Name: Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de Vibrio parahaemolyticus E outro Vibrio Espécies (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a avaliar um meio cromogênico para detecção de Vibrio parahaemolyticus em microbiologia de segurança alimentar. Este método oferece maior sensibilidade e especificidade comparado aos meios convencionais.

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Agradecemos a M. Channey, E. Chau, e K. Tomas por sua assistência no projeto. suprimentos do projeto foram parcialmente financiado pela California Polytechnic State University.

1. Mídia e Cultura de microbianas Cepas NOTA: Use técnicas assépticas em todos os experimentos. Usar materiais estéreis. Esterilizar todos os recipientes, ferramentas e reagentes antes de usar. Autoclave todos os resíduos antes do descarte, porque eles são considerados de risco biológico. temperatura e tempo autoclave combinação é ≥121 ° C x ≥15 min durante todos os procedimentos a seguir. <ol><li> Para tornar ~ 1-L-agar de soja tríptica (TSA), primeiro adicionar 1 L de água desionizada num balão de Erlenmeyer de 2 L contendo uma barra de agitação magnética. Usar um balão que é pelo menos duas vezes maior do que o volume final. Adicionar 30 g de caldo de soja tríptica em pó e 20 g de agar grânulos para o frasco. NOTA: Use 2% de agar em vez de 1,5% para limitar enxame de algum Vibrio spp. <ol><li> Misturar bem, rodando sobre o agitador. Enquanto se agitava, ligue o fogo para ferver a mistura. Retirar o frasco do aquecedor, logo que a mistura começa a ferver. Vagamente cobrir the frasco com uma folha de estanho. Tape o papel alumínio para protegê-lo para o frasco antes de autoclave. </li><li> Para fazer tríptico caldo de soja (TSB), omitir o agar da receita no passo 1.1. NOTA: Pode usar garrafas em vez de Erlenmeyer. </li><li> Para fazer agar de soja tríptica suplementado com cloreto de sódio a 2% ou NaCl (CST), adicionar 20 g de NaCl na mistura antes da agitação e aquecimento. Para fazer caldo de soja tríptica suplementado com 2% de NaCl (TSBs), omitir o agar, adicionar 20 g de NaCl na mistura antes da agitação e aquecimento. </li></ol></li><li> Para tornar a infusão de coração e cérebro de agar (BHI), suspensão 37 g de BHI em pó e 15 g de grânulos de agar em 1 litro de água purificada. Aquecer com agitação frequente para dissolver o pó. Autoclave. Omitir o agar para fazer caldo BHI. </li><li> Para fazer ágar TCBS, suspensão 89 g do pó em TCBS 1 L de água purificada. Aquecer com agitação frequente e fervura durante 1 min para dissolver completamente o pó. Não autoclave. </li><li> Por todos os meios de agar, arrefecer o agar quente para 45-50 ° C num banho de água. Organizar placas de Petri vazios em pilhas de cinco a seis placas. A partir da parte inferior da pilha, verter o agar derretido em cada placa de Petri para atingir cerca de metade cheio. Feche a tampa placa de Petri após o vazamento. Permitir que o agar solidificar, permitindo que as placas de repouso à temperatura ambiente. <ol><li> Use as placas de ágar no dia seguinte ou após 12 horas. Armazenar placas não utilizados em uma geladeira por até duas semanas. Antes da utilização, remover as placas a partir do frigorífico e equilibrar-los à temperatura ambiente durante pelo menos 15 min. NOTA: agar de um litro faz ~ 45 placas de ágar. Permitir que as placas de ágar para secar suficientemente no dia da preparação, e equilibrar-los à temperatura ambiente após o armazenamento a frio para reduzir eficazmente a propagação das colônias. </li></ol></li><li> Obter chocolate e de ágar cromogênico placas e equilibrar-los à temperatura ambiente antes de cada experimento. </li><li> Subcultura todos os 54 cepas microbianas apresentados na Tabela 1 a cada poucos days. <ol><li> Use um loop de inoculação estéril para transferir culturas a partir de um estoque congelado ou um lote anterior para mídia não-seletivos, como BHI, TSB / TSA ou agar chocolate. Crescer halophilic Vibrio spp. em TSBs / TSAS. </li><li> Para verificar a pureza da cultura, raia todas as estirpes em um padrão que permita a observação das colônias isoladas. Por exemplo, usar um padrão de estrias de três fases para diluir uma grande quantidade de bactérias a quantidade menor, originando eventualmente colónias isoladas. </li></ol></li><li> Incubar as placas de cabeça para baixo a 35-37 ° C durante até 48 h. Para Campylobacter spp., Tubos ou placas incubar em um frasco de tampa fechada contendo uma bolsa de gás para produzir um ambiente microaerophilic. Observar morfologia das colónias após incubação. Culturas puras deve produzir colónias que exibem uma morfologia de colónia semelhante. NOTA: Incubar todas as placas de cabeça para baixo para evitar que as gotículas de água condensada formadas no lado inferior da tampa de cair na colonies. </li></ol> 2. Espécies Determinação por PCR <ol><li> Realizar tlh-PCR para confirmar a identidade de V. cepas parahaemolyticus. Utilização iniciadores TLH -F (5 &#39;AAA GCG TAT GAT GCA GAA GCA CTG 3&#39;) e -R TLH (5 &#39;TCG ACT TTC CAT TAG TTT CTC TGC 3&#39;) para amplificar um fragmento de 450 pb do gene de hemolisina 20 termolábil . <ol><li> Use um loop de inoculação estéril para transferir algumas colônias isoladas de cada V. estirpe parahaemolyticus a partir TSAS a 5 ml de TSBs. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr. </li><li> culturas centrifugar a 14.000 xg por 1 min. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Ferver a suspensão durante 3 minutos para se obter lisado celular. NOTA: V. parahaemolyticus é fácil de ser lisadas. Portanto reagente de lise não é necessária. É também possível usar um pouco de colónia directamente como molde. </li><li> Executar PCR numa reacção de 25-ul volume. Prepara-se uma mistura reaccional contendo uma concentração final de tampão de PCR 1x, MgCl2 1,5 mM, 100 uM de cada dNTP, 1 pM de cada iniciador, 1 U de Taq polimerase e 1 ml de lisado celular. Após pré-incubação a 94 ° C durante 5 min, executar 35 ciclos de amplificação de 94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 60 seg 21. </li><li> alíquotas de carga de amplicão 5-ul em géis de agarose a 1,5%. Ligue a fonte de alimentação para iniciar a electroforese. Visualizar a presença ou ausência de produtos de amplificação sob iluminação com UV, após coloração com brometo de etídio. </li></ol></li></ol> 3. Crescimento na selectivo e diferencial de mídia <ol><li> Dois a quatro dias antes do experimento, raia todas as cepas microbianas apresentados na Tabela 1 no meio não selectivo (TSAS, BHI ou agar chocolate) para o isolamento de colónia. Incubar as placas a 35-37 ° C durante 48 h. Verifique a pureza das culturas através da observação da morfologia das colónias após incubação. Culturas puras deve produzir colónias que exibem uma morfologia de colónia semelhante. </li><li> Transferir algumas colónias isoladas a partir do passo 3.1 em 5 mL de caldo. Incubar os tubos a 35-37 ° C durante 16-24 hr. Nota: Use as colónias jovens, que são menos de quatro dias de idade, para preparar culturas durante a noite em todos os experimentos. </li><li> Streak uma ansa de culturas durante a noite em meio selectivo e diferencial (TCBS e agar cromogênico) para o isolamento de colónia. Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h. </li><li> Grave o crescimento global de todas as estirpes, examinando tanto a densidade da cultura no prato e o tamanho de colônias isoladas. Grave a cor das colónias sob a luz ambiente e / ou UV. Nota outras características da colônia isolada como a altitude, a margem e forma. </li></ol> Ensaio 4. Recuperação <ol><li> Seleccionar um subconjunto representativo de V. cepas parahaemolyticus (n = 14) que abrangem diferentes sorotipos e origens de isolamento <s-se&gt; 22. Inocular culturas jovens das placas em 5 ml de TSBs. Incubar os tubos a 35-37 ° C durante 16-24 hr. </li><li> Realizar um método de contagem padrão em placa das culturas durante a noite, como descrito abaixo. <ol><li> Vortex para misturar as culturas durante a noite bem. Adicione uma dobra em 10 ou 10 -1 de diluição por transferência de 100 uL da cultura durante a noite para um tubo contendo 900 jil de PBS. Vortex para misturar bem. </li><li> Usar uma nova ponta de pipeta para transferir 100 ul a partir do tubo 10 -1 de diluição para outro tubo contendo 900 ul de PBS. Vortex para misturar bem. Isto constitui 10 -2 diluição. Repetir o processo sequencial para se obter 10 -7 diluição. </li><li> Usando os 10 -4 a 10 -7 tubos de diluição, placa 100 ul cada um no, TCBs e CST placas de ágar cromogênico. NOTA: O factor de diluição (DF) sobre a placa torna-se 10 -5 a 10 -8, respectivamente. </li><li> Espalhe as alíquotas uniformemente em tele agar superfície. NOTA: É bem usar o mesmo espalhador por pressão sobre o mesmo meio, enquanto a alíquota mais diluída é espalhado primeiro (ou seja, a partir de 10 -8 a 10 -5). Não use o mesmo espalhador para diferentes mídias. </li><li> Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h. Contagem das colónias nas placas. Ignorar placas de rolamento colónias que são demasiado numerosas para contar (TnTc) ou menos do que 25. Calcular CFU / ml de acordo com o seguinte: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" /> Onde N = o número de células no tubo não diluído, expresso em CFU / ml ou CFU / g C = o número total de colónias contadas em placas que dão 25-300 colónias N 1 = o número de placa (s), onde as colónias são contadas a partir do DF inferior n = 2 o número de placa (s), onde as colónias são contadas a partir da diluição de 10 vezes subsequente dF = factor de diluição menor (isto é, a diluição mais concentrada) </li></ol></li><li> Compare UFC / ml entre os diferentes meios de comunicação. Use UFC / ml em TSAS como 100%, calcular a recuperação% de V. parahaemolyticus cultivadas em agar cromogénico e TCBS. </li></ol> Ensaio 5. Concorrência <ol><li> Escolha um subconjunto de estirpes que exibem diferentes morfologias colônia na agar cromogênico e TCBS. NOTA: Dessa forma, será possível a contagem das colónias originado V. única parahaemolyticus, apesar da presença de outras espécies no inoculo. <ol><li> Escolha um V. estirpe parahaemolyticus que produz os turquesa e ciano colónias esperado em TCBS eo agar cromogênico, respectivamente. </li><li> Escolha um V. não- parahaemolyticus e uma espécie não-Vibrio que não crescem em qualquer um destes meios de comunicação, ou exibem cor diferente colônia. NOTA: Por exemplo, V. metschnikovii cresce muito pouco oN TCBS e não crescem em agar cromogénico. Shigella sonnei que não crescem em TCBS mas produz colónias magenta sobre o ágar cromogénico. </li></ol></li><li> Após a seleção das estirpes anteriores, preparar caldos de cultura durante a noite usando colônias isoladas cultivadas em meio não selectivo. <ol><li> Faça culturas durante a noite de V. parahaemolyticus e V. metschnikovii transferindo algumas colónias isoladas a partir de TSAS a 5 ml de TSBs. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr. </li><li> Adicione culturas de uma noite de Shigella sonnei, transferindo-se algumas colónias isoladas a partir de agar de BHI para 5 ml de caldo BHI. Incubar a 35-37 ° C durante 16-24 hr. </li></ol></li><li> Para cada cepa, realizar uma série de diluição semelhante ao Passos 4.2.1 e 4.2.2. Placa diluições apropriadas em TSAS ou BHI para determinar UFC / ml da cultura durante a noite, utilizando-se a equação mostrado no Passo 4.2.5. NOTA: Normalmente, 100 ul da diluição de 10 -5 a 10 -7tubos funciona para a maioria das culturas. Use os valores de UFC / mL para trás calcular a quantidade exata de células usadas na próxima etapa. Os valores de CFU / ml calculados são obtidos depois de incubação, embora os seguintes passos são executados na mesma data no passo 5.3. </li><li> Usando as culturas durante a noite e tubos de diluição nos Passos 5.2 e 5.3, misturar diferentes quantidades de um V. estirpe parahaemolyticus e V. não espécies parahaemolyticus. Por exemplo, misturar 500 ul da diluição -5 tubo 10 de V. parahaemolyticus com 500 ul das culturas durante a noite de V. metschnikovii. NOTA: Esta mistura simula fundo alta microflora. Para simular um fundo baixo microflora, misturar 500 ul cada do tubo 10 -5 diluição de ambas as espécies. </li><li> Espalhe 100 uL da mistura de cada um no, TCBS e TSAS placas de agar cromogénicos. </li><li> Após incubação a 35-37 ° C durante até 96 h, a contagem de colónias de V. parahaemolyticus e o V. não- espécies parahaemolyticus com base na sua diferença no crescimento e morfologia da colônia no ágar cromogênico e TCBS. NOTA: Por exemplo, se o V. não- O parahaemolyticus espécies não crescem em agar cromogénico e TCBS, todas as colónias será de V. parahaemolyticus. Se o V. não- espécies parahaemolyticus cresce em ambos os meios, apenas as colónias azul-turquesa em TCBs e ciano colónias em agar cromogênico será de V. parahaemolyticus. O V. não- espécies parahaemolyticus podem ou não exibem uma morfologia de colónia semelhante a V. parahaemolyticus em TSAS. <ol><li> Se o V. não- espécies parahaemolyticus cresce de modo semelhante a V. parahaemolyticus neste meio não selectivo, divida o número de colónias por dois para obter números de V. parahaemolyticus somente. Comparar o número de colónias real com a contagem esperada derivada da etapa 5.3. </li></ol></li></ol> 6. EffECTS de ostra homogeneizados <ol><li> Pesar ≥50 g carne de ostra de ≥12 moluscos incluindo carne e bebidas alcoólicas. <ol><li> Adicionar uma quantidade igual de PBS à carne de ostra e bebidas alcoólicas. Mistura-se a mistura a alta velocidade durante 90 segundos. Isto constitui 2 -1 homogenato diluído de ostras. </li><li> Adicionar 100 g de 2 -1 homogenato diluído de ostra a 400 g de PBS. Use uma escala para medir o peso, não volume. Mistura-se a mistura a alta velocidade durante 1 minuto. Autoclave a homogenato de ostras. NOTA: Este será o homogeneizado ostra usado para spiking. </li></ol></li><li> Repetir o ensaio de recuperação (Passo 4), na presença de homogenato de ostras. <ol><li> Após a 500 g de ostra homogeneizado esfriar, adicione 100 ml de V. parahaemolyticus culturas durante a noite cultivadas em TSBs a ele. Determinar a quantidade real de V. células parahaemolyticus no inóculo por realização dos procedimentos de contagem padrão em placas descritas no Passo 4.2. </li></ol></li><li> Repcomer o ensaio de competição (Passo 5) na presença de homogenato de ostras. <ol><li> Após a 500 g de ostra homogeneizado esfria, adicionar 100 ul cada um culturas durante a noite de V. parahaemolyticus e V. não- parahaemolyticus a ele. Determinar a quantidade real de bactérias células do inóculo por realização dos procedimentos de contagem padrão em placas descrito no Passo 4.2 </li></ol></li><li> Misturar as células bacterianas com homogenato de ostra bem utilizando um homogeneizador. NOTA: Após a mistura, o homogeneizado ostra contendo as células intencionalmente adicionados é chamado cravado ostra homogeneizado. </li><li> Fazer diluições do homogeneizado ostra cravada para se obter 10 -1 a -3 10 tubos de diluição de acordo com os procedimentos descritos no Passo 4.2.2. Espalhe 100 ul de cada diluição para o cromogénico TCBS e TSAS ágar,. Incubar as placas a 35-37 ° C durante até 96 h. </li><li> Compare o número de colónias real sobre agar cromogênico e TCBS com o experado contagem de colónias deduzida a partir de Passos 6.2.1 e 6.3.1. NOTA: Por exemplo, se um tubo de V. parahaemolyticus cultura durante a noite contém 10 8 CFU / ml, um inoculo de 100 ul significa que 10 7 células são adicionadas a 500 g de homogeneizado de ostra, obtendo-se 5 x 10 4 células / g. Após a diluição e em placas, a placa com df = 10 -2 deve render 500 colónias; enquanto que com df = 10 -3 deve rendimento de 50 colónias. Estas são as contagens de colónias esperado. </li></ol>

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</ol>

Algumas mídias foram generosamente fornecidas pela Hardy Diagnostics, Santa Maria, CA. Thorsen conduziu este estudo enquanto estudante na California Polytechnic State University. Atualmente é funcionário da Hardy Diagnostics.

Este estudo centra-se no desenvolvimento e avaliação meios de cultura. Convencionalmente, TCBS é o selectivo e diferencial meio utilizado para isolar e detectar V. parahaemolyticus, V. cholerae e V. vulnificus 12. No entanto, limitações têm sido relatados para este meio, tais como a incapacidade para diferenciar V. cholerae a partir de outras espécies de Vibrio. Sacarose e indicador de pH são os agentes de diferenciação de TCBS. Assim, a produção de ácido por fermentador de...

Como um membro do gênero Vibrio, V. parahaemolyticus é, curvo bactéria Gram-negativa, não-formadoras de esporos, em forma de haste. Ele exibe uma elevada motilidade em ambos os ambientes líquidos e semi-sólidos. A maioria V. cepas parahaemolyticus não são patogénicas para os seres humanos, mas os subtipos patogênicos têm causado epidemias e pandemias, portanto, esta espécie é considerada um importante patógeno de origem alimentar em muitos países 1,2. A incidência de infecção Vibrio em os EUA tem mostrado uma tendência ascendente desde 2000 3. Entre Vibrio spp., V. parahaemolyticus é a espécie mais frequentemente relatados que causam doenças em os EUA 4,5. Outras espécies clinicamente relevantes incluem V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. Uma pequena porcentagem das doenças é causada por várias espécies simultaneamente. V. parahaemolyticus é uma i naturaisnhabitant de água do mar e, portanto, amplamente distribuídos em águas marinhas em todo o mundo, incluindo os estuários. A espécie foi descoberta em 1950 na sequência de um surto de intoxicação alimentar no Japão. Em os EUA, a espécie foi isolada pela primeira vez na água do mar, sedimentos, e marisco na região de Puget Sound 6,7. Filtro alimentadores em habitats marinhos, tais como moluscos bivalves, podem abrigar V. parahaemolyticus como parte de sua flora natural 8. Como tal, V. infecções parahaemolyticus em humanos são muitas vezes ligados ao consumo de mariscos contaminados, principalmente mariscos crus ou mal cozidos. Uma rota menos comum de entrada ocorre quando ferida aberta é exposta à água do mar, levando à infecção de pele. A maioria V. cepas parahaemolyticus não causam a doença humana, mas certos subtipos que abrigam fatores de virulência como hemolisina direta termoestável (TDH) são patogênicas. Os sintomas mais prevalentes de origem alimentar V. infecção parahaemolyticus sãodiarreia e dor abdominal, seguida de náuseas, vómitos e febre. Dor de cabeça e arrepios são também relatados. O período de incubação médio é de 15 horas, mas pode ser de até 96 horas após o consumo de uma quantidade suficiente de estirpes patogénicas 9. A doença dura de dois a três dias. Os sintomas de gastroenterite causados por V. parahaemolyticus são amplamente auto-limitada e, por conseguinte, um tratamento especial não é necessário. Os casos leves de gastroenterite podem ser eficazmente tratados por reidratação oral. Mais doenças graves podem ser tratados com antibióticos tais como tetraciclina ou ciprofloxacina 10. A mortalidade é de cerca de 2% para os casos de gastroenterite, mas pode ser tão elevado quanto 29% para os que desenvolvem infecção da corrente sanguínea ou a septicemia. Qualquer pessoa que consome frutos do mar ou tem ferida aberta exposta à água do mar está em risco de V. infecção parahaemolyticus. A forma mais grave da septicemia, doenças com risco de vida, é mais comum em uma subpopulação com o co médica subjacentenditions 11, que incluem alcoolismo, doença hepática, diabetes, doença renal, doença maligna, e outras condições que conduzem a uma resposta imune enfraquecido. Notavelmente, este grupo de indivíduos também está em maior risco de contrair doenças graves causadas por V. vulnificus, que pode ser encontrado em habitats naturais semelhantes a V. parahaemolyticus. V. parahaemolyticus é rotineiramente isolado utilizando ágar sais de ácido sacarose-tiossulfato-citrato biliares (TCBS) como um meio selectivo e diferencial. Enriquecimento em água peptonada alcalina pode preceder o isolamento em agar TCBS. colónias presumivelmente em TCBS são então testados em uma série de testes bioquímicos e / ou ensaios moleculares visando a presença de genes específicos da espécie. Métodos baseados em PCR são muitas vezes utilizados para confirmar a identidade de V. parahaemolyticus por amplificação do gene da hemolisina termolábeis, tlh 12. Independentemente do choice de métodos de confirmação, é importante dispor de um meio eficaz para isolar e diferenciar V. parahaemolyticus de outros vibrios marinhos em primeiro lugar. TCBS tem sido rotineiramente usado para diferenciar as espécies dentro do gênero Vibrio acordo com suas habilidades para fermentar sacarose 12. Reacção de fermentação positiva é acompanhada por uma mudança de cor do indicador de pH azul de bromotimol. V. colónias parahaemolyticus são bastante distinta em TCBS, exibindo azul para cor verde. No entanto, este meio não pode facilmente diferenciar V. alginolyticus e V. cholerae. espécies de Proteus-fermentação da sacarose podem produzir colónias amarelas se assemelham V. cholerae ou V. alginolyticus 13. No isolamento inicial em TCBS, V. parahaemolyticus também pode ser identificado erroneamente como Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides e Pseudomonas spp 14. As cepas com ferm sacarose adiadaentação pode ser confundida com outra sacarose não-fermentadoras, Vibrio 13, que incluem V. parahaemolyticus. TCBS foi encontrado para ser não é sensível contra Escherichia coli, putrefaciens Pseudomonas, entre outros. Várias outras espécies render verde para colónias cinzentas que são potencialmente confundidos com V. parahaemolyticus ou V. vulnificus 15. Como resultado, é desejável desenvolver meios alternativos com melhor sensibilidade e especificidade para detectar e isolar V. parahaemolyticus e outras espécies estreitamente relacionadas. Várias alternativas de mídia têm sido desenvolvidos recentemente. Para além da inclusão de agentes selectivos, mais incorporar substratos cromogénicos para diferenciar espécies com base nas suas actividades enzimáticas diferenciais. Por exemplo, o indoxil-β-glucósido e indoxil-β-galactósido têm sido usadas como os substratos cromogénicos para diferenciar V. páracolónias haemolyticus (que aparecem verde-azulado) dos de V. cholerae (roxo), devido às suas capacidades diferenciais para produzir β-glicosidase e β-galactosidase 16. Diferentes formulações de ágar cromogénico desenvolvidas por diversos grupos foram avaliados e foram relatados para executar comparável ou melhor do que TCBS 17,18,19. Uma vantagem de usar um meio cromogénico é que a coloração do meio circundante é mínima facilitando assim o isolamento de colónias particulares. Neste estudo, avaliou-se a capacidade de um meio cromogénico recentemente formulado para detectar e isolar V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus; com um foco especial sobre a sua capacidade para diferenciar V. parahaemolyticus a partir de outras espécies.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagente/Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pó BHI</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0418-17-7</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Liquidificador</td><td>Qualquer</td><td></td><td>para misturar carne de ostra</td></tr><tr><td>Gás CampyGen gerador</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>CN035A</td><td>para fornecer uma atmosfera microaerofílica; pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Placas de ágar chocolate</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>E14</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Reagentes de PCR comuns (dNTPs, MgCl2, Taq Polimerase)</td><td>Qualquer</td><td></td><td>ou usar grânulos de PCR (Fisher Sci 46-001-014)</td></tr><tr><td>Tubos de cultura</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50712</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S348903</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Gel doc</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>placa de ágar HardyChrom Vibrio</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>G319</td><td>Este estudo avalia este meio</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alça de inoculação</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>O tamanho de 10 microlitros foi usado neste estudo</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Ostras</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>PBS Fisher Scientific</td><td>R23701</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Pipeta e pontas</td><td>Qualquer</td><td></td><td>ponta esterilizada</td></tr><tr><td>Primers para Balança de</td> <td>DNA</td><td></td><td></td>tlhIDT</tr><tr><td></td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espalhador</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td>As contas podem ser usadas em seu lugar</td></tr><tr><td>Liquidificador Stomacher</td><td>Stomacher</td><td>400</td><td>As amostras foram homogeneizadas a 200 rpm por 30 segundos.&nbsp; Outro homogeneizador pode ser usado.</td></tr><tr><td>Sacos de filtro estéreis para liquidificadores</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-5</td><td></td></tr><tr><td>TCBS pó</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>265020</td><td>Este estudo avalia este meio</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pó TSB</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-07-5</td><td>pode usar outras marcas</td></tr><tr><td>Armário de visualização UV</td><td>Qualquer</td><td></td><td>Emitir luz</td></tr> <tr>UV de onda longa<td>Banho-maria</td><td>Qualquer</td><td></td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Fontes</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Espécies e estirpes bacterianas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aeromonas hydrophila</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Candida albicans</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Proteus mirabilis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Staphylococcus aureus</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salmonella Choleraesuis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Shigella boydii</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Shigella flexneri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Shigella sonnei</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>Vibrio alginolyticus</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. cholerae (os sorotipos incluem O139, O1, não O1, El Tor biovars)</td><td>FDA, ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. damsela</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. fisheri</td><td>Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. fluvialis</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. furnissii </td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>V. hollisae</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. metschnikovii</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. mimicus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. parahaemolyticus (os sorotipos incluem O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc.)</td><td>ATCC, FDA, CDC, Meio Ambiente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. proteolyticus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V. vulnificus</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de uma mais sensível e específica cromogênico agar para a detecção de<em&gt; vibrio parahaemolyticus</em&gt; e outro<em&gt; vibrio</em&gt; espécies

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Infecções alimentares em os EUA causada por espécies de Vibrio têm mostrado uma tendência ascendente. No género Vibrio, V. parahaemolyticus é responsável pela maioria das infecções por Vibrio -associated. Assim, a diferenciação precisa entre Vibrio spp. e detecção de V. parahaemolyticus é extremamente importante para garantir a segurança do nosso abastecimento alimentar. Embora as técnicas moleculares são cada vez mais comuns, métodos, dependendo de cultura são ainda feito rotineiramente e são considerados métodos padrão em determinadas circunstâncias. Assim, um novo meio de agar cromogénico foi testado com o objectivo de proporcionar um melhor método para o isolamento e diferenciação de Vibrio spp clinicamente relevante. O protocolo de comparação do limite de sensibilidade, especificidade e de detecção para a detecção de V. parahaemolyticus entre o novo meio cromogénico e um meio convencional. Vários V. cepas parahaemolyticus (n = 22) reapresentando diversos sorotipos e fonte de origens foram utilizados. Eles foram previamente identificados pela Food and Drug Administration (FDA) e os Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), e ainda mais verificada em nosso laboratório por tlh-PCR. Em pelo menos quatro ensaios independentes, estas estirpes foram inoculadas sobre os sais de agar-sacarose e tiossulfato-citrato-biliares cromogénicos (TCBS) de agar, que é a forma recomendada para a cultura desta espécie, seguido de incubação a 35-37 ° C durante 24 hr -96. Três V. cepas parahaemolyticus (13,6%) não cresceu de forma otimizada em TCBS, no entanto exibiram colónias verdes se houve crescimento. Duas cepas (9,1%) não deu as colônias ciano esperados no ágar cromogênico. V. não estirpes parahaemolyticus (n = 32) foram também testados para determinar a especificidade do ágar cromogénico. Entre estas estirpes, 31 não crescer ou exibiu outras morfologias colônia. A recuperação média de V. parahaemolyticus na chromogenic ~ ágar foi de 96,4% em relação ao agar de soja tríptica suplementado com 2% de NaCl. Em conclusão, o novo ágar cromogénico é um meio eficaz para detectar V. parahaemolyticus e diferenciá-lo de outros vibrios.

Neste estudo, 54 cepas microbianas foram montados, que incluiu 22 cepas dentro do V. espécies parahaemolyticus, 19 outras espécies de Vibrio, e 13 espécies de Vibrio não (Tabela 1). A maioria V. cepas parahaemolyticus ou foram recebidos de FDA, CDC ou de outros departamentos de saúde estaduais. Eles representam diversos sorotipos e fontes de isolamento. Estas estirpes foram previamente identificados pelos órgãos regul...

A detecção e o isolamento de espécies de Vibrio clinicamente relevantes requerem meios de cultura seletivos e diferenciais. Este estudo avaliou a capacidade de um novo meio cromogênico para detectar e identificar V. parahaemolyticus e outras espécies relacionadas. Descobriu-se que o novo meio tem melhor sensibilidade e especificidade do que o meio convencional.

Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; E outro<em&gt; Vibrio</em&gt; Espécies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a sensibilidade e especificidade de um novo meio cromogênico quanto à sua capacidade de detectar e isolar Vibrio parahaemolyticus em comparação com meios convencionais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de microbiologia de alimentos e ambiental, como, por exemplo, qual é a prevalência de espécies de Vibrio em alimentos e ambientes de colheita? A principal vantagem do nosso procedimento é que diversas estirpes bacterianas podem ser utilizadas, inclusive na presença de uma matriz alimentar.Antes de cultivar as bactérias, autoclave todos os meios de ágar. Em seguida, resfrie o ágar a 45 a 50 graus Celsius em banho-maria. Quando o ágar estiver pronto, organize placas de petri vazias em pilhas de cinco a seis placas.Em seguida, começando pela base do conjunto, despeje o ágar fundido em cada placa até cerca de metade da capacidade, substituindo as tampas após o despejo. Deixe o ágar solidificar à temperatura ambiente por pelo menos 12 horas. Para preparar os cultivos das cepas microbianas, quando o ágar estiver pronto, utilize um alça inoculadora estéril para transferir os cultivos para as placas apropriadas de ágar não seletivo, estriando as bactérias em um padrão que permita a observação de colônias isoladas.Quando todas as colônias tiverem sido semeadas, incubar os cultivos virados de cabeça para baixo a 35-37 graus Celsius por até 48 horas, exceto para espécies de Campylobacter, que devem ser incubadas em um frasco com tampa fechada contendo um sachê de gás para produzir um ambiente microaerofílico. Observar a morfologia das colônias ao final da incubação. Culturas puras devem apresentar colônias que exibem morfologia semelhante.Para promover o crescimento das colônias de interesse em meios seletivos e diferenciais, transfira algumas colônias isoladas para cinco mililitros do caldo apropriado e reincube os cultivos a 35-37 °C por 16 a 24 horas. No dia seguinte, alise uma alça dos cultivos de overnight em pelo menos uma placa de ágar Tiossilvato-Citrato-Bile-Sacarose, ou ágar TCBS, e em pelo menos uma placa de ágar cromogênico, incubando-as por até 96 horas a 35-37 °C. Ao final da incubação, examine tanto a densidade do crescimento na placa quanto o tamanho das colônias isoladas para determinar o crescimento geral das cepas, registrando a cor das colônias à luz ambiente ou UV, conforme apropriado, e anotando quaisquer outras características importantes das colônias.Para realizar um ensaio de recuperação, inocule culturas jovens de Vibrio parahaemolyticus em cinco mililitros de caldo triptona soja, suplementado com dois por cento de cloreto de sódio, ou TSBS, e coloque os tubos a 35 a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. No dia seguinte, agite as culturas de overnight e prepare diluições de um vezes 10 à potência de menos um até um vezes 10 à potência de menos sete das bactérias em PBS. Utilizando as diluições de um vezes 10 à potência de menos quatro até um vezes 10 à potência de menos sete, plaque uniformemente 100 microlitros de cada diluição em placas individuais de ágar cromogênico, TCBS e ágar triptona soja suplementado com dois por cento de cloreto de sódio, ou TSAS.Incube todas as placas a 35 a 37 graus Celsius por até 96 horas. Em seguida, conte as colônias, ignorando as placas com colônias em número excessivo para contagem ou contendo menos de 25 colônias. Para realizar um ensaio de competição, selecione uma cepa de V. Parahaemolyticus que produza as colônias esperadas na cor turquesa em TCBS e colônias ciano em ágar cromogênico, e uma não-V.Parahaemolytius que não cresce em nenhum dos meios ou apresenta cor de colônia diferente. Transfira algumas colônias isoladas de V. Parahaemolyticus e V. Metschnikovii de um ágar TSAS para cinco mililitros de caldo TSBS e incube por 16 a 24 horas a 35 a 37 graus Celsius. Transfira algumas colônias isoladas de Shigella sonnei de ágar Infusão Cérebro-Coração, ou BHI, para cinco mililitros de caldo BHI e incube por 16 a 24 horas a 35 a 37 graus Celsius.No dia seguinte, realize uma diluição seriada para cada cepa, planteando as diluições em placas de ágar não seletivo para determinar as unidades formadoras de colônia por mililitro das culturas de crescimento noturno. Em seguida, utilize as culturas de crescimento noturno e os tubos de diluição para misturar diferentes volumes de uma cepa de V. Parahaemolyticus e de uma espécie não V. Parahaemolyticus e espalhe 100 microlitros da mistura bacteriana em placas individuais de ágar cromogênico, TCBS e TSAS.Após até 96 horas a 35 a 37 graus Celsius, conte as colônias com base nas diferenças de crescimento e morfologia nas placas cromogênicas e TCBS. Para avaliar os efeitos dos homogeneizados de ostra sobre o crescimento bacteriano em meios seletivos e diferenciais, pese primeiramente pelo menos 50 gramas de carne de ostra de pelo menos 12 moluscos bivalves, incluindo a carne e o líquido. Em seguida, adicione uma massa igual de PBS aos tecidos de ostra e homogeneíze a mistura em alta velocidade por 90 segundos.Em seguida, adicione 100 gramas do homogeneizado de ostra diluído a 400 gramas de PBS e homogeneíze a mistura em alta velocidade por um minuto. Em seguida, autoclave o homogeneizado. Após o resfriamento, adicione 100 microlitros de cada cultura de V. Parahaemolyticus e não-V.Adicione a cultura de Parahaemolyticus à suspensão de ostra e use um homogeneizador para misturar as células bacterianas com o homogenato de ostra. Prepare diluições de um vezes 10 à potência de menos um até um vezes 10 à potência de menos três do homogenato de ostra enriquecido em PBS, conforme demonstrado, distribuindo 100 microlitros de cada diluição em placas individuais de meio cromogênico, TCBS e TSAS. Após 96 horas a 35 a 37 graus Celsius, compare as contagens reais de colônias nos ágares cromogênico e TCBS com as contagens esperadas de colônias deduzidas a partir da contagem padrão em placas realizada nas culturas de crescimento noturno.Para determinar o crescimento e a morfologia das colônias das cepas utilizadas neste estudo, as bactérias foram cultivadas em meios seletivos e diferenciais. O TCBS é o meio convencional utilizado para o isolamento de algumas espécies de Vibrio, incluindo o V. parahaemolyticus turquesa e o V. cholerae amarelo. O uso de meio cromogênico para seleção de espécies de Vibrio clinicamente relevantes a partir de amostras de alimentos e ambientais resulta na geração de colônias ciano de V. parahaemolyticus e magenta de V. cholerae.Colônias de V.Parahaemolyticus cultivadas em placas de ágar cromogênico na presença de homogeneizado de ostra são observadas em números semelhantes aos obtidos em meios não seletivos, sugerindo que o limite de detecção do meio cromogênico é semelhante ao dos meios não seletivos, mesmo na presença de uma matriz alimentar. Além disso, o crescimento e recuperação de V.Parahaemolyticus não são afetados pela presença de uma espécie não-V. Parahaemolyticus, uma característica essencial para meios diferenciais e seletivos, já que amostras ambientais contêm várias espécies de Vibrio em altos números, especialmente após um procedimento de enriquecimento.Além disso, a comparação entre os ágares TCBS e cromogênicos por PCR da hemolisina termolábil revela uma maior sensibilidade e especificidade para o ágar cromogênico, indicando um desempenho superior geral desse meio diferencial e seletivo na detecção e identificação de V. parahaemolyticus. Após dominado, todo o procedimento, incluindo os testes e tempos de incubação de aproximadamente 50 cepas, pode ser concluído em até 30 dias quando realizado corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de rotular cuidadosamente todas as culturas e utilizar técnica asséptica em todos os momentos.Após este procedimento, outros métodos como a PCR de colônia podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como: Este isolado específico carrega um gene de virulência? Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de segurança alimentar e saúde pública explorarem a detecção de espécies de Vibrio em frutos do mar e no ambiente estuarino. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar uma contagem padrão em placa e de como avaliar a sensibilidade, especificidade e limite de detecção de um meio de cultura.Não se esqueça de que trabalhar com patógenos e meio quente pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de roupas protetoras, cobertura de feridas abertas e segregação de resíduos biologicamente perigosos devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

development-more-sensitive-specific-chromogenic-agar-medium-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Fonte: Heering, J., et al. Indução de diferenciação celular e imagem de célula única de células nadadoras e enxameadoras de Vibrio parahaemolyticus . J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a indução da diferenciação de células de enxame em Vibrio parahaemolyticus usando um meio de ágar especialmente preparado. Ao manipular pistas ambientais, como depleção de ferro, suplementação de cálcio e contato com a superfície, as bactérias são estimuladas a fazer a transição de sua forma de nadador para...

Indução da diferenciação de Vibrio parahaemolyticus em células de enxame

Fonte: Heering, J., et al., Indução de Diferenciação Celular e Imagem de Célula Única de Vibrio parahaemolyticus Swimmer e Swarmer Cells. J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra a preparação de células de enxame de uma colônia de Vibrio parahaemolyticus para imagens de fluorescência. As bactérias são geneticamente modificadas para expressar uma proteína marcada com fluoróforo que se localiza unipolarmente em células nadadoras e bipolarmente em células de enxame alongadas, permitindo sua...

Preparação de células de enxame de Vibrio parahaemolyticus para imagem

Fonte: Yeung, M., et al. Desenvolvimento de um meio de ágar cromogênico mais sensível e específico para a detecção de Vibrio parahaemolyticus e outras espécies de Vibrio . J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um método baseado em cultura para identificar espécies de Vibrio , destacando o ágar cromogênico como uma alternativa mais precisa ao tiossulfato-citrato-sais biliares-sacarose comumente usado ou ágar TCBS. O ágar cromogênico fornece diferenciação superior das cepas de Vibrio,...

Um novo meio cromogênico para detecção rápida de espécies de Vibrião

Fonte: Brumfield, K. D., et al., Técnicas de Laboratório Usadas para Manter e Diferenciar Biotipos de Isolados Clínicos e Ambientais de Vibrio cholerae . J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo demonstra o teste Voges-Proskauer (VP) para diferenciar entre três biótipos de Vibrio cholerae: clássico, tipo selvagem El Tor e variante El Tor. Cada cultura é inoculada em um meio contendo glicose, incubada e tratada com α-naftol e hidróxido de potássio para detectar a presença de acetoína. Uma cor...

Ensaio Voges-Proskauer para Diferenciação de Biótipos de Vibrio cholerae

Um protocolo envolvendo concentração integrada, enriquecimento e detecção colorimétrica de ponto final de patógenos transmitidos por alimentos em grandes volumes de água agrícola é apresentado aqui.  A água é filtrada através de Swabs de Moore modificados (MMS), enriquecidos com meios seletivos ou não seletivos, e a detecção é realizada usando dispositivos analíticos baseados em papel (μPAD) embutidos com substratos colorimétricos indicativos bacterianos.

Papel colorimétrico à base de Detecção de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. E<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; A partir de grandes volumes de água Agrícola

Este manuscrito descreve as técnicas adequadas de manutenção de Vibrio cholerae , além de uma série de ensaios bioquímicos, utilizados coletivamente para a diferenciação rápida e confiável entre a V clínica e ambiental. Biótipos de cholerae em um ambiente de laboratório.

Técnicas de laboratório usadas para manter e diferenciar biótipos de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Isolados clínicos e ambientais

Este protocolo permite a microscopia de célula única do nadador Vibrio parahaemolyticus diferencialmente diferenciado e células swarmer. O mï¿½odo produz uma populaï¿½o de cï¿½ulas swarmer facilmente disponï¿½eis para a anï¿½ise de uma ï¿½ica cï¿½ula e abrange a preparaï¿½o de culturas de cï¿½ulas, induï¿½o de diferenciaï¿½o de swarmer, preparaï¿½o de amostra e anï¿½ise de imagem.

Indução de diferenciação celular e imagens de células<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer e Swarmer

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Aqui apresentamos o princípio, a estrutura e a instrução do sistema inteligente de teste de sensibilidade antimicrobiana de alto rendimento/triagem de fagos. Sua aplicação é ilustrada usando Salmonella isolada de aves em Shandong, China, como exemplo. O índice Lar é calculado, e sua importância na avaliação da resistência antimicrobiana é discutida de forma abrangente.

Aplicação do Sistema Inteligente de Teste de Sensibilidade Antimicrobiana de Alto Rendimento/Phage Screening System e Índice Lar de Resistência Antimicrobiana

Aprenda a avaliar um meio cromogênico para detecção de Vibrio parahaemolyticus em microbiologia de segurança alimentar. Este método oferece maior sensibilidade e especificidade comparado aos meios convencionais.

Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de Vibrio parahaemolyticus E outro Vibrio Espécies (Vídeo) | JoVE Journal

Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de

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