Name: Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a avaliar a eficácia e toxicidade de RNAs direcionados à produção do HIV-1 usando células 293T. Este método permite triagem simultânea de múltiplos designs de RNA para terapia gênica ou quimioterapia.

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O trabalho aqui apresentado foi apoiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (concede DCB-120.266, PPP-133377 e HBF-348967 para AG).

1. Células e transfecções <ol><li> Culturas de células HEK 293T em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Prepara-se uma suspensão de 2 x 10 5 células / mL no meio de cultura celular. Adicionar 500, 100 e 1.000 mL da suspensão de células a cada poço de 24 poços, 96 poços e 12 poços placas, para a produção virai, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente (Figura 2A). </li><li> Agite suavemente as placas e incubar O / N a 37 ° C com 5% de CO 2. Cultivar células a 50-70% de confluência. </li><li> De acordo com um plano de transfecção, preparar diluições de ARN de teste e os controlos em tubos de 1,5 ml (micro exemplo, a Figura 2B). <ol><li> Para o ensaio de produção viral, preparar uma diluição de 10 ng / ul de um plasmídeo de expressão de HIV-1 e adicionar 10 uL a cada tubo. Próximo preparar 5 uM diluições de ARN de teste e um controlo negativo RNA. Adicionar 2,5 ou 10 ul de cada diluição de ARN de teste e de controlo negativo aos tubos correspondentes para 25 ou 100 nM de concentração final. </li><li> Para o ensaio de viabilidade de células, preparar 5 uM diluições de ARN e um teste de 10 mg / ml de diluição do ARN de controlo positivo, de baixo peso molecular, poli I: C. Adicionar 2 mL de ARN de teste, ou de diluições de ARN controlo positivo para os correspondentes tubos de 100 nM ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente. </li><li> Para o ensaio de activação imunitária, adicionar 20 ul de ARN de teste, ou de diluições de ARN de controlo positivo, preparado no passo 1.3.2. aos tubos correspondentes para 100 nm ou 200 ug / ml de concentração final, respectivamente. Nota: Para os plasmídeos de expressão de ARN de teste, preparar diluições de 10 ng / ul em vez dos 5 uM diluições de ARN de teste, dando quantidades finais de 25 e 100 ng para o passo 1.3.1. e 100 ng para etapas 1.3.2. e 1.3.3. </li></ol></li><li> Adicionam-se 50, 25 ou 75 ul de DMEM a cada tubo de transfecção para prod viralução, a viabilidade celular e ensaios de activação imunitária, respectivamente. Para os ensaios de produção virais, trazem células e tubos de transfecção preparados para a 3 (BSL3) laboratório nível bio-segurança antes da próxima etapa. </li><li> Adicionar 2 ml da sequencialmente reagente de transfecção para os tubos de transfecção e incubar 15 min a 20 para permitir que os complexos de modo a formar. Ver a Tabela de Materiais para o reagente de transfecção específico a ser utilizado. </li><li> Adicionar toda a mistura de transfecção de cada gota a gota, para as posições correspondentes nas placas de cultura de células micro tubo. Agite suavemente e incuba-se as placas durante 48 h a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Meça HIV-1 de produção (seção 2), a viabilidade celular (seção 3) e ativação imune (secção 4) nas placas de cultura de células (Figura 2C). </li></ol> 2. Ensaio de produção virai <ol><li> Remover as placas de cultura celular de 24 poços da incubadora e agitar suavemente as placas no interior da cultura de células BSL3capuz. Transferir 150 ul de sobrenadante de cada poço para um poço correspondente de uma placa de 96 poços de fundo plano, que vai ser utilizado para quantificar a produção de HIV-1. Nota: Os ensaios de quantificação virais mais comuns incluem a medição da expressão da proteína da cãpside de HIV-1 (p24) pelo ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) 20, a quantificação de ARN viral por transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) 21 e medindo a actividade da enzima RT HIV-1. Passos 2.2 a 2.5 explicar métodos para quantificar HIV-1 actividade RT 13,15,16. </li><li> Transferência de 5 ul de sobrenadante para poços correspondentes de uma placa de 96 poços, contendo 25 ul de uma perturbação viral cocktail 15 (Tabela 1). Incubar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente e transferir a placa para uma estação de trabalho radioactividade. Nota: Passo 2.2. só é necessário se uma estação de trabalho de radioactividade que não está disponível no laboratório BSL3. Se as placas não precisam de ser removidos dolaboratório BSL3, vá para o passo 2.3. e adicionar 50 ul de radioactivos / viral cocktail ruptura (Tabela 1) em lugar dos 25 ul de coquetel radioactivos. </li><li> Prepara-se uma radioactivos cocktail 15 (Tabela 1), e adicionar 25 ul a cada poço de sobrenadante viral e cocktail de interrupção. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Ponto 5 uL da mistura de reacção sobre quadrados correspondentes de uma fibra de vidro Di Etil amino-etil (DEAE) de papel filtermat e deixar que as gotas para secar durante 10 min. Manchar a mistura de reacção em todos os outros quadrados de modo que não há duas amostras Boarder diretamente um ao outro. Isto ajuda a evitar o cruzamento entre amostras para determinar as contagens por minuto (cpm) no passo 2.6. </li><li> Lavar os papéis 5x durante 5 min com tampão de 2x citrato de sódio salino (SSC) (Tabela 1), seguido por duas lavagens com um mínimo de 95% de etanol. Permitir que os papéis para secar e selá-los em sacos de amostras. </li><li> Clip sacos de amostras containing do papel filtermat em uma fita e insira a cassete em um contador de cintilação de microplacas. Definir o contador para ler cpm de 32 P com a data de referência prevista para o lote de [32 P] dTTP utilizado na experiência. Selecionar quais amostras de ler usando o mapa da placa e iniciar o contador. </li><li> Para qualquer método de quantificação viral, dividir os valores obtidos para cada teste de ARN pelo controlo negativo adjacente e multiplicar este valor por 100 para obter a percentagem de inibição da produção do VIH-1 para cada repetição dos ARN de teste. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste em diferentes concentrações é fornecido na Figura 3. </li></ol> 3. ensaio de viabilidade celular <ol><li> Remover as placas de 96 poços a partir da incubadora e adicionar 20 uL de 5 mg / ml de MTT (brometo de 3- [4,5-dimetil-2-tiazolil] -2,5-difenil-2H-tetrazólio), diluído em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ( DPBS) a cada poço. Incubar as placas de fou 3 horas a 37 ° C. </li><li> Adicionar 150 uL de isopropanol, acidificado com detergente (1% de NP-40, de HCl 4 mM em isopropanol) a cada poço e incuba-se as placas durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Determinar a absorvância a 570 nm num espectrofotómetro de microplacas. </li><li> Calcular o metabolismo de MTT relativo para cada ARN de controlo e de teste positivo, dividindo o valor obtido para cada amostra pelo seu controlo de transfecção adjacente. Um exemplo dos resultados que comparam diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecida na Figura 4. </li></ol> 4. Activação Ensaio Imunológico <ol><li> Remover as placas de 12 poços a partir da incubadora e aspirar o meio de cultura. Lavar suavemente as células duas vezes com DPBS e adicionar 70 ul de tampão de lise frio de 22 (incluindo os inibidores de protease e fosfatase, quadro 1) a cada poço. Incubar as placas durante 10 min em gelo. </li><li> Transferir os lisados ​​celulares para micro tubos e rápido congelá-los por imersão dotubos em azoto líquido. Permitir que as amostras para descongelar e repetir por mais 2 ciclos de congelação descongelação para um total de 3. </li><li> Centrifugar os lisados ​​durante 15 minutos a 4 ° C, 15700 x g, para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante para novos tubos de micro e determinar a concentração de proteína usando o método de azul de Coomassie (Bradford) 23,24. </li><li> Resolver 75 ug de proteína de cada amostra num gel de poliacrilamida desnaturante a 10% e transferir para uma membrana de nitrocelulose como anteriormente descrito 25,26. </li><li> Após electroforese e transferência para uma membrana, revelam bandas de proteína por incubação da membrana em Ponceau S (Tabela 1) durante 1 min seguido de lavagem em água destilada duas vezes. Use as bandas e escada proteína como um guia para cortar a membrana em 80 e 55 kDa. Nota: No passo 4.4 amostras pode ser executado em 16 x 18 cm 2 géis para baixo a 34 kDa, de modo que é fácil de cortar a membrana nas posições especificadas e não cortar através dabandas de interesse. Alternativamente, vários géis podem ser executados com as mesmas amostras para evitar o corte da membrana. </li><li> Lavar a coloração de Ponceau S com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween 20 (TBST, Tabela 1). Adicionar TBST com leite não gordo a 5% para cobrir completamente as membranas. Incubam-se as membranas à temperatura ambiente com agitação durante 1 h. </li><li> Incubam-se as membranas de O / N em TBST, com 3% de albumina de soro bovino (BSA) e anticorpos diluídos a 1: 1000 contra ADAR1 (110 e 150 kDa), fosfo-PKR (62 kDa), e fosfo-IRF3 (47 kDa), para as peças de topo, meio e inferior da membrana, respectivamente. </li><li> Lavam-se as membranas 5x durante 5 min com TBST e incubar em TBST com 5% de leite sem gordura e os anticorpos secundários anti-coelho de cabra marcado com peroxidase (diluído a 1: 5000) durante 1 h. </li><li> Lava-se a membranas de 5x durante 5 min com TBST e aplicar a solução de electroquimioluminescência (ECL) para visualizar as bandas em películas de acordo as instruções do fabricante. </li><li> Depois de visualizar as bandas de proteína sobre os filmes, lavar as peças do meio e inferior da membrana durante 10 minutos com uma solução de anticorpo de extracção. Incubam-se as membranas de o / n em TBST, com 3% de BSA e anticorpos contra PKR total de (a 1 em 500) e IRF3 (a 1 em 1000), para o meio e pedaços de fundo, respectivamente. Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho para a membrana PKR (meio). </li><li> Lava-se a peça de fundo da membrana 5x durante 5 min com TBST e incubar a membrana em TBST, com 3% de BSA durante 1 hora com um anticorpo contra actina (diluído a 1: 5000). Repita os passos 4.8. e 4,9. usando marcado com peroxidase de cabra anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho. Um exemplo de resultados comparando diferentes RNAs de teste e um controlo positivo é fornecido na Figura 5. Veja a Tabela de Materiais para os anticorpos específicos a serem utilizados. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O ensaio de produção de HIV-1 descrita foi realizada utilizando células HEK293T (Figura 2) e é semelhante para os ensaios utilizados para rastrear ARN de HIV-1 para ribozima eficaz 13, shRNA 10,29, ARNsi 30, e U1i locais de ARN alvo 11,31. Usando diferentes métodos para quantificar a produção de HIV-1, a maioria dos estudos mediram a produção virai de 48 h após a co-transfecção de um plasmídeo de expressão do VIH-1 com RNAs candidatos. Após a produção do VIH-1...

Uma limitação dos actuais tratamentos do HIV-1 é que eles devem ser cronicamente administrado para prevenir a progressão da doença. Transplantação de VIH-1 resistente a linfócitos T, ou células-tronco hematopoiéticas, tem o potencial para proporcionar um controlo de longa duração de replicação do HIV-1 na ausência do tratamento medicamentoso 1,2 e pode também ser uma abordagem eficaz para atingir uma cura de HIV-1 3. Uma maneira de tornar as células resistentes ao HIV-1 é a replicação para inserir um ou mais genes que codificam para anti-HIV-1 RNA ou péptidos em células de um indivíduo infectado durante um transplante autólogo 4. Vários genes candidatos anti-VIH-1 foram concebidos com alguns estudos clínicos que entram em combinações de dois ou três 5 6, para prevenir o desenvolvimento de resistência do HIV-1 para um único gene. Anti-HIV-1 RNA estão entre os principais candidatos para a terapia de combinação de genes devido ao seu baixo potencial para provocar respostas imunes e porquesão transcritas a partir de sequências de genes muito curtos. Alguns-HIV-1 anti RNAs foram projetados para direcionar entrada e de integração viral. No entanto, a maioria dos ARNs anti-HIV-1 como alvo passos pós-integração no ciclo de vida viral (Figura 1). Inibidores pós-integração incluem RNAs de engodo, tendo como alvo os HIV-1 proteínas reguladoras Tat ou Rev 1, e RNAs à base de anti-senso, tendo como alvo locais diferentes em HIV-1 RNA, como as ribozimas 7, 8 e shRNAs U1i RNAs 9. Os métodos que foram utilizados para comparar a eficácia dos anti-HIV-1-RNA incluem a monitorização de replicação virai nas células transduzidas com genes que codificam para os ARN candidatas e medindo a produção virai em células transitoriamente transfectadas com plasmídeos que expressam os ARN candidatas e um plasmídeo de expressão de HIV-1 10 -13. Nós já usou um ensaio de produção HIV-1 para a tela HIV-1 RNA para sites de destino nova ribozimas 13-15. Estes métodos já foram refinados para optimizar o formato de um ARNmolécula de interferência expressa a partir de DNA de plasmídeo como um shRNA ou entregue como um siARN sintética 16. O ensaio mede a produção de vírus maduras a partir de células 293T de rim embrionário humano (HEK), e pode ser usado para comparar os efeitos dos inibidores que têm como alvo as etapas de pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1 (Figura 1). Para os inibidores que têm como alvo as etapas de pré-integração, ensaios alternativos, tais como um ensaio de infecciosidade de células TZM BL-17 são necessários para avaliar a eficácia antiviral. As principais preocupações de segurança para a entrega de anti-HIV-1 RNA na clínica incluem potenciais efeitos fora do alvo em RNAs humanos ou proteínas, e ativação de sensores imune inata. Para avaliar a toxicidade do anti-HIV-1 siRNAs, utilizou-se um ensaio de viabilidade celular em diferentes linhas celulares 16. Nós também medido activação dos sensores imunes ARN de cadeia dupla, ARN activada proteína quinase R (PKR) e Toll like receptor 3 (TLR3), bem como expressão do gene de interferão estimulada, p150 ADAR1. Estes ensaios podem ser utilizados para confirmar que a eficácia do anti-HIV-1 RNA não é devido aos efeitos indirectos sobre a viabilidade celular ou a activação do sensor imune. Eles são também úteis na exclusão com RNAs candidatos potenciais toxicidades de desenvolvimento posterior. Nos seguintes protocolos, os procedimentos para identificar novos RNAs terapêuticos e optimizar o formato das existentes são descritos. Os métodos são úteis para inibidores pós-integração baseadas em ARN rastreio de HIV-1 da replicação e pode ser adaptado para o rastreio de outros inibidores pós-integração, tais como pequenas moléculas de direccionamento Rev exportação mediada por ARN viral 18 ou CRISPR / sistemas Cas concebidos para direccionar integrada HIV-1 DNA 19.

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células, 96 poços, 24 poços, 6 poços.</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>Micro tubos Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>Baixo peso molecular Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>reagente de transfecção para RNAs sintéticos</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>reagente de transfecção para plasmídeos de expressão de RNA</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[32P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>modelo de RNA poli(A)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)12-18 DNA primer</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE filtermat paper&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>Contador de cintilação de microplacas</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de microplacas</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos tampão de lise</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>inibidores de protease e fosfatase</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagente</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de corrida em gel</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>Célula de transferência semi-seca</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Escada de proteínas EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>Solução de remoção de anticorpos</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>PI32106</tr><tr><td>anticorpo</td><td></td><td></td> ADAR1 <td>do Dr. B.L. Bass</td></tr><tr><td>anticorpo fosfo-T446-PKR</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo fosfo-S396-IRF3</td><td>Sinalização</td> celular <td>4947</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo</td><td></td><td></td> PKR <td>do Dr. A. Hovanessian</td></tr><tr><td>Anticorpo IRF3</td><td>Sinalização celular</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de actina</td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Anti-coelho de cabra marcado com peroxidase</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rato de cabra marcado com peroxidase</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da eficácia e toxicidade de rnas segmentação hiv-1 produção para uso em gene ou quimioterapia

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Pequenas terapias de RNA direcionadas às etapas pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1 estão entre os principais candidatos à terapia gênica e têm potencial para serem usadas como terapias medicamentosas para a infecção pelo HIV-1. Os inibidores pós-integração incluem ribozimas, RNAs em grampo curto (sh), pequenos RNAs interferentes (si), RNAs de interferência U1 (U1i) e aptâmeros de RNA. Muitos deles foram identificados usando ensaios de co-transfecção transitória com um plasmídeo de expressão do HIV-1 e alguns avançaram para ensaios clínicos. Além das medidas de eficácia, pequenos RNAs foram avaliados quanto ao seu potencial de afetar a expressão de RNAs humanos, alterar o crescimento e/ou diferenciação celular e provocar respostas imunes inatas. Nos protocolos aqui descritos, é descrito um conjunto de ensaios de transfecção transitória projetados para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA direcionadas a etapas pós-integração no ciclo de replicação do HIV-1. Usamos esses ensaios para identificar novas ribozimas e otimizar o formato de shRNAs e siRNAs direcionados ao RNA do HIV-1. Os métodos fornecem um conjunto rápido de ensaios que são úteis para rastrear novos RNAs anti-HIV-1 e podem ser adaptados para rastrear outros inibidores pós-integração da replicação do HIV-1.

Um esquema geral dos processos é mostrado na Figura 2, com um plano de transfecção exemplo para três RNAs de teste e um ARN de controlo fornecida na Figura 2B. Para os ensaios de viabilidade celular de produção e virais, a leitura para cada construto de teste é normalizada para um controlo negativo. Os duplicados estão transfectadas em conjuntos, de modo que cada ARN teste é normalizado para o seu controlo negativo adjacente. Isto é feito para evitar dad...

Métodos para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA visando etapas pós-integração do ciclo de replicação do HIV-1 são descritos. Esses métodos são úteis para rastrear novas moléculas e otimizar o formato das existentes.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

O objetivo geral deste procedimento é comparar a eficácia e a toxicidade de novos RNAs que visam a produção do HIV-1. Este método pode auxiliar na identificação de novas moléculas de RNA para terapias gênicas ou medicamentosas contra o HIV-1, como RNAs em cabelo curto ou interferentes pequenos, ribozimas e falsos receptores de RNA. A principal vantagem desta técnica é que diversos novos desenhos de RNA podem ser testados simultaneamente com tempo rápido de análise.Embora este método tenha sido desenvolvido para avaliar novas drogas de RNA ou terapias gênicas para HIV, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como moléculas pequenas ou tarefas com CRISPR. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao montar experimentos para triagem de um grande número de ribozimas com efeitos anti-HIV. Para começar, prepare uma suspensão de células de rim embrionário humano 293T a duas vezes 10 à quinta células por mililitro em DMEM com 10%FPS e 1%penicilina-estreptomicina.Adicione 500, 100 e 1.000 microlitros da suspensão celular a cada poço das placas de 24, 96 e 12 poços para os ensaios de produção viral, viabilidade celular e ativação imune, respectivamente. Agite suavemente as placas e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até atingirem de 50% a 70% de confluência. Para o ensaio de produção viral, prepare uma diluição de 10 nanogramas por microlitro de um plasmídeo de expressão do HIV-1 e adicione 10 microlitros a cada tubo de ensaio.Em seguida, prepare diluições de cinco micromolares de RNAs de teste e um RNA controle negativo. Então, adicione 2,5 microlitros ou 10 microlitros de cada diluição de RNA de teste e controle negativo aos tubos correspondentes para concentrações finais de 25 nanomolares ou 100 nanomolares. Para o ensaio de viabilidade celular, prepare diluições de cinco micromolares de RNAs de teste e uma diluição de 10 miligramas por mililitro do RNA controle positivo, poli(I:C) de baixo peso molecular. Adicione dois microlitros das diluições de RNA de teste ou do RNA controle positivo aos tubos correspondentes para concentrações finais de 100 nanomolares ou 200 microgramas por mililitro, respectivamente.Para o ensaio de ativação imune, adicione 20 microlitros das diluições de RNA de teste ou de RNA controle positivo, preparadas conforme o ensaio de viabilidade celular, aos tubos correspondentes para concentrações finais de 100 nanomolar ou 200 microgramas por mililitro, respectivamente. Em seguida, adicione 50, 25 ou 75 microlitros de DMEM a cada tubo de transfeção destinado aos ensaios de produção viral, viabilidade celular e ativação imune, respectivamente. Para os ensaios de produção viral, leve as células e os tubos de transfeção preparados para um laboratório de nível de biossegurança três, ou BSL-3, antes do próximo passo.Adicione dois microlitros do reagente de transfeção sequencialmente aos tubos de transfeção e incube de 15 a 20 minutos para permitir a formação dos complexos. Adicione toda a mistura de transfeção de cada microtubo, gota a gota, às posições correspondentes nas placas de cultura celular. Agite suavemente e incube as placas por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Para realizar o ensaio de produção viral, após remover as placas de cultivo celular de 24 poços da incubadora, transfira-as para a cabine de segurança biológica nível 3 (BSL-3). Agite suavemente as placas e, em seguida, transfira 150 microlitros do sobrenadante de cada poço para o poço correspondente em uma placa de 96 poços com fundo plano, a ser utilizada para quantificar a produção de HIV-1. Transfira cinco microlitros do sobrenadante para os poços correspondentes em uma placa de 96 poços contendo 25 microlitros de um coquetel de rompimento viral.Após incubação da mistura por cinco minutos à temperatura ambiente, transfira a placa para uma estação de trabalho com radioatividade. Em seguida, prepare um coquetel radioativo e adicione 25 microlitros a cada poço do sobrenadante viral e do coquetel de rompimento. Incube as placas a 37 graus Celsius por duas horas.Pipete cinco microlitros da mistura de reação em quadrados correspondentes em uma folha de filtro de fibra de vidro/DEAE e deixe as manchas secarem por 10 minutos. Use tampão 2x SSC para lavar as folhas cinco vezes, durante cinco minutos cada, seguido por duas lavagens de um minuto com etanol a 95%. Deixe as folhas secarem antes de selá-las em sacos para amostras.Corte amostras de sacos contendo o papel filtro em forma de mat e coloque-as em uma cápsula, inserindo a cápsula em um contador de cintilação de microplaca. Em seguida, inicie o contador. Para qualquer método de quantificação viral, divida os valores obtidos para cada RNA de teste pelo controle negativo adjacente e multiplique esse valor por 100 para obter a porcentagem de inibição da produção de HIV-1 para cada replicata dos RNAs de teste.Para realizar um ensaio de viabilidade celular, após remover as placas de 96 poços do incubador, adicione 20 microlitros de MTT a cinco miligramas por mililitro e DPBS em cada poço. Em seguida, incube as placas por três horas a 37 graus Celsius. Adicione 150 microlitros de isopropanol acidificado com detergente em cada poço e incube as placas à temperatura ambiente por duas horas.Em seguida, utilize um espectrofotômetro de microplaca para determinar a absorbância em 570 nanômetros. Calcule o metabolismo relativo de MTT para cada controle positivo e RNA em teste dividindo o valor obtido para cada amostra pelo seu controle de transfeção adjacente. Para o ensaio de ativação imune, após remover as placas de 12 poços da incubadora, aspire o meio de cultura e use DPBS para lavar suavemente as células duas vezes.Em seguida, adicione 70 microlitros de tampão de lise frio contendo inibidores de protease e fosfatase a cada poço e incube as placas em gelo por 10 minutos. Transfira os lisados celulares para microtubos e congele rapidamente imergindo os tubos em nitrogênio líquido. Após permitir que as amostras descongelem, repita o ciclo de congelamento-descongelamento mais duas vezes, totalizando três ciclos de congelamento-descongelamento.Em seguida, centrifugue os lisados a 15.700 × g e 4 °C durante 15 minutos para formar um pellet dos detritos celulares. Depois da eletroforese e transferência para uma membrana, revele as bandas proteicas incubando a membrana em Ponceau S por um minuto. Em seguida, lave com água bidestilada.Utilize as bandas e a escada de proteínas como guia para cortar a membrana em 80 e 55 quilodaltons. Agora, use TBS com 0,05% TWEEN 20 ou TBST para remover a coloração com Ponceau S. Adicione TBST com 5% de leite desnatado para cobrir completamente as membranas e incube-as à temperatura ambiente com agitação por uma hora.Transfira as membranas para TBST com BSA 3% e anticorpos diluídos em 1:1.000 para ADAR, PKR fosforilada e IRF3 fosforilada nas partes superior, média e inferior da membrana, respectivamente. Incube a 4 graus Celsius com agitação durante a noite. Na manhã seguinte, use TBST para lavar as membranas cinco vezes, durante cinco minutos cada, antes de transferi-las para TBST com leite desnatado 5% e anticorpos secundários de cabra anti-coelho conjugados à peroxidase na diluição de 1:5.000 por uma hora.Após visualizar as bandas proteicas em filmes, utilize uma solução de remoção para lavar as partes mediana e inferior da membrana por 10 minutos, antes de incubar a parte mediana da membrana em anticorpos contra PKR e a parte inferior em anticorpos contra IRF3. Como controle positivo, hibridize a membrana inferior com anticorpos contra Actina de acordo com o protocolo descrito. Um esquema geral dos ensaios é mostrado aqui, com um exemplo de plano de transfeção para três RNAs de teste e um RNA controle.Para ensaios de produção viral e de viabilidade celular, o resultado de cada construto testado é normalizado em relação a um controle negativo. Utilizando o ensaio de produção de HIV-1 em células transfectadas com um plasmídeo que expressa a cepa NL4-3 do HIV-1, calculou-se a porcentagem de atividade da transcriptase reversa em células co-transfectadas com um dos siRNAs mostrados aqui, em comparação com células transfectadas com um siRNA sem sentido longo substrato do Dicer, a fim de identificar o comprimento ideal de moléculas de interferência de RNA direcionadas a um sítio conservado no RNA do HIV-1. Com base nos siRNAs mais eficazes identificados, determinou-se a porcentagem de metabolismo de MTT nas células transfectadas.Ao longo do RNA de fita dupla, o poli(I:C) reduziu a viabilidade celular apenas na dose mais alta. Nenhuma redução significativa na viabilidade celular foi observada para siRNAs direcionados ao sítio 1498 no RNA do HIV-1, independentemente de seu comprimento. Como demonstrado aqui por meio de Western blot, o mesmo conjunto de RNAs foi avaliado no ensaio de ativação imune.Em condições nas quais o poli(I:C) ativou a expressão de ADAR1-p150 e induziu a fosforilação de PKR e IRF3, nenhum efeito significativo sobre quaisquer marcadores de inativação pôde ser observado para nenhum dos RNAs testados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em sete dias, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante usar preparações de alta qualidade de RNA e DNA para transfeção.Além disso, para incluir os controles negativos e positivos apropriados. Após este procedimento, outros métodos, como a infecção por HIV de células transduzidas, podem ser utilizados para avaliar a eficácia e toxicidade a longo prazo de candidatos potenciais anti-HIV. Após seu desenvolvimento, esta técnica permitiu-nos identificar um sítio alvo acessível e conservado no RNA do HIV e otimizar os formatos de ribozimas, shRNAs e siRNAs direcionados a ele.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar rapidamente a triagem de novos candidatos a RNA que visam a produção do HIV, avaliando sua eficácia por meio do ensaio de produção viral e sua toxicidade potencial por meio dos ensaios de ativação imune e viabilidade celular. Não se esqueça de que trabalhar com HIV e nucleotídeos radiomarcados pode ser extremamente perigoso. Precauções, como o uso de laboratórios certificados de biossegurança e de radioatividade, devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

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