA e utilize as células restantes para purificação rápida. Para iniciar este procedimento, adicione às células 1,35 mililitro de formaldeído a 37%, para uma concentração final de 0,1%, a fim de promover a reticulação dos complexos RNA-proteína. Continue a incubação a 30 graus Celsius por 10 minutos.
Para interromper a reticulação, adicione 26,5 mililitros de glicina 2,5 molar, até uma concentração final de 0,125 molar, e incube a 30 graus Celsius por 3 minutos. A partir deste ponto, mantenha tudo em gelo e trabalhe rapidamente para minimizar a degradação do RNA. Centrifugue as células a 3000 ×g por 4 minutos a 4 graus Celsius.
Descarte o sobrenadante, adicione 45 mililitros de PBS frio e centrifugue novamente. Remova o sobrenadante e re-suspenda as células em 5 mililitros de tampão de lise rápida que contém uma alta concentração de inibidores de RNase. Divida a suspensão celular em alíquotas de 500 microlitros em tubos microcêntrifugos com tampa de rosca e adicione aproximadamente 400 miligramas de esferas de vidro previamente resfriadas a cada alíquota.
Lise as células em um homogeneizador por três minutos. Coloque imediatamente o lisado em gelo. Transfira o lisado para novos tubos de microcentrífuga.
Corte a parte superior de uma seringa de 5 mililitros e coloque-a em um tubo vazio de 15 mililitros para servir como adaptador para tubos com tampa rosqueável. Use uma agulha aquecida para perfurar um pequeno orifício na base de cada tubo e posicione-os sobre os tubos de 15 mililitros adaptados. Centrifugue os conjuntos de tubos a 3000 ×g por um minuto a 4 °C para eluir o lisado para os tubos de 15 mililitros.
Transfira o fluxo passante de cada tubo de 15 mililitros para um novo tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos a 4 graus Celsius para remover os detritos celulares. Reúna o sobrenadante de todos os tubos de 1,5 mililitro em um único tubo de 15 mililitros. Reserve um volume de 1/50 e 1/100 do lisado para isolamento de RNA e proteína, respectivamente.
Inicie o procedimento rápido para isolamento de complexos de RNA e proteína adicionando 300 microgramas de Avidina ao lisado celular. Incube por 30 minutos a 4 graus Celsius com rolagem constante. Enquanto o lisado celular está em incubação com a Avidina, pré-lave as microesferas de estreptavidina, transfira cerca de 300 microlitros da suspensão de microesferas de estreptavidina para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, centrifugue a preparação e, em seguida, remova o sobrenadante superior, o que resultará em 250 microlitros de microesferas.
Adicione 1 mililitro de tampão de lise rápida às esferas e centrifugue a 660 × g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Remova o sobrenadante e lave novamente com tampão de lise rápida. Para bloquear as esferas, adicione 0,5 mililitros de tampão de lise rápida, 0,5 mililitros de BSA e 10 microlitros de TRNA de levedura e incube por 1 hora a 4 graus Celsius com rotação constante.
Lave as microesferas duas vezes com 1 mililitro de tampão de lise rápido. Adicione 250 microlitros das microesferas de estreptavidina pré-lavadas ao lisado contendo avidina e incube por 1 hora a 4 graus Celsius com rotação constante. Esse tempo de incubação é um compromisso entre fornecer tempo suficiente para ligação e minimizar as chances de degradação do RNA.
Após uma hora, centrifugue a 660 vezes G durante 2 minutos a 4 graus Celsius para remover as microesferas de estreptavidina. Transfira o sobrenadante para um tubo de 15 mililitros. Reserve 1/50 e 1/100 do volume do lisado para isolamento de RNA e proteína, respectivamente.
Adicione 1 mililitro de tampão de lise rápida às esferas. Misture por pipetagem, transfira para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e centrifugue a 660 ×g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Lave mais três vezes com tampão de lise rápida.
Após a última lavagem com o tampão de lise rápida, remova o sobrenatante, adicione 1 mililitro do tampão de lavagem rápida e incube em rotação durante 5 minutos a 4 graus Celsius. Centrifugue e lave mais 2 vezes com o tampão de lavagem rápida. Lave as microesferas com 1 mililitro de PBS e centrifugue como anteriormente.
Remova o sobrenatante, adicione aos grânulos 120 microlitros de PBS e agite por 5 minutos em um agitador rotativo. Centrifugue como antes e colete todo o sobrenatante para extração de RNA e proteína como amostra de lavagem. Para eluir o RNA e as proteínas associadas ao RNA, adicione 120 microlitros de biotina 6 milimolar em PBS aos grânulos e incube por 45 minutos a 4 graus Celsius com rotação constante.
Centrifugue as esferas e transfira o material eluído para um novo tubo de 1,5 mililitro. Centrifugue a amostra eluída novamente e transfira a fase superior para um novo tubo de 1,5 mililitro para garantir que não haja arraste de esferas. Retire amostras para extração de RNA ou proteína.
Para determinar a eficiência de isolamento e a qualidade do RNA, foi realizada uma análise de Northern para dois RNAs marcados, PMP1 e FPR1, provenientes da lise de células coletadas, lise rápida de células e após a eluição com biotina. Os RNAs ribossomais foram detectados por coloração com brometo de etídio, e a ausência de RNAs ribossomais na amostra de eluição indica a rigidez da purificação.
A rigidez e especificidade da purificação são ainda demonstradas pela ausência de sinal de um RNAm não marcado nas amostras de eluição. O sinal aparente na fileira de FPR1, que não possui o tamanho de ACT1, é um resíduo da hibridização anterior com a sonda MS2L. Embora o RNA de entrada esteja um pouco mais degradado em comparação com o RNA purificado pelo protocolo de Fenol Quente, uma quantidade significativa de RNA marcado de comprimento completo é isolada especificamente, conforme revelado pelo forte sinal nas frações de eluição.
As amostras de proteínas podem ser analisadas por SDS-PAGE e coloração com prata antes da análise de proteômica. A proteína de fusão MS2-CP-GFP-SBP, indicada pela seta, demonstra uma carga proteica igual. Os asteriscos indicam bandas com intensidades diferenciais que foram posteriormente recortadas do gel para análise por espectrometria de massas.
Ao realizar este procedimento, é importante usar luvas, garantir uma área de trabalho limpa, preparar as soluções com água livre de RNase e trabalhar de forma rápida e eficiente para reduzir o tempo do protocolo. Não se esqueça de que o trabalho com reagentes como fenol e formaldeído pode ser extremamente perigoso, e precauções, como trabalhar em uma capela química, devem sempre ser tomadas ao executar este procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar de forma eficiente e eficaz o RNA de fayn-tress e seu corpo associado.
Após este procedimento, outros métodos como o RNA-Seq podem ser realizados para detectar RNAs que se ligam ao transcrito de interesse.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método in vivo para o isolamento de RNA específico juntamente com suas proteínas associadas. Esta técnica tem como objetivo aprimorar nossa compreensão da regulação do RNA dentro das células.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Interações RNA-proteína
- Processos celulares
- Metabolismo do RNA
Antecedentes
- As interações RNA-proteína são cruciais para diversas funções celulares.
- Compreender essas interações pode fornecer insights sobre a regulação do RNA.
- Os métodos existentes podem apresentar falta de eficiência no isolamento de complexos específicos de RNA-proteína.
- Este estudo apresenta uma abordagem inovadora utilizando cepas de levedura.
Objetivo do Estudo
- Isolar RNA específico e identificar proteínas associadas in vivo.
- Responder perguntas relativas ao metabolismo e regulação do RNA.
- Melhorar a eficiência das técnicas de isolamento de RNA-proteína.
Métodos Utilizados
- Utilização de uma linhagem de levedura coexpressando mRNA marcado com MS2.
- Proteína de fusão da proteína ligante de MS2 e da proteína ligante de estreptavidina.
- Cultivo de células de levedura em meio sintético com dextrose.
- Centrifugação para isolamento de complexos RNA-proteína.
Resultados Principais
- Obteve-se alta eficiência no isolamento de complexos RNA-proteína.
- Foi facilitada a identificação de novas proteínas associadas ao mRNA.
- O método permite o processamento rápido de amostras.
- Obtiveram-se informações sobre a regulação do RNA por meio desta abordagem.
Conclusões
- Este método fornece uma ferramenta valiosa para o estudo das interações RNA-proteína.
- Ele aprimora nossa compreensão do metabolismo e da regulação do RNA.
- Aplicações futuras podem levar a descobertas em processos celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação de proteínas que ligam RNA (RBPs) associadas a transcritos específicos é fundamental para a validação de alvos em terapias com RNA e na descoberta de biomarcadores. A metodologia RaPID permite o isolamento eficiente de complexos RNA-proteína in vivo, apoiando a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer interações funcionais em um sistema relevante para a doença. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, fornecendo dados quantitativos e reprodutíveis sobre associações entre RBP e mRNA.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao identificar PBORs ligadas a RNAm relevantes para doenças, como o PMP1 associado ao retículo endoplasmático.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho reprodutível para o isolamento de complexos nativos de RNA-proteína de levedura, reduzindo falsos positivos provenientes de métodos in vitro.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo por meio da captura específica e de alta eficiência de interações in vivo, auxiliando na triagem de portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos validados (linhagens de levedura expressando RNA marcado com MS2 e proteína de fusão) para aplicações de triagem posteriores.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento complexo por meio de precipitação com microesferas de estreptavidina, melhorando a reprodutibilidade entre experimentos.
- Prontidão para Ensaios: Produz frações purificadas de RNA e proteína adequadas para análise quantitativa por espectrometria de massa ou hibridização Northern.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a identificação de PBPs na fase de descoberta à validação pré-clínica, permitindo análises complementares como RNA-Seq e SDS-PAGE.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Demonstra rigor e especificidade pela ausência de sinais de RNA ribossômico e de mRNA não marcado nas amostras de eluição.
- Sistema Relevante para Doenças: Aplicável a modelos de levedura do metabolismo de RNA, com potencial adaptação para sistemas mamíferos na validação de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método RaPID insere-se na fase inicial do descobrimento, apoiando a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos antes da identificação de compostos líderes e da validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses mediante o isolamento de complexos específicos de RNA-proteína de condições in vivo, esclarecendo associações funcionais.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios por meio do isolamento padronizado de complexos RNA-proteína, apoiando triagens reprodutíveis de compostos ou genéticas.
- Análises: Gera resultados quantitativos por espectrometria de massa e análise de Northern blot, permitindo a comparação da abundância de RBPs entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao fornecer complexos purificados para validação posterior em modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para a descoberta de RBPs em múltiplos transcritos, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na regulação do RNA.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade por meio de etapas definidas de reticulação, lise e purificação baseada em microesferas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao fornecer dados confiáveis sobre interações entre RBPs e mRNA, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em associações validadas de RBPs em contextos relevantes para doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia molecular, cultivo de leveduras e técnicas de interação RNA-proteína.
- Exige instrumentação para reticulação (formaldeído), separação baseada em microesferas e centrifugação em múltiplas velocidades.
- Exige padronização entre equipes quanto à composição do tampão de lise e ao uso de inibidores de RNase para garantir reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o método de leveduras para outros sistemas modelo, particularmente no que se refere à marcação e expressão de proteínas de fusão.
- Inclui limitações práticas, como o risco de degradação do RNA durante o processamento e a necessidade de manipulação rápida e sob refrigeração para manter a integridade do complexo.
