Name: Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Aprenda a isolar RNA específico e proteínas associadas em leveduras usando uma metodologia rápida e eficiente. Esta técnica permite identificar novas proteínas ligadas ao mRNA e estudar a regulação do metabolismo celular.

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Agradecemos Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin para os seus conselhos úteis na criação do protocolo rápida e fornecendo os plasmídeos necessários. Agradecemos também a Dr. Abigail Atir-Lande por sua ajuda no estabelecimento deste protocolo e Dr. Tamar Ziv do Smoler Proteomics Center for sua ajuda com a análise LC-MS / MS. Agradecemos Prof. TG Kinzy (Rutgers) para o anticorpo YEF3. Este trabalho foi apoiado pela concessão 2011013 do Binacional Science Foundation.

Nota: Inserir uma sequência que consiste em 12 locais de ligação MS2 (MS2 malhas; MS2L) no locus genómico desejado, geralmente entre a grelha de leitura aberta (ORF) e a 3 &#39;UTR. Um protocolo detalhado para essa integração é fornecido em outros lugares 22. Verifique a inserção correta e expressão por PCR, análise de Northern ou RT-PCR 20,23. É importante verificar que a integração não interferiu com a síntese do 3 &#39;UTR. Além disso, um plasmídeo que expressa MS2 CP-fundido com PAS sob a expressão de um promotor indutível (depleção de metionina) também deve ser introduzido nas células 24. Uma estirpe idêntica, excluindo os loops MS12 introduzidas, deve ser utilizado como um controlo para a detecção de sinais não específicos. 1. purificação rápida <ol><li> Cresça 500 ml de células de levedura (250-1,000 usar ml de células de levedura de acordo com o nível da expressão do gene de interesse) que expressam ARNm de MS2-tagged 20 eProteína de fusão MS2-CP-GFP-PAS 24 a DO600 0,8-1,0 a 30 ° C no meio de crescimento apropriado (por exemplo, dextrose sintética (SD) meio selectivo). </li><li> células Centrifugar a 3000 x g durante 4 min a RT e desprezar o sobrenadante. </li><li> Lavar células em 1x tampão de fosfatos salino (PBS), de centrifugação, como anteriormente (passo 1.2), ressuspender em um volume igual (passo 1.1) de SD sem metionina, e incubar durante 45 - 60 min a 30 ° C para induzir a expressão da MS2 -CP-GFP-PAS proteína de fusão. Nota: tempo de indução mais longos podem causar agregação de GFP. </li><li> Retiradas 10 ml de células e extrair RNA a partir desta amostra usando o método simples &quot;fenol quente&quot; 25. Atenção: O fenol é altamente tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança. Nota: Este ARN é uma boa referência para a qualidade do ARN isolado (Figura 1A). </li><li> Por 500 ml células, adicionar 1,35 ml de 37% de formaldeído para a final concentration de 0,1% para reticular os complexos de ARN-proteína. Continue incubação a 30 o C por 10 min. Atenção: O formaldeído é altamente tóxico e deve ser manuseado de acordo com as suas instruções de segurança. </li><li> Adicionar 26,5 ml de 2,5 M de glicina para uma concentração final de 0,125 M e incuba-se durante 3 minutos para parar a reticulação. A partir deste passo, colocar tudo em gelo para minimizar a degradação do RNA. </li><li> Células centrifugar a 3000 xg durante 4 min a 4 ° C e lavar com 45 ml frio 1x PBS. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de tampão de lise rápida por 100 ml de cultura de células inicial. </li><li> Dividido em alíquotas de 500 mL em tubos de microcentrífuga com tampa de rosca e adicione ~ 400 mg de contas de vidro refrigerada a cada alíquota (cerca de um total de 0,2 ml tubo de PCR). </li><li> Lisar as células em um grânulo batedor durante 3 min. imediatamente colocar o lisado em gelo. Nota: lise celular lançamentos RNases celulares, que são a principal causa de degradação do RNA. tampão de lise rápida contém uma elevada concentração de RNase inhibitors, tais como a heparina não específica inibidor de RNase e inibidores específicos. Trabalhando rapidamente e manter tudo frio também é recomendado. </li><li> Transferir o lisado para novos tubos. Pierce um pequeno orifício na parte inferior de cada tubo de microcentrífuga com uma agulha quente (0,8 mm x 40 mm) e colocar os tubos de microcentrífuga de topo dos tubos de 15 ml. Utilizar a cabeça de uma seringa de 5 ml, como um adaptador entre os tubos de microcentrífuga e os tubos de 15 ml. Centrifugar a montagem de tubos a 3000 xg durante 1 min a 4 o C. </li><li> Transferir o fluxo através do tubo de 15 mL para um novo tubo de 1,5 ml e centrifugar a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar os detritos celulares. </li><li> sobrenadantes de piscina de todos os tubos de 1,5 ml em um único tubo de 15 ml, e reserve 1/50 e 1/100 do volume do lisado para o RNA e isolamento de proteínas, respectivamente. Nota: Estes irão servir como as amostras de &quot;input&quot; para posterior análise (Figura 1). </li><li> Adicionar 300 ug de avidina por 500 ml de ie cultura de levedura nitial incubar durante 30 minutos (este pode ser reduzido para 10 min) a 4 ° C sob rolamento constante (10 rpm). Nota: Os blocos de avidina e biotina proteínas biotiniladas se liguem às esferas de estreptavidina. </li><li> A pré-lavagem as esferas de estreptavidina antes da incubação com lisado de células. <ol><li> Transferir cerca de 300 ul de estreptavidina grânulos lama para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e remover o sobrenadante superior. Isto irá resultar em 250 ul de pérolas. Lave as contas duas vezes com 1 ml de tampão de lise rápida. Centrifugar as esferas de estreptavidina a 660 xg durante 2 min a 4 ° C entre cada passo. </li><li> Bloquear as pérolas por incubação durante 1 h com 0,5 ml de tampão de lise rápida, a 0,5 ml de 10 mg / ml de BSA e 10 uL de 10 mg / ml de ARNt de levedura. Grânulos podem ser deixados O / N em solução de bloqueio a 4 ° C com rotação, se necessário. </li><li> Lavar duas vezes com 1 ml de tampão de lise rápida. Nota: As esferas magnéticas pode também ser utilizado para reduzir o tempo e background. Estes, no entanto, tem menor capacidade do que esferas de sepharose. </li></ol></li><li> Adicionar 250 ul das esferas de estreptavidina pré-lavado para o lisado contendo avidina (a partir do passo de 1,14) e incubar 1 h a 4 ° C com rotação constante (10 rpm). Nota: Este tempo de incubação é um compromisso entre a prestação de tempo de ligação suficiente e minimizando as chances de degradação do RNA. </li><li> Centrifuga-se a 660 xg durante 2 min a 4 ° C para eliminar as esferas de estreptavidina e transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml. Separe 1/50 e 1/100 do volume do lisado para o isolamento de ARN e proteína, respectivamente. Nota: Estas serão as amostras não ligadas &quot;&quot;. </li><li> Lavam-se as esferas com 1 ml de tampão de lise rápida, agitar, transferir para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, e centrifuga-se tal como no passo 1.17. Repita este passo três vezes. </li><li> Lavam-se as esferas com 1 ml de tampão de lavagem rápida, e esta gire tempo (10 rpm) durante 5 min a 4 ° C. Repita esta etapa duas vezes. </li&gt; <li> Lavam-se as esferas com 1 ml de PBS 1x e centrifugação tal como acima. </li><li> Lavam-se as esferas de novo com 120 ul de PBS 1x. Centrifugar como acima, e tomar todo o sobrenadante para o ARN e a extracção de proteínas como a amostra de &quot;lavagem&quot;. Nota: Esta última amostra de lavagem indica o rigor das lavagens e deve ser do mesmo volume que a amostra de eluição. Isto irá simplificar o processamento e carregamento em ensaios subsequentes. </li><li> Para eluir o ARN e proteínas associadas ao ARN a partir da coluna, adicionar 120 ul de biotina 6 mM em PBS 1x e incubar durante 45 min a 4 ° C com rotação constante (10 rpm). </li><li> Centrifugar as esferas como anteriormente e transferir o material fluido para um novo tubo de 1,5 mL. Girar a amostra eluiu-se novamente e transferir a fase superior para um novo tubo de 1,5 mL para garantir que não haja transição de grânulos. </li><li> Colher amostras para RNA ou extração de proteínas. Nota: O volume ocupado deve depender do nível seguinte ensaio e a expressão do ARN ou proteína de interesse. Como orientação, para análise do Norte 26, tomar 80% da amostra, por Western blot 23,27 ou RT-PCR 28, tome 20%, e por espectrometria de massa 29 para descobrir novas proteínas, tome toda a amostra. </li></ol> 2. Extracção de ARN <ol><li> Adicionar um volume igual de tampão de reticulação 2x Reversão e incubar durante 45 min a 65 ° C. Continue diretamente para a extração de RNA. Nota: A reversão de reticulação contém tampão de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), o que melhora de forma significativa a extracção de RNA 20. </li><li> Use o fenol padrão: Método de clorofórmio 26 para extrair RNA do &quot;input&quot; e amostras &quot;não ligados&quot; (passos de 1,13 e 1,17). Nota: Estas amostras contêm uma grande quantidade de heparina o inibidor de RNase, que pode inibir a ensaios utilizando subsequentes Transcriptase- reversa (RT) (por exemplo, RT-PCR), por conseguinte, LiCl precipitação 30 é aconselhada para removê-lo. O WAsh &quot;e&quot; &quot;amostras de eluição (passos 1.21 e 1.24) contêm pequenas quantidades de ARN e são precipitados através dos seguintes passos. </li><li> Adicionar um volume igual de guanidínio 8M-HCI (GuHCI) e dois volumes de etanol a 100% à &quot;lavagem&quot; e amostras de &quot;eluição&quot;. Incubar a -80 ° C durante pelo menos 2 h. Nota: guanidínio será eficiente desnaturar as proteínas e, assim, inibir as RNases e proteases na amostra. </li><li> Centrifuga-se a 20000 xg, a 4 ° C durante 30 min e desprezar o sobrenadante. Lava-se a pastilha com etanol frio a 80% e centrifuga-se novamente a 20000 xg, 4 ° C durante 15 min. </li><li> Dissolver o sedimento RNA em 400 mL de RNase água livre e precipitar novamente para remover qualquer sobra GuHCl ou outros contaminantes. Adicionar 40 ul de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 800 ul de etanol a 100%, incuba-se a -20 ° C durante pelo menos 1 h. </li><li> Centrífuga e lavar como no passo 2.4 e remover todo o etanol com uma ponta de 10 mL. Ressuspender o Pell RNAet em 10 mL RNase água livre. Tome cuidado extra como o sedimento RNA normalmente não é visível. Nota: As amostras podem ser utilizadas para a análise de Northern como descrito em 23 (Figura 1). </li></ol> 3. Proteína Preparação para Western Blot ou Análise Espectrometria de Massa <ol><li> Adicione 1/3 do volume de tampão de amostra de Laemmli 4x (LSB) para amostras de proteína e incubar 45 min a 65 ° C para inverter a ligação cruzada de proteínas e RNA. Nota: As amostras podem ser armazenadas a -20 ° C. </li><li> Proteínas executado em um gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) 31. Ajustar a percentagem de gel de acordo com o tamanho das proteínas a ser analisada. Nota: gel de acrilamida a 10% dá uma vasta gama de separação e está bem como uma primeira aproximação. </li><li> Transferir as proteínas para a membrana como na análise de imunomarcação padrão 27 para controlo da eficiência de isolamento (Figura 1C). Manchar ou com Coomassie Blue R250 ou prata mancha antes da análise de espectrometria de massa. Nota: mancha de prata é a escolha preferida, pois é mais sensível e permite uma melhor detecção (Figura 1B). A coloração pode ser feito com qualquer soluções preparadas manualmente ou kits comerciais. O tempo de incubação do gel na solução final corante deve ser determinada experimentalmente. Longo incubação pode revelar proteínas abundantes de baixo, mas pode causar proteínas altamente expressos tais como MS2-CP-PAS-GFP para ser mais manchado e podem mascarar proteínas circundantes na sua vizinhança. Além disso, pode ocorrer um fundo alta. Siga a reação com cuidado, e adicionar solução de parada no momento apropriado. </li><li> Cortar bandas do gel e transferi-los para tubos de 1,5 ml. Armazenar as amostras a -20 ° C, ou enviar para a extracção de proteína e digestão com tripsina seguida por análise por LC-MS / MS 32. </li><li> Como uma abordagem alternativa para proteómica exclui a etapa de separação em gel, digerir material eluído a partir do passo 1.24 em tãolução utilizando tripsina e sujeita a análise por LC-MS / MS 33. Nota: Omitir a separação SDS-PAGE simplifica o protocolo e aumenta o rendimento. No entanto, as amostras podem conter vestígios de detergente NP-40, que inibe a análise de espectrometria de massa. Para ultrapassar este problema, execute os seguintes passos: <ol><li> Executar proteína em SDS-PAGE a 31 por 10 - 15 min. </li><li> Cortar toda a porção de pista (isto é, onde as proteínas estão localizados). Nota: A amostra de proteína pode incluir uma quantidade significativa de proteína-MS2 CP-PAS que podem obscurecer os sinais de proteínas de baixa abundância. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Vários métodos utilizam o isolamento de ARNm específicos para identificar as suas proteínas associadas 11,34 35. Estes métodos aplicam-se in vitro e in vivo em estratégias para investigar interacções ARN-proteína. Métodos in vitro incubar exogenamente ARN transcrito com lisado celular para capturar RBPs e isolar complexos de RNP 36,37. Uma abordagem eficaz deste tipo foi apresentado recentemente, o que permitiu a identificação de novas proteínas que se ligam um...

Proteínas de ligação a ARN (RBPs) representar cerca de 10% de S. proteínas cerevisiae 1,2 e cerca de 15% de proteínas de mamífero 3-5. Eles estão envolvidos em muitos processos celulares, tais como processamento de mRNA pós-transcricional e regulação, tradução, biogênese do ribossomo, tRNA aminoacilaï¿½o e modificação, a remodelação da cromatina, e muito mais. Um subgrupo importante de RBPs é as proteínas de ligação ao ARNm (mRNPs) 6,7. No decurso da maturação do mRNA, diferentes RBPs ligar a transcrição e mediar a transformação nuclear, exportação para fora do núcleo, a localização celular, tradução e degradação 6-8. Assim, o conjunto distinto de RBPs ligados a um transcrito particular, a qualquer ponto de tempo determina o seu processamento e em última análise o seu destino. A identificação de RBPs associados a um mRNA poderia melhorar significativamente a nossa compreensão dos processos subjacentes à sua regulação pós-transcricional. Diverse genética, Métodos microscópicos, bioquímicos e de bioinformática têm sido utilizados para identificar proteínas envolvidas na regulação do ARNm (revisto em 9-11). No entanto, apenas alguns desses métodos permitem a identificação de proteínas associadas a um ARNm alvo particular. Digno de nota é o sistema híbrido de levedura Três (Y3H), que utiliza o mRNA de interesse como isca para pesquisar uma biblioteca de expressão em células de levedura. Os clones positivos são observados geralmente através de uma selecção de crescimento ou repórter expressão 12-14. A principal vantagem deste método é o grande número de proteínas que podem ser digitalizados num ambiente celular e a capacidade para medir a força da interacção RNA-proteína. Desvantagens incluem o número relativamente grande de resultados falsos positivos devido à ligação não específica, eo alto potencial de resultados falsos negativos devido, em parte, a misfolding da presa proteína de fusão ou o RNA isca. Uma alternativa à abordagem genética é purifi afinidadecatião de ARN com as suas proteínas associadas. Poli A contendo ARNm pode ser isolado através da utilização de colunas de oligo dT, e as suas proteínas associadas são detectados por espectrometria de massa. A interacção RNA-proteína é conservado no seu contexto celular por reticulação, o que faz com que as ligações covalentes de curto alcance. A utilização da coluna de oligo dT proporciona uma visão global de todo o proteoma que está associado com qualquer poli A de mRNA contendo 3,5,15. No entanto, este não fornece uma lista de proteínas que estão associadas com um ARNm específico. Muito poucos métodos estão disponíveis para realizar uma tal identificação. O método implica a transfecção PAR de ácido nucleico com complementaridade com o mRNA alvo 16,17. O ácido nucleico está também ligado a um péptido, o que permite a reticulação de RBPs em estreita proximidade ao local de interacção. Após a reticulação, o ácido nucleico RBP-péptido pode ser isolado e submetido a análise proteómica. Recentemente, uma metodologia baseada na aptâmero eraaplicado com sucesso a extractos de linhas de células de mamíferos 18. Um aptâmero de ARN com afinidade melhorada para estreptavidina e foi desenvolvido fundido com uma sequência de interesse (elemento ricos em AU (ARE), neste caso). O ARN aptâmero-ARE foi ligado a esferas de estreptavidina e misturados com o lisado celular. As proteínas associadas a que a sequência são foram purificados e identificados por espectrometria de massa (MS). Embora este método detectado associações que ocorrem fora das definições celulares (isto é, in vitro), é susceptível de ser modificado no futuro, de modo a introduzir os aptâmeros no genoma e, assim, permitir o isolamento de proteínas associadas com o ARNm enquanto que na meio celular (isto é, in vivo). Em leveduras, onde manipulações genéticas estão bem estabelecidos, o método rápido (desenvolvido no laboratório do Prof. Jeff Gerst) fornece uma visão in vivo associações 19. Rápida combina o específico e forte ligação da proteína de revestimento de MS2 (MS2-CP) para a sequência de ARN MS2, e do domínio de ligação a estreptavidina (SBP) a estreptavidina esferas conjugadas. Isso permite a purificação eficiente de mRNAs MS2-marcadas através de contas de estreptavidina. Além disso, a expressão de 12 cópias de MS2 laços permite até seis MS2-CPS de se ligar simultaneamente para o RNA e aumentar a eficiência do seu isolamento. Este protocolo foi, portanto, sugerida para permitir a identificação de novas proteínas associadas à ARNm uma vez que as amostras eluídas são sujeitas a análise por espectrometria de massa proteómica. Recentemente, utilizou rápido para identificar novas proteínas associadas com a levedura Pmp1 ARNm 20. Pmp1 ARNm foi anteriormente mostrado para ser associado com a membrana do RE e do seu 3 &#39;não traduzida (UTR) foi encontrado para ser um dos principais determinantes nesta associação 21. Assim, RBPs que se ligam Pmp1 UTR 3 &#39;são susceptíveis de desempenhar um papel importante na sua localização. Rápida seguida de cromatografia líquiday-espectrometria de massa / espectrometria de massa (LC-MS / MS) resultou na identificação de várias novas proteínas que interagem com Pmp1 20. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado da metodologia rápida, controles importantes que precisam ser feitas, e dicas técnicas que podem melhorar o rendimento e especificidade.

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Fenol ácido (pH 4,3)</td> <td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Fenol ácido: Clorofórmio (5: 1, pH 4,3)</td> <td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td> <td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Tripsina de Soja</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pestatina</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease&nbsp; Contas</td> de Vidro <td>Inibidor Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0.4-0.6mm de diâmetro&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Estreptavidina</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Levedura tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptona</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Tampão de amostra Laemmli (LSB)</td><td></td><td></td> <td>0,2 M Tris-Hcl pH 6,8, 8% SDS, 0,4 M DTT, 40% glicerol, 0,04% Bromofenol-Azul.</td></tr><tr>Tampão <td></td><td></td><td>de lise de fenol quente</td><td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Acetato de Sódio pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% e 70% Etanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase Água</td><td></td><td></td><td></td>livre de</tr><tr><td>RaPID lise tampão</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 5 mg/ml Heparina, 1 mM Ditiotreitol (DTT), 1 mM Fluoreto de Fenilmetilsulfonil (PMSF), 10 &micro; g/ml de Leupeptina, 10 &micro; g/ml Aprotinina, 10 &micro; g/ml Inibidor de Tripsina de Soja, 10 &micro; g/ml de Pepstatina, 20 U/ml de DNase I, 100 U/ml de Ribonuclease&nbsp; Inibidor.</td></tr><tr>2x Tampão <td></td><td></td><td>de reversão de reticulação</td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2% SDS.</td></tr><tr>Tampão <td></td><td></td><td>de lavagem RaPID</td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&nbsp; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>161-0449</td><td>Para detectar proteínas em géis de poliacrilamida</td></tr><tr><td>SD meio seletivo</td><td></td><td></td><td>1,7 g/l de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos e sulfato de amônio, 5 g/l de sulfato de amônio, 2% de glicose, 350 mg/l de treonina, 40 mg/l de metionina, 40 mg/l de adenina, 50 mg/l de lisina, 50 mg/l de triptofano, 20 mg/l de histidina, 80 mg/l de leucina, 30 mg/l de tirosina, 40 mg/l de arginina</td></tr><tr><td>anti-eEF3 (EF3A, YEF3)</td> <td>Presente de Kinzy TG. (Escola de Medicina Robert Wood Johnson da UMDNJ)</td><td>1:5.000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3.000</td></tr><tr><td>Anti coelho IgG-HRP conjugado</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10.000</td></tr></tbody></table>

novel de ligação a rna proteínas isolamento pelo rápido metodologia

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

As proteínas de ligação ao RNA (RBPs) desempenham papéis importantes em todos os aspectos do metabolismo e regulação do RNA. Sua identificação é um grande desafio na biologia moderna. Apenas alguns métodos in vitro e in vivo permitem a identificação de RBPs associados a um mRNA alvo específico. No entanto, suas principais limitações são a identificação de RBPs em ambiente não celular (in vitro) ou o isolamento de baixa eficiência do RNA de interesse (in vivo). Uma metodologia de purificação e identificação de proteínas de ligação a RNA (RaPID) foi projetada para superar essas limitações em leveduras e permitir o isolamento eficiente de proteínas associadas in vivo. Para conseguir isso, o RNA de interesse é marcado com alças MS2 e co-expresso com uma proteína de fusão de uma proteína de ligação a MS2 e uma proteína de ligação à estreptavidina (SBP). As células são então submetidas a reticulação e lisadas, e os complexos são isolados através de grânulos de estreptavidina. As proteínas que co-purificam com o RNA marcado podem então ser determinadas por espectrometria de massa. Recentemente, usamos este protocolo para identificar novas proteínas associadas ao mRNA PMP1 associado ao ER. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado do RaPID e discutimos algumas de suas limitações e vantagens.

RAPID permite o isolamento de um ARN alvo específico com as suas proteínas associadas. Crítico para o seu sucesso é manter o ARN intacto, tanto quanto possível, obtendo-se assim uma quantidade suficiente de proteínas. Para determinar a eficiência e a qualidade de isolamento de ARN, análise de Northern é realizado (Figura 1A). análise do Norte tem a vantagem de reportar diretamente a eficiência e qualidade dos rápidos. Assim, as quantidades relativas dos produtos de degra...

as interações RNA-proteína estão no centro de muitos processos celulares. Aqui, descrevemos um método in vivo para isolar RNA específico e identificar novas proteínas associadas a ele. Isso pode lançar uma nova luz sobre como os RNAs são regulados na célula.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar de forma eficiente um RNA específico com as proteínas que estão associadas a ele in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o metabolismo e a regulação do RNA, como, por exemplo, quais são o conjunto distinto de proteínas de ligação ao RNA ligadas a um transcrito particular. A principal vantagem desta técnica é a alta eficiência de isolamento, o que permite a identificação subsequente de proteínas associadas ao RNAm de interesse.A metodologia rápida utiliza uma linhagem de levedura que coexpressa ARNm marcado com MS2 e uma proteína de fusão de uma proteína ligante de MS2 e uma proteína ligante de estreptavidina. Cultive 500 mililitros de células de levedura a 30 graus Celsius em meio seletivo dextrose sintético ou SD até uma OD600 de 0,8 a 1,0. Quando as células estiverem prontas, centrifugue a 3000 vezes G durante 4 minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.Lave as células com PBS e centrifugue novamente. Descarte o sobrenadante e re-suspenda as células em um volume igual de SD sem metionina. Incube por 45 a 60 minutos a 30 graus Celsius para induzir a expressão da proteína de fusão.Após 45 a 60 minutos, reserve 10 mililitros das células para extração de RNA e utilize as células restantes para purificação rápida. Para iniciar este procedimento, adicione às células 1,35 mililitro de formaldeído a 37%, para uma concentração final de 0,1%, a fim de promover a reticulação dos complexos RNA-proteína. Continue a incubação a 30 graus Celsius por 10 minutos.Para interromper a reticulação, adicione 26,5 mililitros de glicina 2,5 molar, até uma concentração final de 0,125 molar, e incube a 30 graus Celsius por 3 minutos. A partir deste ponto, mantenha tudo em gelo e trabalhe rapidamente para minimizar a degradação do RNA. Centrifugue as células a 3000 ×g por 4 minutos a 4 graus Celsius.Descarte o sobrenadante, adicione 45 mililitros de PBS frio e centrifugue novamente. Remova o sobrenadante e re-suspenda as células em 5 mililitros de tampão de lise rápida que contém uma alta concentração de inibidores de RNase. Divida a suspensão celular em alíquotas de 500 microlitros em tubos microcêntrifugos com tampa de rosca e adicione aproximadamente 400 miligramas de esferas de vidro previamente resfriadas a cada alíquota.Lise as células em um homogeneizador por três minutos. Coloque imediatamente o lisado em gelo. Transfira o lisado para novos tubos de microcentrífuga.Corte a parte superior de uma seringa de 5 mililitros e coloque-a em um tubo vazio de 15 mililitros para servir como adaptador para tubos com tampa rosqueável. Use uma agulha aquecida para perfurar um pequeno orifício na base de cada tubo e posicione-os sobre os tubos de 15 mililitros adaptados. Centrifugue os conjuntos de tubos a 3000 ×g por um minuto a 4 °C para eluir o lisado para os tubos de 15 mililitros.Transfira o fluxo passante de cada tubo de 15 mililitros para um novo tubo de 1,5 mililitro e centrifugue a 10.000 × g durante 10 minutos a 4 graus Celsius para remover os detritos celulares. Reúna o sobrenadante de todos os tubos de 1,5 mililitro em um único tubo de 15 mililitros. Reserve um volume de 1/50 e 1/100 do lisado para isolamento de RNA e proteína, respectivamente.Inicie o procedimento rápido para isolamento de complexos de RNA e proteína adicionando 300 microgramas de Avidina ao lisado celular. Incube por 30 minutos a 4 graus Celsius com rolagem constante. Enquanto o lisado celular está em incubação com a Avidina, pré-lave as microesferas de estreptavidina, transfira cerca de 300 microlitros da suspensão de microesferas de estreptavidina para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, centrifugue a preparação e, em seguida, remova o sobrenadante superior, o que resultará em 250 microlitros de microesferas.Adicione 1 mililitro de tampão de lise rápida às esferas e centrifugue a 660 × g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Remova o sobrenadante e lave novamente com tampão de lise rápida. Para bloquear as esferas, adicione 0,5 mililitros de tampão de lise rápida, 0,5 mililitros de BSA e 10 microlitros de TRNA de levedura e incube por 1 hora a 4 graus Celsius com rotação constante.Lave as microesferas duas vezes com 1 mililitro de tampão de lise rápido. Adicione 250 microlitros das microesferas de estreptavidina pré-lavadas ao lisado contendo avidina e incube por 1 hora a 4 graus Celsius com rotação constante. Esse tempo de incubação é um compromisso entre fornecer tempo suficiente para ligação e minimizar as chances de degradação do RNA.Após uma hora, centrifugue a 660 vezes G durante 2 minutos a 4 graus Celsius para remover as microesferas de estreptavidina. Transfira o sobrenadante para um tubo de 15 mililitros. Reserve 1/50 e 1/100 do volume do lisado para isolamento de RNA e proteína, respectivamente.Adicione 1 mililitro de tampão de lise rápida às esferas. Misture por pipetagem, transfira para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e centrifugue a 660 ×g por 2 minutos a 4 graus Celsius. Lave mais três vezes com tampão de lise rápida.Após a última lavagem com o tampão de lise rápida, remova o sobrenatante, adicione 1 mililitro do tampão de lavagem rápida e incube em rotação durante 5 minutos a 4 graus Celsius. Centrifugue e lave mais 2 vezes com o tampão de lavagem rápida. Lave as microesferas com 1 mililitro de PBS e centrifugue como anteriormente.Remova o sobrenatante, adicione aos grânulos 120 microlitros de PBS e agite por 5 minutos em um agitador rotativo. Centrifugue como antes e colete todo o sobrenatante para extração de RNA e proteína como amostra de lavagem. Para eluir o RNA e as proteínas associadas ao RNA, adicione 120 microlitros de biotina 6 milimolar em PBS aos grânulos e incube por 45 minutos a 4 graus Celsius com rotação constante.Centrifugue as esferas e transfira o material eluído para um novo tubo de 1,5 mililitro. Centrifugue a amostra eluída novamente e transfira a fase superior para um novo tubo de 1,5 mililitro para garantir que não haja arraste de esferas. Retire amostras para extração de RNA ou proteína.Para determinar a eficiência de isolamento e a qualidade do RNA, foi realizada uma análise de Northern para dois RNAs marcados, PMP1 e FPR1, provenientes da lise de células coletadas, lise rápida de células e após a eluição com biotina. Os RNAs ribossomais foram detectados por coloração com brometo de etídio, e a ausência de RNAs ribossomais na amostra de eluição indica a rigidez da purificação.A rigidez e especificidade da purificação são ainda demonstradas pela ausência de sinal de um RNAm não marcado nas amostras de eluição. O sinal aparente na fileira de FPR1, que não possui o tamanho de ACT1, é um resíduo da hibridização anterior com a sonda MS2L. Embora o RNA de entrada esteja um pouco mais degradado em comparação com o RNA purificado pelo protocolo de Fenol Quente, uma quantidade significativa de RNA marcado de comprimento completo é isolada especificamente, conforme revelado pelo forte sinal nas frações de eluição.As amostras de proteínas podem ser analisadas por SDS-PAGE e coloração com prata antes da análise de proteômica. A proteína de fusão MS2-CP-GFP-SBP, indicada pela seta, demonstra uma carga proteica igual. Os asteriscos indicam bandas com intensidades diferenciais que foram posteriormente recortadas do gel para análise por espectrometria de massas.Ao realizar este procedimento, é importante usar luvas, garantir uma área de trabalho limpa, preparar as soluções com água livre de RNase e trabalhar de forma rápida e eficiente para reduzir o tempo do protocolo. Não se esqueça de que o trabalho com reagentes como fenol e formaldeído pode ser extremamente perigoso, e precauções, como trabalhar em uma capela química, devem sempre ser tomadas ao executar este procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar de forma eficiente e eficaz o RNA de fayn-tress e seu corpo associado.Após este procedimento, outros métodos como o RNA-Seq podem ser realizados para detectar RNAs que se ligam ao transcrito de interesse.

novel-rna-binding-proteins-isolation-by-the-rapid-methodology

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Transcrições RNA estão sujeitos à regulamentação posttranscriptional extensa que é mediada por uma multidão de proteínas RNA-binding trans-acting (RBPs). Aqui apresentamos um método generalizado para identificar com precisão e em escala transcriptoma-wide os sites ligação do RNA RBPs.

PAR-Clip - um método para identificar em toda a Transcriptoma Sítios de Ligação de Proteínas RNA Binding

Um passo a passo para protocolo de isolamento e identificação de RNA complexos associados através de RIP-Chip.

Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

Este vídeo demonstra um ensaio de extração de RNA in vitro para identificar proteínas de ligação a RNA (RBPs), que interagem com as sequências de elementos ricos em adenilato-uridilato (ARE) no mRNA. Os RBPs alvo de um lisado celular são misturados com uma sonda de RNA para formar complexos de RNA-proteína. Os complexos são isolados por purificação de afinidade utilizando a afinidade do marcador de destiobietina da sonda de RNA a um grânulo magnético marcado com estreptavidina.

Ensaio pull-down de proteína de RNA para isolar proteínas de ligação a RNA por meio de extração de afinidade

Neste vídeo, descrevemos a evolução sistemática de ligantes pelo método de enriquecimento exponencial (SELEX) para identificar sequências específicas de ligação a RNA para uma proteína-alvo de interesse. A proteína é incubada com um grande conjunto de sequências de RNA aleatórias, e as sequências de RNA de ligação à proteína são isoladas, amplificadas por PCR e sequenciadas para identificar seus locais de ligação à proteína.

Ensaio de ligação in vitro baseado em SELEX para identificar interações RNA-proteína

Este manuscrito descreve uma abordagem para isolar RNPs cognatos selecionados formados em células eucarióticas por meio de um enriquecimento direcionado a oligonucleotídeos específicos. Demonstramos a aplicabilidade dessa abordagem isolando um RNP cognato ligado à região retroviral 5' não traduzida que é composta por DHX9/RNA helicase A.

Isolamento de complexos de ARN-proteína a partir de células Cognate usando eluição Oligonucleotide-directed

Descreveremos um protocolo para identificar proteínas RNA-obrigatórias e mapear suas regiões de ligação de RNA em células vivas, usando photocrosslinking UV-mediada e espectrometria de massa.

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Um procedimento de isolamento de RNA em tandem (viagem) para recuperação de complexos mRNA-proteínas endogenamente formado é descrito. Especificamente, complexos de RNA-proteína são quitosana na vivo, polyadenylated RNAs são isolados de extratos com grânulos de oligo (descolamento) e particulares mRNAs são capturados com modificados oligonucleotides antisentidos do RNA. Proteínas vinculadas a mRNAs são detectadas pela análise de immunoblot.

Um procedimento de isolamento de RNA em Tandem do Oligonucleotide-baseado para recuperar complexos mRNA-proteínas eucariotas

Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

A especificidade da sequência é fundamental para a regulação genética. As proteínas reguladoras que reconhecem sequências específicas são importantes para a regulação genética. Definir locais de ligação funcionais para essas proteínas é um problema biológico desafiador. Uma aproximação iterativo para a identificação de um local obrigatório para uma proteína RNA-obrigatória é descrita aqui e é aplicável a todas as proteínas RNA-obrigatórias.

Explorando o espaço de seqüência para identificar sites de vinculação para proteínas reguladoras de ligação de RNA

Aqui, apresentamos um método in vitro otimizado para descobrir, quantificar e validar interatores proteicos de sequências específicas de RNA, usando extrato proteico total de células humanas, esferas de estreptavidina revestidas com RNA biotinilado e análise por espectrometria de massas.

Uma Análise Pull-Down Quantitativa Otimizada de Proteínas Ligadoras de RNA Usando RNA Biotinilado Curto

Aprenda a isolar RNA específico e proteínas associadas em leveduras usando uma metodologia rápida e eficiente. Esta técnica permite identificar novas proteínas ligadas ao mRNA e estudar a regulação do metabolismo celular.

Novel de Ligação a RNA Proteínas Isolamento pelo rápido Metodologia

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