Name: Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprenda a induzir trombose com cloreto férrico em artérias carótidas e mesentéricas de camundongos usando microscopia intravital. Este método reprodutível permite avaliar efeitos de anticoagulantes e antiplaquetários em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) dos National Institutes of Health sob os números de prêmio R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) e R01 HL098217 (PI: Nieman). O conteúdo desta publicação é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os procedimentos e manipulações de animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Uso Comissões (IACUC) da The Cleveland Clinic, em conformidade com a política dos Estados Unidos Serviço de Saúde Pública sobre o cuidado humano e uso de animais, e o Guia NIH para o Cuidado e uso de Animais de laboratório. 1. Preparações: <ol><li> Corante fluorescente para a rotulagem Plaquetas <ol><li> Preparar solução de rodamina 6G, 0,5 mg / ml, em solução salina e esterilizar a solução com filtro de 0,22 um. </li></ol></li><li> FeCl3 Solução <ol><li> Adicione uma solução de fresca de 30% FeCl 3 (anidro, é igual a 1,85 m) em água pura, e filtrar com filtro de 0,45 um. Prepare 5 ml fresco FeCl3 solução na concentração desejada [por exemplo, 2,5% (0,154 m), 5% (0,308 M), 7,5% (0,463 M), 10% (0,617 M) e 12,5% (0,771 M)], através diluindo a solução de 30% FeCl3 com i águaNA 6 cm de placa de cultura de tecidos e manter a tampa fechada. NOTA: O uso da placa de cultura faz com que seja mais fácil de pegar o papel de filtro saturado com solução de FeCl 3 do que para buscá-lo a partir de um recipiente estreito, como um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. FeCl3 é extremamente perigoso e que precauções, como o uso de luvas e bata de laboratório etc., equipamento de protecção, devem ser sempre tomadas. </li></ol></li><li> Papéis de filtro <ol><li> Corte o papel de filtro a 1 mm x 2 mm de tamanho. Soak suficiente peças de papel de filtro de corte na solução de FeCl3 no mesmo prato. </li></ol></li><li> Solução de cloridrato de papaverina <ol><li> Preparar a solução de cloridrato de papaverina (25 mg / ml) em água e esterilizar a solução com filtro de 0,22 um. </li></ol></li><li> Gel de agarose <ol><li> Preparar 2% de gel de agarose em PBS ou solução salina em 6 cavidades da placa de cultura de tecidos, ~ 1 cm de espessura, e Cut-lo para semi-círculo com ~ 3 cm de diâmetro. </li></ol></li></ol> 2. FeCl3 Induced carótida Injury Thrombosis Modelo <ol><li> Procedimentos cirúrgicos para o modelo de trombose <ol><li> Use 8 - ratinhos C57BL6 12 semanas de idade (ou outras estirpes como necessário). Anestesiar ratos com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) via injecção intraperitoneal. Confirmar a profundidade da anestesia por beliscar dedo do pé. NOTA: Este quantidade de cetamina / xilazina é suficiente para manter o animal em anestesia estável e sem dor (resposta ao dedo do pé que comprime a) durante pelo menos 1 h. </li><li> Retire a pele no pescoço e parte superior do tórax com uma pequena clipper elétrico animal. creme depilatório não é necessário. Aplicar neutra pomada de petróleo sobre os olhos para evitar a secura durante a anestesia. </li><li> Garantir o rato em decúbito dorsal sobre a tampa de 15 cm placa de cultura de tecidos. Use uma fita longa (~ 10 cm) para garantir hinmembros d e parte inferior do corpo, e dois pedaços de fita pequena (2 cm x 0,5 centímetros) para fixar as pernas dianteiras. Use um fio de sutura 4-0 para envolver os incisivos, fita as duas extremidades da sutura com a tampa para manter o pescoço do rato em linha reta (Figura 2). </li><li> Coloque placa com cabeça de rato na direcção do operador sob uma fonte de luz cirúrgica. </li><li> Esterilizar o local da cirurgia com a almofada de álcool. Use as Micro-Adson pinça para segurar a pele e usar uma tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão (2-3 mm). </li><li> Segurar a pele da incisão com uma pinça e inserir as tesouras cirúrgicas, com as maxilas fechadas dentro da incisão. Empurrar a tesoura por via subcutânea em direção ao manubrium ou o queixo, em seguida, abra a tesoura para libertar a pele da camada subcutânea. </li><li> Cortar a pele com as tesouras cirúrgicas para fazer uma incisão na linha média a partir da fúrcula ao nível do osso hióide (Figura 3A e 3B). Sem rodeios dissecar a fáscia fina (linha pontilhada, em <strong&gt; Figura 3B) entre as glândulas submandibular com uma pinça hemostática fina e uma pinça Graefe (Figura 3B e 3C; setas azuis). NOTA: O fúrcula (seta preta na Figura 3C) e a traqueia (T na figura 3C) será visto após este passo. </li><li> Segurar o tecido mole e pele visto na parte direita da manubrium com a pinça Graefe, inserir a pinça hemostática sob a fáscia para a posição 2:00 (linha pontilhada na Figura 3C amarelo), abrir as maxilas da pinça hemostática para o libertar veia jugular do tecido circundante. </li><li> Cortar o fáscia, tecidos moles e da pele para a posição 2:00 (Figura 3C) com as tesouras cirúrgicas para expor a veia jugular direita (Figura 3D, seta). </li><li> Desenhe sobre 200-300 ul rodamina 6G solução utilizando uma seringa de 1 ml com 22 G agulha, e depois mudança-lo a 30 g de agulhas. NOTA: Isso protege a agulha 30 G de dano da sua ponta fina. Diretamente desenho da solução rodamina 6G com a agulha 30 G não vai danificar a ponta; no entanto encostar na parede do recipiente acidentalmente irá causar danos, o que pode fazer a injeção difícil. </li><li> Lave a agulha 30 G lentamente empurrando para fora a solução 6G rodamina, certifique-se não há bolhas de ar permanecer na seringa ou a agulha. Mantenha 100 ul rodamina 6G solução para injecção. </li><li> Curva 2 - 3 mm da ponta da agulha para um ângulo de 90 ° com o suporte de agulha, o que irá impedir a inserção da agulha é muito profundo para a veia jugular e faz a injecção mais facilmente controlada (Figura 3D). </li><li> Injectar a solução rodamina 6G na veia jugular direito de plaquetas de etiqueta. Para estabilizar a seringa e manter a agulha na posição, segure a seringa com uma mão e a agulha com a pinça Graefe com a outra mão durante o injection.Afinjecção ter, fixar o local da injecção com a pinça Graefe para evitar sangramento. </li><li> Abrir as maxilas da pinça hemostática e inseri-lo sob a pinça Graefe para fixar a parede do vaso no local da injecção, e depois ligar o local de injecção com um fio de sutura 6-0. NOTA: Como uma alternativa de passo 2.1.15, aplicando pressão no local da injecção com um dedo por 2 min vai parar o sangramento; No entanto, este método tem o risco de provocar sangramento adicional se o coágulo no local da injecção é removido acidentalmente. </li><li> Sem rodeios dissecar o tecido mole e fáscia em torno da glândula submandibular esquerda com a pinça hemostática e as pinças Graefe e puxe a glândula para a posição 07:00 (Figura 3E) para expor o músculo esternocleidomastóideo esquerdo (seta azul na Figura 3E). </li><li> Sem rodeios dissecar a fáscia (Figura 3E, linha pontilhada) entre o músculo esternocleidomastóideo esquerdo eo músculo omo-hióideo ou sternohymuscular oid (Figura 3E, seta verde) localizada no sítio esquerda da traqueia com a pinça hemostática. </li><li> Passe uma agulha com 6-0 sutura de seda (cerca de 15 cm de comprimento), sob a meio do músculo esternocleidomastóideo (seta azul na Figura 3E), colocar as duas extremidades da sutura juntos e puxar a sutura lateralmente em direção à posição de 10 horas . NOTA: Este procedimento deve ser realizado com cuidado para evitar lesões da veia jugular esquerda, que está localizado fora do músculo esternocleidomastóideo. </li><li> Sem rodeios separar o músculo esterno fina e / ou músculo omo-hióideo para expor a artéria carótida (CA) (Figura 3F seta) após se afastar do músculo esternocleidomastóideo. Corte o músculo esterno e / ou músculo omo-hióideo, se necessário. Use a pinça hemostática para separar o tecido mole da CA sem tocar no CA. NOTA: CA é acompanhada pelo nervo vago, a estrutura em branco considerado <strong&gt; Figura 3G (seta verde), e na maior parte dos casos, está sob o músculo esterno fina e / ou músculo omo-hióideo (entre as linhas pontilhadas amarelas na Figura 3F). </li><li> Use uma pinça fina ponta para pegar a fáscia lateral, em torno da CA, evitando o nervo vago e CA. Use outro pinça de ponta fina para perfurar um buraco na fáscia entre a CA e nervo vago. </li><li> Passe o gancho através do buraco e levante cuidadosamente a CA, e em seguida, coloque a pinça de ponta fina sob a CA. Mova o gancho e uma pinça em sentidos opostos ao longo da CA para retirar tecidos moles adventícia. Livre mm de comprimento, pelo menos, ~ 5 de CA (Figura 3H, seta azul) do tecido circundante. </li><li> Para bloquear a fluorescência de fundo, pressione a extremidade de um café agitador de plástico preto para plana, cortam o agitador do café em uma peça a 3 mm, e, em seguida, cortado longitudinalmente ao longo das arestas de dobragem para obter duas peças de &quot;U&quot; de plástico (Figura 3H, verde seta). </li><li&gt; Lavar uma peça desse &quot;U&quot; forma plástica com solução salina e segurá-la com uma pinça e colocá-lo sob a CA enquanto suavemente levantar o CA com o gancho (Figura 3H, seta verde). Aplique imediatamente 2-3 gotas de solução salina para evitar a secagem da CA. </li></ol></li><li> Em tempo real de gravação de vídeo <ol><li> Transferir a tampa do mouse, placa juntos para o estágio do microscópio e coloque em uma posição apropriada sob a lente de água 10X. Preencher o espaço entre a lente e a 10X CA com solução salina. </li><li> Inicie a aplicação do software de gravação de vídeo digital, e lançar um novo arquivo e nomeá-lo em conformidade. Gravar imagens normais dos vasos e anote o número do quadro quando a gravação de vídeo é interrompida. NOTA: Referência do software de gravação de vídeo do computador para a gravação. Nós usamos o software de gravação de vídeo digital e as seguintes descrições são baseadas nesta aplicação. NOTA: Uma vez que tra mecânicaUma pode lesionar o endotélio e levar à formação de trombos 20, que é necessário para confirmar que não há nenhuma lesão cirúrgica da parede do reservatório antes da lesão FeCl3. É também necessário para confirmar que não há tecido à volta da CA, o qual pode formar uma barreira e atenuar o efeito de lesão induzida por FeCl3. Anote o número do quadro dos registros fará com que seja fácil de analisar os vídeos de acordo tempos decorridos mais tarde. </li><li> Mova o rato com tampa placa de fora da lente de 10X. Dobre um canto de uma toalha de papel para fazer uma ponta fina e fina e usá-lo para apagar cuidadosamente a solução salina em torno do CA (evitar tocar CA), bem como em outros lugares do campo cirúrgico. Isto é importante para evitar a diluição da solução de FeCl3 utilizado. </li><li> Use uma pinça fina ponta e pegar um pedaço de papel de filtro saturado com solução de FeCl3 e colocá-lo diretamente no CA e mantê-lo no local durante 1 min. NOTA: TO visualização auxílio dos dados precisos da corrente sanguínea e de colheita, colocar o papel de filtro perto da extremidade distal do exposto CA (Figura 3I) e deixar um segmento curto no local proximal (seta verde na Figura 3I) para observar o fluxo sanguíneo na tarde fase (ver abaixo). </li><li> Remover o papel de filtro (neste ponto de tempo é definido como o início de &quot;após a lesão&quot;) e enxaguar a AC com solução salina (pelo menos 2 ml). </li><li> Coloque o mouse com a placa da tampa de volta para a lente 10X; observar o navio e começar a imagens de vídeo de discos. Anote o número de quadros de vídeo no final do primeiro minuto de gravação. NOTA: A formação de trombos é identificado pela acumulação das plaquetas fluorescentes, o que é observado em imagens de vídeo em tempo real no ecrã de computador ou sob microscópio. Gravação de imagens de vídeo imediatamente depois de colocar o mouse de volta sob o microscópio. Manter gravação para o final do primeiro minuto após a remoção do fpapel ILTER. Observar todo o recipiente a partir do distai para os locais proximais para obter dados sobre a lesão, e, em seguida, concentrar-se na área de interesse (normalmente é o centro da área lesionada) para mais de imagem. </li><li> Imagens de vídeo gravada durante 10 seg a cada minuto durante os primeiros 10 minutos (por exemplo, 02:55 - 03:05) e, em seguida, 10 segundos cada minuto até ao final da experiência. Anote os números de quadro quando cada gravação é interrompida. NOTA: Os pontos finais do modelo são: 1) quando o fluxo sanguíneo cessou durante&gt; 30 segundos; ou 2) se a oclusão não é visto em 30 minutos após a lesão. Neste caso, use 30 min para análise estatística. Definir tempo de exposição da gravação de vídeo, como 10 ms, no início, por isso vai ser fácil de observar o fluxo de sangue através da trombos. Quando os trombos se tornar grande e a fluorescência satura o sensor da câmera, torna-se difícil identificar o fluxo de sangue ao longo de trombos. Para resolver este problema, mova o ce de imagemnter ao proximal local ileso (Figura 3I, seta verde), onde o fluxo de sangue pode ainda ser claramente observado. Nós também aumentar o Exposé Tempo para 15 ou 20 ms quando o foco sobre o local lesionado-un proximal, de modo que o fluxo de sangue pode ser observado mais claramente. Quando o fluxo sanguíneo cessará, numerosas células maiores (leucócitos) começam a rolar sobre a parede do vaso no sítio proximal do trombo. Fluxo geralmente pára dentro de 2-3 minutos após o aparecimento de grandes células. Anote o tempo poderá expor na folha de gravação, se ele for alterado. É geralmente leva cerca de 30 min a partir da anestesia ao final da experiência, se foram usados ​​os ratinhos C57BL6 tipo selvagem normais. CUIDADO NOTA: Não use o coágulo de plaquetas agregadas branco como o sinal da cessação do fluxo sanguíneo, o que não vai dar uma de dados precisos e é afetado pelo tempo de exposição. O coágulo branco coberto do lúmen do vaso não significa fluxo sanguíneo cessou (veja o vídeo representante 1). </li><li&gt; No final do experimento, a eutanásia os ratos usando overdose de cetamina / xilazina (mg 200/20 / Kg), seguido por deslocamento cervical após a confirmação de nenhuma respiração e os batimentos cardíacos. </li></ol></li></ol> 3. FeCl3 Induced artéria mesentérica / Trombose Venosa Modelo <ol><li> Anestesiar 8 - ratinhos C57BL6 12 semanas de idade, como mencionado no ponto 2.1.1. Aplicar vet pomada sobre os olhos para evitar a secura durante a anestesia. </li><li> Injectar solução de papaverina (total de 0,4 mg / murganho) por via intraperitoneal para inibir o peristaltismo intestinal. </li><li> Retire a pele no pescoço e abdómen com um clipper elétrico animal. creme depilatório não é necessário. </li><li> Garantir o rato em decúbito dorsal sobre a tampa de 15 cm placa de cultura de tecidos. Use quatro pedaços de fita pequena (2 cm x 0,5 cm) para garantir todas as pernas. Utilize uma sutura 4 -0 para envolver em torno dos incisivos, fita as duas extremidades do fio de sutura para a tampa para manter o pescoço linear (Figura 2). </li><li> Siga os procedimentos 2.1.4 -2.1.15 para expor a veia jugular para a injecção de rodamina 6G a plaquetas etiqueta. </li><li> Realizar uma incisão na linha média através da pele do xifóide ao abdômen inferior usando as tesouras cirúrgicas (Figura 4A). Pegar o peritônio meio (também chamado de linha alba, Figura 4A, seta) com uma pinça Graefe, que é clara e não tem vasos sanguíneos, levante cerca de 2-3 mm de altura, confirme nenhuma intestino sob a linha de corte, e cortar o peritônio aberta longitudinalmente com as tesouras finas (Figura 4B). </li><li> Re-garantir os ratos para decúbito lateral direito. Colocar o gel de agarose semi-círculo para o abdómen, e suavemente exteriorizar os intestinos e espalhá-la no topo do gel com a pinça Graefe (Figura 4C). Use as segundas ramificações para o experimento trombose (Figura 4C, seta). NOTA: Utilize a pinça hemostática ou pinça Micro-Adson para ajudar a exteriorizar os intestinos. Evitar ferir ado intestino e o recipiente. </li><li> Colocar 5-6 gotas de solução salina para manter a humidade do intestino e vasos. Transferir o mouse com a tampa placa juntos para o estágio do microscópio e coloque na posição apropriada sob a lente seca 10X. NOTA: Use uma lente seca, porque a membrana jejunoileal não pode segurar solução salina. Certifique-se a cair solução salina sobre os tecidos expostos a mantê-los úmidos. </li><li> Seque a solução salina à volta da artéria mesentérica e na veia antes do tratamento. </li><li> Use uma pinça fina ponta para pegar um pedaço de papel de filtro saturado com solução de 12,5% FeCl3 e colocá-lo diretamente na artéria mesentérica e veia durante 1 min (Figura 4D). Remover o papel de filtro (neste ponto de tempo é definido como o início de &quot;após a lesão&quot;) e enxaguamento a artéria mesentérica e na veia feridos com solução salina (pelo menos 2 ml). </li><li> Coloque o mouse com placa de tampa de volta sob a lente seca 10X; observar os vasos e começar a recimagens de vídeo ord como mencionado no 2.2). NOTA: Os pontos finais desta experiência são: 1) quando o fluxo sanguíneo cessou durante&gt; 30 segundos; ou 2) se a oclusão não é visto em 30 minutos após a lesão, e, neste caso, usar 30 minutos para análise estatística. </li><li> No final do experimento, a eutanásia os ratos usando overdose de cetamina / xilazina (mg 200/20 / Kg), seguido por deslocamento cervical após nenhuma respiração e batimentos cardíacos são confirmadas. </li></ol>

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<li>Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vav+Guanine+nucleotide+exchange+factors+regulate+atherosclerotic+lesion+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).</li>
<li>Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+signaling+by+the+scavenger+receptor+CD36%3A+implications+in+atherosclerosis+and+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Clin+Climatol+Assoc%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis.</a> Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).</li>
<li>Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+biologically+active+oxidized+phospholipids+show+on-going+and+increased+oxidative+stress+in+older+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice.</a> Redox Biol. 1, 110-114 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O FeCl3 induzida pelo modelo é um dos modelos mais amplamente utilizados de trombose, que não só pode fornecer informações valiosas sobre as modificações genéticas na função das plaquetas e trombose 7,8,16,19,31-33, mas também pode ser uma ferramenta valiosa para a avaliação de compostos terapêuticos e estratégias para o tratamento e prevenção das doenças aterotrombóticas 11,17,34-37. Aqui temos mostrado nossas modificações e aperfeiçoamentos do presente modelo e mostrou evidência adicio...

trombose arterial (coágulo de sangue) é uma complicação comum de muitas doenças sistêmicas associadas à inflamação crônica, incluindo a aterosclerose, diabetes, obesidade, câncer e doenças reumatológicas auto-imunes crônicas. Trombos que ocorrem no tronco circulação arterial a partir inadequado ativação plaquetária, agregação e mecanismos coagulante subsequentes e estão implicados em ataques cardíacos, derrames e perda de extremidade. A parede do vaso é um sistema complexo que inclui vários tipos de células e é influenciada por uma multitude de factores extrínsecos, incluindo tensão de corte, as células sanguíneas, hormonas e citocinas, bem como a expressão de proteínas antioxidantes que circula na parede do vaso. Experiências in vitro não pode replicar neste ambiente complexo e, por conseguinte, em estudos in vivo utilizando modelos animais são críticos para permitir uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos em doenças trombóticas. Os ratos têm mostrado ter SIMmecanismos lhantes aos seres humanos em termos de trombose, aterosclerose, inflamação e diabetes 1,2. Além disso, camundongos transgênicos e knockout podem ser criados para testar a função de produtos de genes específicos em uma fisiológica complexa ou ambiente patológico. Tais estudos imitar patologia humana e pode fornecer informações mecanicista importante relacionado à descoberta de novos caminhos e terapias, bem como fornecer detalhes importantes na caracterização de efeitos de drogas sobre a trombose. Trombos arteriais patológicas ocorrer devido à lesão endotelial camada ou disfunção e a exposição do fluxo de sangue para a matriz subendotelial 3,4. Vários modelos de trombose foram desenvolvidos para induzir esse dano endotelial tais como dano mecânico, dano oxidativo baseado em Bengal composto fotorreativa Rose e ferimentos de laser 5. Neste espectro, cloreto férrico (FeCl3) induzida por lesão vascular é um modelo amplamente usado de trombose. Este reagente quandoaplicada ao aspecto exterior dos navios induz danos oxidativos para células vasculares 6-8, com a perda da protecção de células endoteliais a partir de plaquetas e componentes da cascata de coagulação circulantes. O modelo FeCl3 é simples e sensível para ambos os anticoagulantes e anti-plaquetas drogas, e foi realizada em artérias carótida e femoral, veias jugulares e mesentérica e arteríolas cremastérico e vênulas em ratinhos, ratos, cobaias e coelhos 6-15. Um parâmetro mensurável neste modelo é o tempo decorrido de uma lesão para completar oclusão do vaso, medida como a cessação do fluxo sanguíneo com um medidor de fluxo de Doppler ou sob observação directa com 6,7,9 microscopia intravital. Uma gama de tempos de entre 5 a 30 min tem sido relatada em diferentes estudos em ratinhos C57BL6 7-10,16, sugerindo que as concentrações de FeCl 3, tipos de anestesia, técnicas cirúrgicas, idade rato, fundo genómico, método de medição bfluxo lood, e outras variáveis ​​ambientais têm efeitos significativos neste modelo. Esta ampla variabilidade faz com que seja difícil comparar estudos de diferentes grupos de pesquisa e pode fazer a detecção de diferenças sutis difícil. Com uma visão para minimizar tais variabilidades e estabelecer um uniforme reprodutível em sistema de modelo vivo, temos refinado o modelo de artéria carótida induzida por FeCl3 que faz com que os dados altamente reproduzíveis com o mínimo de variação 6-10,16-19. Neste artigo descrevemos e compartilhar as habilidades e relatar vários exemplos experimentais representativos que podem beneficiar a partir deste modelo.

<table><tbody><tr><td>Tesoura Cirúrgica - Ferramentas de Ciência Fina de Carboneto de Tungstênio</td><td>&nbsp;</td><td>14502-14</td><td>corte e segure a pele</td></tr><tr><td>Pinça Micro-Adson - Serrilhada/Reta/12 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp;</td><td>11018-12</td><td>cortar e segurar a pele</td></tr><tr><td>Metzenbaum Tesoura Fina - Carboneto de Tungstênio/Curvo/Blunt-Blunt/14.5 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp;</td><td>14519-14&nbsp; &nbsp;</td><td>para dissecar e separar tecidos moles</td></tr><tr><td>Hemostat Ultra Fino - Liso/Curvo/12.5 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp;</td><td>13021-12</td><td>para dissecar e separar tecidos moles</td></tr><tr><td>Gråefe Fórceps - Serrilhado/Reto/10 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp;</td><td>11050-10</td><td>para dissecar e separar tecidos moles</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinça Fina - Dicas de Biologia/Reto/Inox/11 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp;</td><td>11254-20&nbsp;</td><td>Isole o vaso do tecido circundante</td></tr><tr><td>Fórceps #5XL Dumont - Pontas Padrão/Retas/Inox/15 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp;</td><td>11253-10</td><td>Isolador do vaso do tecido circundante</td></tr><tr><td>Gancho sem corte- 12 cm/0.3 mm Diâmetro da ponta</td><td>Ferramentas de ciência fina&nbsp;</td><td>10062-12</td><td>Vaso isolado do tecido circundante</td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Needle Holders</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>12061-02</td><td>Agulhas Porta-Agulhas</td></tr><tr><td>Sutura 4-0</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp;</td><td>18020-40</td><td>Para fixar os incisivos na placa</td></tr><tr><td>Sutura Thread 6-0</td><td>Ferramentas de Ciência Fina&nbsp;</td><td>18020-60</td><td>Para todas as agulhas de sutura Kalt para cirurgia e ligadura</td></tr> Ferramentas <tr><td></td><td>de ciência fina&nbsp;</td><td>12050-03</td><td></td></tr><tr><td>rodamina 6G&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>83697-1G</td><td>Para lebel plaquetas</td></tr><tr><td>FeCl3 (Anidro)</td><td>Sigma</td><td>12321</td><td>Para induzir lesão nos vasos</td></tr><tr><td>Cloridrato de papaverina</td><td>Sigma</td><td>P3510</td><td>Para inibir o peristaltismo intestinal.</td></tr><tr><td>Fitas de Autoclave a Vapor para Esterilização de Instrumentos Cirúrgicos Medline</td><td></td><td>111625</td><td>Para fixar o mouse na placa</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Filtros de Seringa - Estéril 0.22 &micro; m</td><td>Fisher</td><td>09-720-004</td><td>Para esterilização de soluções injetadas em camundongos</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Filtros de Seringa - Estéril 0.45 &micro; m</td><td>Fisher</td><td>09-719D</td><td>Para filtrar a solução FeCl3</td></tr><tr><td>Almofada de preparação de álcool estéril</td><td>Fisher</td><td>06-669-62</td><td>Para esterilizar o local cirúrgico</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>Para fazer estágio de gel</td></tr>, <tr><td>microscópio fluorescente Leica DMLFS</td>, microscópio <td>Leica</td><td></td><td>Intravital,</td></tr><tr><td>plataforma GIBRALTAR e sistema de estágio XY com placa de aquecimento anexada.</td><td>npi electronic GmbH</td><td></td><td>http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html</td></tr><tr><td>Streampix versão 3.17.2 software</td><td>NorPix</td><td></td><td>https://www.norpix.com/</td></tr></tbody></table>

férricos induzida pelo cloreto modelos murinos trombose

Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models

A trombose arterial (coágulo sanguíneo) é uma complicação comum de muitas doenças sistêmicas associadas à inflamação crônica, incluindo aterosclerose, diabetes, obesidade, câncer e distúrbios reumatológicos autoimunes crônicos. Os trombos são a causa da maioria dos ataques cardíacos, derrames e perda de extremidades, tornando a trombose um problema de saúde pública extremamente importante. Como esses trombos decorrem da ativação plaquetária inadequada e subsequente coagulação, direcionar esses sistemas terapeuticamente tem um significado clínico importante para o desenvolvimento de tratamentos mais seguros. Devido às complexidades do sistema hemostático, experimentos in vitro não podem replicar as interações sangue-parede do vaso; Portanto, estudos in vivo são fundamentais para entender os mecanismos patológicos de formação de trombos. Para este fim, vários modelos de trombose foram desenvolvidos em camundongos. Entre eles, a lesão vascular induzida por cloreto férrico (FeCl3) é um modelo amplamente utilizado de trombose oclusiva que relata a ativação e agregação plaquetária no contexto de um sistema vascular fechado asséptico. Este modelo é baseado na lesão de células endoteliais induzida por redox, que é simples e sensível a medicamentos anticoagulantes e antiplaquetários. O tempo necessário para o desenvolvimento de um trombo que obstrui o fluxo sanguíneo fornece uma medida quantitativa de lesão vascular, ativação e agregação plaquetária que é relevante para doenças trombóticas. Refinamos significativamente este modelo de trombose vascular induzida por FeCl3, o que torna os dados altamente reprodutíveis com variação mínima. Aqui descrevemos o modelo e apresentamos dados representativos de várias configurações experimentais que demonstram a utilidade desse modelo na pesquisa de trombose.

Carótida Thrombosis Modelo Em ratos com C57BL6 fundo, recomendamos a utilização de 7,5% FeCl3 para tratar o navio durante 1 min como ponto de partida. Sob o tratamento de 7,5% FeCl3, fronteiras da área lesada e parede normal do vaso são facilmente identificados sob o microscópio (Veja o vídeo on-line 1), sugerindo que a camada endotelial foi significativamente danificada. Os trombos formados imediatamente após FeCl3</sub...

Nós relatamos um procedimento refinada do cloreto férrico (FeCl3) modelos de trombose induzidas na carótida e mesentérica artéria, bem como veia, caracterizado de forma eficiente através de microscopia intravital para monitorar tempo para oclusiva formação de trombos.

Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir trombose induzida por cloreto férrico em um modelo de artéria carótida de camundongo, a fim de obter resultados altamente reprodutíveis, conforme analisado por microscopia intravital. Esses camundongos podem ajudar a responder perguntas fundamentais sobre diversas doenças ou distúrbios genéticos associados à ativação plaquetária e à agregação no sistema vascular fechado. A principal vantagem desta técnica é que ela é simples e sensível tanto a medicamentos anticoagulantes quanto a antiplaquetários, além de poder ser combinada com outras técnicas.Este método pode ser utilizado para obter informações valiosas sobre a fisiopatologia da trombose, descobrir novos mecanismos e terapias e avaliar os efeitos de fármacos inovadores, incluindo nanomedicina direcionada, sobre a trombose. A visualização deste método é fundamental para aprender as estratégias de obtenção do tempo preciso de cessação do fluxo sanguíneo. Após confirmar a ausência de resposta ao aperto no dedo do pé, utilize pequenas tesouras elétricas para animais para remover os pelos do pescoço e do tórax superior de um camundongo com idade entre oito e 12 semanas.Aplicar pomada oc

ferric-chloride-induced-murine-thrombosis-models

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O modelo de trombose induzida por FeCl3 em camundongos é descrito aqui. Um método para monitorar o crescimento do trombo por observação de microscopia intravital em um vaso mesentérico e por medição do fluxo sanguíneo na artéria carótida é apresentado.

Férrico Thrombosis Modelo rato na artéria carótida e Mesentery Vessel induzida por Chloride

Aqui, apresentamos as modificações necessárias para um bem caracterizado e comumente usado pequenos induzida por cloreto férrico (FeCl3) artéria carótida lesão modelo animal para uso em um modelo de grandes animais de lesão vascular. O modelo resultante pode ser utilizado para avaliação experimental pré-clínicos profilática e trombolítica intervenções farmacológicas e mecânica.

Trombose da artéria carótida canino induzida por cloreto férrico: Um modelo Animal grande de lesão Vascular

O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.

Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D

Este estudo apresenta um protocolo para estabelecer um modelo reprodutível e minimamente invasivo em rato da trombose do seio sagital superior induzida por cloreto férrico, utilizando um método de sutura de seda em combinação com imagem de contraste de manchas a laser e ultrassom de alta resolução para avaliação.

Estabelecimento de uma trombose do seio sagital superior induzida por cloreto férrico modificado

A indução eletrolítico de ativação endotelial na superfície interna da Vena Cava Inferior resultados na formação venosa tipo trombo devido à ativação endotelial e parciais a estagnação do sangue, dois componentes da tríade de Virchow.

Eletrolítico Veia Cava Inferior Model (EIM) de trombose venosa

O rato modelo estase completa de veia cava inferior trombose produz quantidades mensuráveis ​​de tecido veia parede e trombo. Ele tem se mostrado útil para avaliar as interações entre a parede da veia eo trombo oclusivo e na avaliação da progressão de aguda a inflamação crônica.

Modelo do mouse completa de Stasis Inferior Trombose da veia cava

Análise de conteúdo de gordura é rotineiramente realizada em estudos utilizando modelos murinos obesidade. Métodos emergentes de pequenos animais a tomografia computadorizada ea análise estão fornecendo para longitudinal de análise de conteúdo de gordura riqueza de detalhes. Aqui passo detalhamos por procedimentos passo para a realização de pequenos animais tomografia computadorizada, análise e visualização.

Segmentação e medição de volumes de gordura em modelos de obesidade em roedores usando raios-X Tomografia Computadorizada

Descrevemos procedimentos para quantificar e caracterizar lesões ateroscleróticas em modelos de camundongos usando secção de precisão do seio aórtico e da aorta ascendente combinada com análise histoquímica e imuno-histoquímica.

Análise quantitativa e caracterização das lesões ateroscleróticas no seio aórtico murino

Modelos pré-clínicos de hemorragia intracerebral são utilizados para imitar certos aspectos da doença clínica. Assim, mecanismos de lesão e potenciais estratégias terapêuticas podem ser explorados. Neste protocolo, dois modelos de hemorragia intracerebral são descritos, injeções intraestriatais (gânglios da base) de sangue autólogo ou colagenase.

Injection intraestriatal de sangue autólogo ou Clostridial colagenase como modelos murinos de hemorragia intracerebral

O cancro é uma doença complexa que é influenciada pelo tecido circundante do tumor, bem como pro- local e anti-inflamatórias mediadores. Portanto, os modelos de injeção ortotrópicas, ao invés de modelos subcutâneos pode ser útil para estudar a progressão do câncer de uma forma que melhor mimetiza patologia humana.

Injeção Orthotopic de células cancerosas da mama na mamária Fat Pad de Ratos para o Estudo de crescimento tumoral.

Aprenda a induzir trombose com cloreto férrico em artérias carótidas e mesentéricas de camundongos usando microscopia intravital. Este método reprodutível permite avaliar efeitos de anticoagulantes e antiplaquetários em tempo real.

Férricos induzida pelo cloreto modelos murinos Trombose

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