"Fagossomo Encerramento Ensaio" para Visualize Formação fagossomo em Três Dimensões Usando Total Internal Reflection Microscopia fluorescente (TIRFM)

O objetivo geral deste protocolo é visualizar a formação do fagossomo, bem como o local exato da fissão do fagossomo em 3D, em macrófagos vivos, utilizando microscopia de fluorescência por reflexão total interna, ou microscopia TIRF. Este método combina a microscopia TIRF com epifluorescência para monitorar a localização passo a passo de duas proteínas fluorescentes diferentes durante a extensão dos pseudópodes e a fusão das pontas. A técnica fornece um método sistemático para determinar o ângulo crítico e obter um sinal TIRF, o que é essencial para tirar conclusões sobre eventos próximos à membrana plasmática.

No dia anterior à sessão no microscópio TIRF, ligue a câmara de aquecimento a 37 graus Celsius para permitir um aquecimento homogêneo da platina do microscópio. Na manhã seguinte, utilize 100 microlitros de PBS, suplementado com 0,1% de BSA, para lavar 7x10 à 6ª potência de hemácias de carneiro ou SRBCs por placa de fundo de vidro de 35 milímetros duas vezes. Após a segunda centrifugação, re-suspenda as células em 500 microlitros de IgG de coelho anti-SRBCs, numa concentração subaglutinante, em PBS suplementado com 0,1% de BSA por 5 microlitros de células, e incube as células por 30 minutos com rotação lenta.

No final da incubação, lave os SRBCs duas vezes em PBS acrescido de BSA e re-suspenda as células em 2 mililitros de meio de microscopia sem soro, a 37 graus Celsius, por placa. Em seguida, trate as placas de fundo de vidro de 35 milímetros com 2 mililitros de poli-L-lisina 0,1% durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de duas lavagens com 2 mililitros de PBS. Para fixação não covalente dos SRBCs, despeje 2 mililitros das células opsonizadas com IGG em cada uma das placas recobertas com polilisina e centrifugue as amostras em uma centrífuga com rotor oscilante.

Descarte os sobrenadantes e lave as partículas uma vez com 2 mililitros de PBS mais 10% de BSA. Em seguida, incube as partículas com 2 mililitros de PBS fresco mais 10% de BSA por 30 minutos à temperatura ambiente, seguido por três lavagens com 2 mililitros de PBS. Após a última lavagem, substitua o PBS por 2 mililitros de meio de microscopia sem soro a 37 graus Celsius.

Coloque uma placa revestida com CERS sobre a platina do microscópio. Em seguida, raspe as células transfectadas de interesse do fundo da placa de cultura e pipete as células várias vezes para obter uma suspensão de células isoladas. Adicione as células transfectadas à placa revestida com CERS.

Inicie o software de aquisição em tempo real. Localize uma célula que expresse as proteínas marcadas com fluorescência e ajuste a posição da placa para que uma célula de interesse fique no centro do campo. Adquira 500 imagens em diferentes ângulos, variando de zero a 5%, com incrementos de 0,01 grau, em um comprimento de onda de excitação.

Para determinar o ângulo crítico para que a luz incidente seja totalmente refletida na interface vidro-meio e gere uma onda evanescente, abra a sequência de imagens no software de imagem apropriado. Selecione uma região de interesse na célula com fluorescência uniforme. Em seguida, na guia Imagem, selecione Pilhas e Perfil do Eixo Z.

Para traçar o perfil do eixo z da intensidade média de fluorescência medida na região de interesse em função dos ângulos no eixo x. Qualquer valor de ângulo no eixo x, superior ao ângulo crítico, pode então ser utilizado durante a sessão de microscopia para obter um sinal de TIRF. Em seguida, no software de aquisição em tempo real, utilize o editor de protocolos para definir os parâmetros da aquisição.

Incluindo o número de sequências de aquisição de laço, os canais fluorescentes e sua intensidade de laser, o ângulo TIRF e o tempo de exposição. Defina o movimento Z do objetivo para alcançar o plano do modo de epifluorescência. Em seguida, no modo de epifluorescência, ajuste o ângulo TIRF para 1 e o movimento Z do objetivo de volta ao plano TIRF.

Em seguida, obtenha uma imagem da célula no modo de luz branca do LED. Agora, localize uma célula de interesse com um nível moderado de expressão da proteína marcada com fluoróforo, envolvida em fagocitose com um eritrócito de carneiro (SRBC), e posicione a célula no centro do campo. Observe que tal célula pode ser identificada por uma membrana plasmática estendida ao redor da partícula.

Digite o número de quadros na aba Contagem de Ciclos para iniciar uma aquisição contínua de 500 a 1.000 quadros. Se necessário, ajuste a intensidade do laser e o tempo de exposição para adaptar-se aos diferentes níveis de fluorescência na célula. Para gerar duas sequências de imagens separadas correspondentes aos dois canais, abra as sequências no software de imagem e clique na aba Imagem.

No menu Hyperstacks, selecione "Stack to Hyperstack". Em seguida, na janela pop-up, insira xyctz para a Ordem, o número de fluorocromos utilizados para os Canais, o número de Cortes no eixo z, o número de imagens dividido pelo número de canais em Quadros e Escala de cinza para o Modo de exibição. Depois, divida os canais.

Aqui, é apresentado um filme representativo de microscopia TIRF em tempo real de células vivas, mostrando o ensaio de fechamento de fagossomo em macrófagos 264.7 brutos englobando um eritrócito ramificado opsonizado com IGG. Conforme as pontas dos pseudópodes opostas ao lamínula de vidro ao redor do eritrócito ramificado, um anel de F-actina é detectado na área TIRF que progressivamente se estreita até se fechar. Em paralelo, o sinal difuso de F-actina detectado pela epifluorescência, após mover a platina três mícrons acima da área TIRF, corresponde à despolimerização na base da cúpula fagocítica.

Após três minutos, os SRBC são totalmente internalizados, conforme confirmado por imagem em luz transmitida. Utilizando este método, as regiões do actina na base da cúpula fagocítica, onde ocorre a exocitose focal dos compartimentos intracelulares, podem ser demonstradas. Após sua aquisição, uma célula pode ser submetida a um processamento adicional para microscopia eletrônica correlativa, ou toda a população celular pode ser fixada e congelada para processamento em microscopia de imunofluorescência clássica.

É importante ter em mente que a fagocitose é muito sensível à temperatura, e, portanto, a temperatura dentro da câmara de aquecimento e do meio do recipiente de cultura deve ser mantida constantemente a 37 graus Celsius durante todo o procedimento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como opsonizar partículas, revestir lamínulas com as partículas, determinar os ângulos críticos para microscopia TIRF e imagens da localização de proteínas de interesse durante a fagocitose em células vivas.