Desenvolvimento de uma mais sensível e específica Cromogênico Agar para a detecção de Vibrio parahaemolyticus E outro Vibrio Espécies

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a sensibilidade e especificidade de um novo meio cromogênico para a capacidade de detectar e isolar Vibrio parahaemolyticus em comparação com o meio convencional. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia alimentar e ambiental, como qual é a prevalência de espécies de Vibrio em ambientes alimentares e de colheita? A principal vantagem do nosso procedimento é que muitos isolados bacterianos podem ser usados, inclusive na presença de uma matriz alimentar.

Antes de cultivar as bactérias, autoclave todo o meio de ágar. Em seguida, resfrie o ágar-ágar a 45 a 50 graus Celsius em banho-maria. Quando o ágar-ágar estiver pronto, arrume as placas de Petri vazias em pilhas de cinco a seis placas.

Em seguida, começando do fundo da pilha, despeje o ágar derretido em cada prato até ficar meio cheio, recolocando as tampas após o vazamento. Deixe o ágar-ágar solidificar em temperatura ambiente por pelo menos 12 horas. Para configurar as culturas de cepas microbianas, quando o ágar estiver pronto, use uma alça de inoculação estéril para transferir as culturas para as placas de ágar não seletivas apropriadas, listrando as bactérias em um padrão que permitirá a observação de colônias isoladas.

Quando todas as colônias tiverem sido plaqueadas, incubar as culturas de cabeça para baixo a 35 a 37 graus Celsius por até 48 horas, exceto para as espécies de Campylobacter, que devem ser incubadas em um frasco de tampa fechada contendo uma bolsa de gás para produzir um ambiente microaerofílico. Observe a morfologia da colônia no final da incubação. Culturas puras devem produzir colônias que exibem uma morfologia de colônia semelhante.

Para cultivar as colônias de interesse em meios seletivos e diferenciais, transfira algumas colônias isoladas para cinco mililitros do caldo apropriado e reincube as culturas a 35 a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. No dia seguinte, coloque uma série de culturas noturnas em pelo menos uma placa de ágar tiossulfato-citrato-bile-sacarose, ou TCBS, e pelo menos uma placa de ágar cromogênica por até 96 horas de incubação a 35 a 37 graus Celsius. No final da incubação, examinar a densidade da cultura na placa e o tamanho das colónias isoladas para determinar o crescimento global das estirpes, registando a cor das colónias sob luz ambiente ou UV, conforme apropriado, e anotando quaisquer outras características importantes das colónias.

Para realizar um ensaio de recuperação, inocular culturas jovens de Vibrio parahaemolyticus em cinco mililitros de caldo de soja tríptico, suplementado com cloreto de sódio a dois por cento, ou TSBS, e colocar os tubos a 35 a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas. No dia seguinte, faça um vórtice nas culturas noturnas e configure uma vez 10 elevado a negativo, a um vezes 10 elevado a sete diluições negativas da bactéria em PBS. Usando as diluições de um vezes 10 elevado a quatro a um vezes 10 elevado a negativo, coloque uniformemente 100 microlitros de cada diluição em placas individuais de ágar cromogênico, TCBS e tríptico de soja suplementadas com duas placas de ágar cloreto de sódio, ou TSAS.

Incube todas as placas a 35 a 37 graus Celsius por até 96 horas. Em seguida, conte as colônias, ignorando as placas com colônias numerosas demais para contar ou contendo menos de 25 colônias. Para realizar um ensaio de competição, selecione uma cepa de V.Parahaemolyticus que produza as colônias de turquesa esperadas em TCBS e colônias ciano em ágar cromogênico e uma não-V.

Espécie de Parahaemolytius que não cresce em nenhum dos meios ou exibe uma cor de colônia diferente. Transfira algumas colônias isoladas de V.Parahaemolyticus e V.Metschnikovii de uma agricultura TSAS, para cinco mililitros de TSBS para incubação de 16 a 24 horas a 35 a 37 graus Celsius. Transfira algumas colônias isoladas de Shigella sonnei do ágar Brain Heart Infusion, ou BHI, para cinco mililitros de caldo BHI por 16 a 24 horas a 35 a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, realizar uma diluição em série para cada estirpe, semeando as diluições em placas de ágar não selectivas para determinar as unidades formadoras de colónias por mililitro das culturas durante a noite. Em seguida, use as culturas noturnas e os tubos de diluição para misturar diferentes volumes de uma cepa de V.Parahaemolyticus e uma não-V. Parahaemolyticus e espalhe 100 microlitros da mistura bacteriana em placas individuais de ágar cromogênico, TCBS e TSAS.

Após até 96 horas a 35 a 37 graus Celsius, conte as colônias com base em suas diferenças de crescimento e morfologia nas placas cromogênicas e TCBS. Para avaliar os efeitos dos homogeneizados de ostras no crescimento bacteriano em meios seletivos e diferenciais, primeiro pese pelo menos 50 gramas de carne de ostra de pelo menos 12 moluscos, incluindo a carne e o licor. Em seguida, adicione uma massa igual de PBS aos tecidos da ostra e misture a mistura em alta velocidade por 90 segundos.

Em seguida, adicione 100 gramas do homogeneizado de ostra diluído a 400 gramas de PBS e bata a mistura em alta velocidade por um minuto. Em seguida, autoclave o homogeneizado. Após o resfriamento, adicione 100 microlitros de cada V.Parahaemolyticus noturno e não-V.

Cultura de Parahaemolyticus para a pasta de ostras e use um homogeneizador para misturar as células bacterianas com o homogeneizado de ostras. Faça uma vez 10 elevado a um negativo para um vezes 10 elevado a três diluições negativas do homogeneizado de ostra enriquecido em PBS, conforme demonstrado, espalhando 100 microlitros de cada diluição em placas cromogênicas individuais, TCBS e TSAS. Após 96 horas a 35 a 37 graus Celsius, compare as contagens reais de colônias nos ágares cromogênicos e TCBS com as contagens de colônias esperadas deduzidas da contagem padrão de placas conduzida nas culturas noturnas.

Para determinar o crescimento e a morfologia das colônias das cepas utilizadas neste estudo, as bactérias foram cultivadas em meios seletivos e diferenciais. O TCBS é o meio convencional usado para o isolamento de algumas espécies de Vibrio, incluindo a turquesa V.Parahaemolyticus e a V.Cholerae amarela. O uso de meio cromogênico para selecionar espécies de Vibrio clinicamente relevantes a partir de amostras alimentares e ambientais resulta na geração de V.Parahaemolyticus ciano e V.Cholerae magenta.

Colônias de V. Parahaemolyticus cultivadas em placas de ágar cromogênico na presença de homogenato de ostras são observadas em número semelhante àquelas em meios não seletivos, sugerindo que o limite de detecção do meio cromogênico é semelhante ao de meios não seletivos, mesmo na presença de uma matriz alimentar. O crescimento e a recuperação de V. Parahaemolyticus também não são afetados pela presença de um não-V. Espécies de Parahaemolyticus, um atributo essencial para meios diferenciais e seletivos, pois as amostras ambientais contêm várias espécies de Vibrio em grande número, especialmente após um procedimento de enriquecimento.

Além disso, a comparação de TCBS e ágares cromogênicos por PCR termolábil de hemolisina revela uma maior sensibilidade e especificidade para o ágar cromogênico, indicando um melhor desempenho geral para este meio diferencial e seletivo para detecção e identificação de V. Parahaemolyticus. Uma vez dominado, todo o procedimento, incluindo os tempos de teste e incubação de aproximadamente 50 cepas, pode ser concluído em 30 dias quando realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de rotular diligentemente todas as culturas e usar a técnica asséptica em todos os momentos.

Após este procedimento, outros métodos, como PCR de colônias, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: Este isolado específico carrega um gene de virulência? Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de segurança alimentar e saúde pública explorarem a detecção de espécies de Vibrio em moluscos e no ambiente estuarino. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir uma contagem de placas padrão e como avaliar a sensibilidade, especificidade e limite de detecção de um meio de crescimento.

Não se esqueça de que trabalhar com patógenos e meio quente pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar roupas de proteção, cobrir feridas abertas e segregar resíduos de risco biológico devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.