Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia
30 de setembro de 2016
as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.
O objetivo geral deste procedimento é isolar eficientemente RNA específico com proteínas associadas ao RNA in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no metabolismo e regulação do RNA, como o que é um conjunto distinto de fau-abelha-xixi ligado a um transcrito específico. A principal vantagem desta técnica é a alta eficiência de isolamento, que permite a identificação de acompanhamento de proteínas nobres associadas ao mRNA.
A metodologia rápida utiliza uma cepa de levedura que co-expressa o MRNA marcado com MS2 e uma proteína de fusão de uma proteína de ligação a MS2 e uma proteína de ligação à estreptavadina. Cultive 500 mililitros de células de levedura a 30 graus Celsius em dextrose sintética ou meio seletivo SD para um OD600 de 0,8 a 1,0. Quando as células estiverem prontas, centrifugue a 3000 vezes G por 4 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
Lave as células em PBS e centrifugue novamente. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células num volume igual de SD sem metionina. Incubar por 45 a 60 minutos a 30 graus Celsius para induzir a expressão da proteína de fusão.
Após 45 a 60 minutos, reserve 10 mililitros das células para extração de RNA e use as células restantes para purificação rápida. Para iniciar este procedimento, adicione às células 1,35 mililitros de 37% de formaldeído, a uma concentração final de 0,1% para reticular os complexos RNA-proteína. Continue incubando a 30 graus Celsius por 10 minutos.
Para interromper a reticulação, adicione 26,5 mililitros de glicina 2,5 molar, a uma concentração final de 0,125 molar, e incube a 30 graus Celsius por 3 minutos. A partir daqui, mantenha tudo no gelo e trabalhe rapidamente para minimizar a degradação do RNA. Centrifugue as células a 3000 vezes G por 4 minutos a 4 graus Celsius.
Descarte o sobrenadante, adicione 45 mililitros de PBS frio e centrifugue novamente. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 5 mililitros de tampão de lise rápida que contém uma alta concentração de inibidores de Rnase. Divida a suspensão celular em alíquotas de 500 microlitros em tubos de microcentrífugas com tampa de rosca e adicione aproximadamente 400 miligramas de contas de vidro resfriadas a cada alíquota.
Lisar as células em um batedor de contas por três minutos. Coloque imediatamente o lisado no gelo. Transfira o lisado para novos tubos de microcentrífugas.
Corte a parte superior de uma seringa de 5 mililitros e coloque-a em um tubo vazio de 15 mililitros para servir como adaptador para tubos com tampa de rosca. Use uma agulha quente para fazer um pequeno orifício no fundo de cada tubo e coloque-os em cima dos tubos de 15 mililitros adaptados. Centrifugue os conjuntos de cubas a 3000 vezes G por um minuto a 4 graus Celsius para eluir o lisado para os tubos de 15 mililitros.
Transfira o fluxo de cada tubo de 15 mililitros para um novo tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 10.000 vezes G por 10 minutos a 4 graus Celsius para limpar os detritos celulares. Agrupe o sobrenadante de todos os tubos de 1,5 mililitro em um único tubo de 15 mililitros. Separe 1/50 e 1/100 do volume do lisado para isolamento de RNA e proteína, respectivamente.
Inicie o procedimento rápido para isolar complexos de proteínas de RNA adicionando 300 microgramas de Avidina ao lisado celular. Incube por 30 minutos a 4 graus Celsius sob rolamento constante. Enquanto o lisado celular está sendo incubado com Avidin, pré-lave os grânulos de estreptavidina, transfira cerca de 300 microlitros da pasta de grânulos de estreptavidina para pesar 1,5 mililitros de tubo de microcentriuge, centrifugue a preparação e, em seguida, remova o sobrenadante superior, o que resultará em 250 microlitros de grânulos.
Adicione 1 mililitro de tampão de lise rápida aos grânulos e centrifugue a 660 vezes G por 2 minutos a 4 graus Celsius. Remova o sobrenadante e lave novamente com tampão de lise rápida. Para bloquear as contas, adicione 0,5 mililitros de tampão de lise rápida, 0,5 mililitros de BSA e 10 microlitros de TRNA de levedura e incube por 1 hora a 4 graus Celsius com rotação constante.
Lave as contas duas vezes com 1 mililitro de tampão de lise rápida. Adicione 250 microlitros de grânulos de estreptavidina pré-lavados ao lisado contendo avidina e incube por 1 hora a 4 graus Celsius com rotação constante. Este tempo de incubação é um compromisso entre fornecer tempo de ligação suficiente e minimizar as chances de degradação do RNA.
Após uma hora, centrifugue a 660 vezes G por 2 minutos a 4 graus Celsius para limpar os grânulos de estreptavidina. Transferir o sobrenadante para um tubo de 15 mililitros. Separe 1/50 e 1/100 do volume do lisado para isolamento de RNA e proteína, respectivamente.
Adicione 1 mililitro de tampão de lise rápida às contas. Misturar por pipetagem, transferir para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros e centrifugar a 660 vezes G durante 2 minutos a 4 graus Celsius. Lave mais três vezes com tampão de lise rápida.
Após a lavagem final com tampão de lise rápida, remova o sobrenadante, adicione 1 mililitro de tampão de lavagem rápida e gire por 5 minutos a 4 graus Celsius. Centrifugue e lave mais 2 vezes com tampão de lavagem rápida. Lave as esferas com 1 mililitro de PBS e centrifugue como antes.
Remova o sobrenadante, adicione aos grânulos 120 microlitros de PBS e gire por 5 minutos em um rolo. Centrifugue como antes e colete todo o sobrenadante para extração de RNA e proteína como amostra de lavagem. Para eluir o RNA e as proteínas associadas ao RNA, adicione 120 microlitros de biotina 6 milimolar em PBS às esferas e incube por 45 minutos a 4 graus Celsius com rotação constante.
Centrifugue os grânulos e transfira o material iludido para um novo tubo de 1,5 mililitro. Girar novamente a amostra eluída e transferir a fase superior para um novo tubo de 1,5 mililitros para garantir que não haja transferência de contas. Colher amostras para extração de RNA ou proteína.
Para determinar a eficiência de isolamento e a qualidade do RNA, a Análise do Norte foi realizada para dois RNAs marcados. PMP1 e FPR1, a partir de lise celular fundida, lise celular rápida e após eluição com biotina. Os RNAs ribossômicos foram detectados pela coloração com brometo de etídio, e a falta de RNAs ribossômicos na amostra de eluição indica o rigor da purificação.
O rigor e a especificidade da purificação são ainda demonstrados pela falta de um sinal de um MRNA não marcado nas amostras de eluição. O sinal aparente na pista FPR1, que não é do tamanho do ACT1, é um resquício da hibridização anterior com a sonda MS2L. Embora o RNA de entrada seja um pouco mais degradado em comparação com o RNA que foi purificado pelo protocolo Hot Phenol, uma quantidade significativa de RNA marcado de comprimento total é isolada especificamente, conforme revelado pelo forte sinal nas frações de eluição.
As amostras de proteínas podem ser analisadas por SDS-PAGE e coloração de prata antes da análise proteômica. A proteína de fusão MS2-CP-GFP-SBP, indicada pela seta, demonstra carga proteica igual. Os asteriscos indicam bandas com intensidades diferenciais que foram posteriormente cortadas do gel para análise de espectrometria de massa.
Ao tentar este procedimento, é importante usar luvas, garantir uma área de trabalho limpa, preparar a solução com água livre de RNA e trabalhar de forma rápida e eficiente para reduzir o tempo do protocolo. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes como fenol e formaldeído pode ser extremamente perigoso, e precauções como trabalhar em uma capa química devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar de forma eficiente e eficaz o RNA de fayn-tress e seu corpo associado.
Após este procedimento, outros métodos como o RNA-Seq podem ser realizados para detectar RNAs que se ligam ao transcrito de interesse.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método in vivo para o isolamento de RNA específico juntamente com suas proteínas associadas. Esta técnica tem como objetivo aprimorar nossa compreensão da regulação do RNA dentro das células.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Interações RNA-proteína
- Processos celulares
- Metabolismo do RNA
Antecedentes
- As interações RNA-proteína são cruciais para diversas funções celulares.
- Compreender essas interações pode fornecer insights sobre a regulação do RNA.
- Os métodos existentes podem apresentar falta de eficiência no isolamento de complexos específicos de RNA-proteína.
- Este estudo apresenta uma abordagem inovadora utilizando cepas de levedura.
Objetivo do Estudo
- Isolar RNA específico e identificar proteínas associadas in vivo.
- Responder perguntas relativas ao metabolismo e regulação do RNA.
- Melhorar a eficiência das técnicas de isolamento de RNA-proteína.
Métodos Utilizados
- Utilização de uma linhagem de levedura coexpressando mRNA marcado com MS2.
- Proteína de fusão da proteína ligante de MS2 e da proteína ligante de estreptavidina.
- Cultivo de células de levedura em meio sintético com dextrose.
- Centrifugação para isolamento de complexos RNA-proteína.
Resultados Principais
- Obteve-se alta eficiência no isolamento de complexos RNA-proteína.
- Foi facilitada a identificação de novas proteínas associadas ao mRNA.
- O método permite o processamento rápido de amostras.
- Obtiveram-se informações sobre a regulação do RNA por meio desta abordagem.
Conclusões
- Este método fornece uma ferramenta valiosa para o estudo das interações RNA-proteína.
- Ele aprimora nossa compreensão do metabolismo e da regulação do RNA.
- Aplicações futuras podem levar a descobertas em processos celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação de proteínas que ligam RNA (RBPs) associadas a transcritos específicos é fundamental para a validação de alvos em terapias com RNA e na descoberta de biomarcadores. A metodologia RaPID permite o isolamento eficiente de complexos RNA-proteína in vivo, apoiando a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer interações funcionais em um sistema relevante para a doença. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, fornecendo dados quantitativos e reprodutíveis sobre associações entre RBP e mRNA.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao identificar PBORs ligadas a RNAm relevantes para doenças, como o PMP1 associado ao retículo endoplasmático.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho reprodutível para o isolamento de complexos nativos de RNA-proteína de levedura, reduzindo falsos positivos provenientes de métodos in vitro.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança no alvo por meio da captura específica e de alta eficiência de interações in vivo, auxiliando na triagem de portfólios.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera sistemas biológicos validados (linhagens de levedura expressando RNA marcado com MS2 e proteína de fusão) para aplicações de triagem posteriores.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento complexo por meio de precipitação com microesferas de estreptavidina, melhorando a reprodutibilidade entre experimentos.
- Prontidão para Ensaios: Produz frações purificadas de RNA e proteína adequadas para análise quantitativa por espectrometria de massa ou hibridização Northern.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a identificação de PBPs na fase de descoberta à validação pré-clínica, permitindo análises complementares como RNA-Seq e SDS-PAGE.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Demonstra rigor e especificidade pela ausência de sinais de RNA ribossômico e de mRNA não marcado nas amostras de eluição.
- Sistema Relevante para Doenças: Aplicável a modelos de levedura do metabolismo de RNA, com potencial adaptação para sistemas mamíferos na validação de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método RaPID insere-se na fase inicial do descobrimento, apoiando a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos antes da identificação de compostos líderes e da validação pré-clínica.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses mediante o isolamento de complexos específicos de RNA-proteína de condições in vivo, esclarecendo associações funcionais.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios por meio do isolamento padronizado de complexos RNA-proteína, apoiando triagens reprodutíveis de compostos ou genéticas.
- Análises: Gera resultados quantitativos por espectrometria de massa e análise de Northern blot, permitindo a comparação da abundância de RBPs entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao fornecer complexos purificados para validação posterior em modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para a descoberta de RBPs em múltiplos transcritos, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista na regulação do RNA.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e escalabilidade por meio de etapas definidas de reticulação, lise e purificação baseada em microesferas.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção ao fornecer dados confiáveis sobre interações entre RBPs e mRNA, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em associações validadas de RBPs em contextos relevantes para doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em biologia molecular, cultivo de leveduras e técnicas de interação RNA-proteína.
- Exige instrumentação para reticulação (formaldeído), separação baseada em microesferas e centrifugação em múltiplas velocidades.
- Exige padronização entre equipes quanto à composição do tampão de lise e ao uso de inibidores de RNase para garantir reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o método de leveduras para outros sistemas modelo, particularmente no que se refere à marcação e expressão de proteínas de fusão.
- Inclui limitações práticas, como o risco de degradação do RNA durante o processamento e a necessidade de manipulação rápida e sob refrigeração para manter a integridade do complexo.
