Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

O objetivo geral deste procedimento é comparar a eficácia e a toxicidade de novos RNAs direcionados à produção de HIV-1. Este método pode ajudar a identificar novas moléculas de RNA para o uso do gene do HIV-1 ou terapia medicamentosa, como grampo curto ou pequenos RNAs interferentes, ribozimas e iscas de RNA. A principal vantagem dessa técnica é que vários novos designs de RNA podem ser rastreados simultaneamente com um tempo de resposta rápido.

Embora esse método tenha sido projetado para avaliar novos medicamentos de RNA ou terapia genética para o HIV, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como pequenas moléculas ou tarefas CRISPR. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando estávamos montando experimentos para rastrear um grande número de ribozimas quanto aos efeitos anti-HIV. Para começar, prepare uma suspensão de células 293T do rim embrionário humano em duas vezes 10 elevado à quinta células por mililitro em DMEM com 10% FPS e 1% de estreptomicina de penicilina.

Adicione 500, 100 e 1.000 microlitros da suspensão celular a cada um dos poços de placas de 24, 96 e 12 poços para produção viral, viabilidade celular e ensaios de ativação imunológica, respectivamente. Agite suavemente as placas e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono a 50% a 70% de confluência. Para o ensaio de produção viral, prepare uma diluição de 10 nanogramas por microlitro de um plasmídeo de expressão do HIV-1 e adicione 10 microlitros a cada tubo de ensaio.

Em seguida, preparar cinco diluições micromolares de ARN de ensaio e de um ARN de controlo negativo. Em seguida, adicione 2,5 microlitros ou 10 microlitros de cada RNA de teste e diluição de controle negativo aos tubos correspondentes para concentrações finais de 25 nanomolares ou 100 nanomolares. Para o ensaio de viabilidade celular, preparar cinco diluições micromolares de ARN de ensaio e uma diluição de 10 miligramas por mililitro do ARN de controlo positivo, poli(I:C) de baixo peso molecular. Adicionar dois microlitros do ARN de ensaio ou das diluições do ARN de controlo positivo aos tubos correspondentes para concentrações finais de 100 nanomolares ou 200 microgramas por mililitro, respectivamente.

Para o ensaio de ativação imunológica, adicione 20 microlitros de RNA de teste ou diluições de RNA de controle positivo, conforme preparado para o ensaio de viabilidade celular, aos tubos correspondentes para concentrações finais de 100 nanomolares ou 200 microgramas por mililitro, respectivamente. Em seguida, adicione 50, 25 ou 75 microlitros de DMEM a cada tubo de transfecção para ensaios de produção viral, viabilidade celular e ativação imunológica, respectivamente. Para ensaios de produção viral, leve as células e os tubos de transfecção preparados para um laboratório de nível de biossegurança três, ou BSL-3, antes da próxima etapa.

Adicione dois microlitros do reagente de transfecção sequencialmente aos tubos de transfecção e incube por 15 a 20 minutos para permitir a formação de complexos. Adicione toda a mistura de transfecção de cada microtubo gota a gota às posições correspondentes nas placas de cultura de células. Gire suavemente e incube as placas por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Para realizar o ensaio de produção viral, após remover as placas de cultura de células de 24 poços da incubadora, transfira-as para a coifa de cultura de células BSL-3. Agite suavemente as placas e, em seguida, transfira 150 microlitros do sobrenadante de cada poço para um poço correspondente em uma placa de fundo plano de 96 poços para ser usada para quantificar a produção de HIV-1. Transfira cinco microlitros de sobrenadante para os poços correspondentes em uma placa de 96 poços contendo 25 microlitros de um coquetel de interrupção viral.

Depois de incubar a mistura por cinco minutos em temperatura ambiente, transfira a placa para uma estação de trabalho de radioatividade. Em seguida, prepare um coquetel radioativo e adicione 25 microlitros a cada poço de sobrenadante viral e coquetel de interrupção. Incube as placas a 37 graus Celsius por duas horas.

Coloque cinco microlitros da mistura de reação nos quadrados correspondentes em um papel de fibra de vidro / tapete de filtro DEAE e deixe as manchas secarem por 10 minutos. Use 2x tampão SSC para lavar os papéis cinco vezes por cinco minutos cada, seguido de duas lavagens de um minuto com etanol a 95%. Deixe os papéis secarem antes de selá-los em sacos de amostra.

Prenda os sacos de amostra contendo o papel da esteira filtrante em um e insira o em um contador de cintilação de microplacas. Em seguida, inicie o contador. Para qualquer método de quantificação viral, divida os valores obtidos para cada RNA de teste pelo controle negativo adjacente e multiplique esse valor por 100 para obter a porcentagem de inibição da produção de HIV-1 para cada réplica dos RNAs de teste.

Para realizar um ensaio de viabilidade celular, após remover as placas de 96 poços da incubadora, adicione 20 microlitros de cinco miligramas por mililitro MTT e DPBS a cada poço. Em seguida, incube as placas por três horas a 37 graus Celsius. Adicione 150 microlitros de isopropanol acidificado com detergente a cada poço e incube as placas em temperatura ambiente por duas horas.

Em seguida, use um espectrofotômetro de microplacas para determinar a absorbância em 570 nanômetros. Calcule o metabolismo relativo do MTT para cada controle positivo e teste o RNA dividindo o valor obtido para cada amostra por seu controle de transfecção adjacente. Para o ensaio de ativação imunológica, após remover as placas de 12 poços da incubadora, aspire o meio de cultura e use DPBS para lavar suavemente as células duas vezes.

Em seguida, adicione 70 microlitros de tampão de lise fria contendo inibidores de protease e fosfatase a cada poço e incube as placas no gelo por 10 minutos. Transfira os lisados celulares para microtubos e congele-os rapidamente imergindo os tubos em nitrogênio líquido. Depois de permitir que as amostras descongelem, congele-as mais duas vezes, para um total de três ciclos de congelamento e descongelamento.

Em seguida, centrifugue os lisados a 15.700 vezes g e 4 graus Celsius por 15 minutos para pellet os detritos celulares. Em seguida, após a eletroforese e transferência para uma membrana, revele as bandas de proteínas incubando a membrana em Ponceau S por um minuto. Em seguida, lave-o com água bidestilada

Use as bandas e a escada de proteínas como guia para cortar a membrana a 80 e 55 kilodaltons. Agora, use TBS com 0,05%TWEEN 20 ou TBST para lavar a coloração Ponceau S. Adicione TBST com 5% de leite desnatado para cobrir completamente as membranas e incube-as em temperatura ambiente com agitação por uma hora.

Transfira as membranas para TBST com 3% BSA e anticorpos diluídos 1: 1, 000 para ADAR, fósforo-PKR e fósforo-IRF3 para as partes superior, intermediária e inferior da membrana, respectivamente. Incubar a 4 graus Celsius com agitação durante a noite. Na manhã seguinte, use TBST para lavar as membranas cinco vezes por cinco minutos cada, antes de transferir para TBST com 5% de leite desnatado e anticorpos secundários anti-coelho de cabra marcados com peroxidase 1:5.000 por uma hora.

Depois de visualizar as bandas de proteína nos filmes, use uma solução de decapagem para lavar as partes intermediária e inferior da membrana por 10 minutos, antes de incubar a parte intermediária da membrana em anticorpos PKR e a parte inferior em anticorpos IRF3. Como controle positivo, sonde a membrana inferior com anticorpos contra a actina de acordo com o protocolo de texto. Um esquema geral dos ensaios é mostrado aqui com um exemplo de plano de transfecção para três RNAs de teste e um RNA de controle.

Para ensaios de produção viral e viabilidade celular, a leitura de cada construção de teste é normalizada para um controle negativo. Usando o ensaio de produção de HIV-1 em células transfectadas com um plasmídeo expressando a cepa de HIV-1 NL4-3, a porcentagem de atividade de RT em células co-transfectadas com um dos siRNAs mostrados aqui, em comparação com células transfectadas com um longo siRNA sem sentido de substrato Dicer, foi calculada para identificar o comprimento ideal das moléculas de interferência de RNA direcionadas a um local conservado no RNA do HIV-1. Usando os siRNAs mais eficazes identificados, o metabolismo percentual do MTT foi determinado para células transfectadas.

Ao longo do RNA de fita dupla, o poli(I:C)reduziu a viabilidade celular apenas na dose mais alta. Nenhuma redução significativa na viabilidade celular foi observada para siRNAs direcionados ao sítio 1498 no RNA do HIV-1, independentemente de seu comprimento. Como demonstrado aqui por Western blot, o mesmo conjunto de RNAs foi avaliado no ensaio de ativação imunológica.

Sob condições em que poli (I: C) ativou a expressão de ADAR1-p150 e induziu a fosforilação de PKR e IRF3, nenhum efeito significativo em quaisquer marcadores de inativação pôde ser observado para qualquer um dos RNAs de teste. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em sete dias, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante usar preparações de alta qualidade de RNA e DNA para transfecção.

Além disso, incluir os controlos negativos e positivos adequados. Após este procedimento, outros métodos, como a infecção pelo HIV de células transduzidas, podem ser usados para avaliar a eficácia e toxicidade a longo prazo de potenciais candidatos anti-HIV. Após seu desenvolvimento, essa técnica nos permitiu identificar um local-alvo acessível e conservado no RNA do HIV e otimizar os formatos de ribozimas, shRNAs e siRNAs direcionados a ele.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rastrear rapidamente novos candidatos de RNA direcionados à produção de HIV quanto à eficácia usando o ensaio de produção viral e toxicidade potencial usando os ensaios de ativação imunológica e viabilidade celular. Não se esqueça de que trabalhar com HIV e nucleotídeos radiomarcados pode ser extremamente perigoso. Precauções como o uso de laboratórios certificados de biossegurança e radioatividade devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.