Name: Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprenda a medir taxas de oxidação de glicose e ácidos graxos em coração isolado de rato. Este método permite avaliar função cardíaca e adaptações metabólicas em tempo real com controle total de variáveis experimentais.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Detalhes do protocolo anterior e os métodos para quantificar simultaneamente o fluxo de substrato através da oxidação da glicose e oxidação dos ácidos graxos no coração isolado de rato de trabalho. As medições pode, então, ser sobreposta aos parâmetros funcionais cardíacas gravadas para determinar a relação entre os substratos e metabolismo trabalho cardíaco sob condições basais e de stress (mudança de carga de trabalho, por isquemia-reperfusão, etc ...). É também possível avaliar o modo como a relação metaboli...

Relevância clínica No coração dos mamíferos, há uma forte correlação positiva entre o fluxo de substratos através de vias metabólicas oxidativas, geração de ATP e um trabalho cardíaco. Ao longo das últimas duas décadas, a investigação da relação entre o metabolismo intrincada e função cardíaca levou a reconhecer que as alterações no metabolismo cardíaco são uma causa para a disfunção contráctil e remodelação estrutural possivelmente patológica na definição de diferentes tipos de doenças cardíacas 2-4. Portanto, espera-se que a nossa compreensão dos mecanismos que regulam a remodelação metabólica do coração salientou irá levar à identificação de alvos terapêuticos para a prevenção ou tratamento de insuficiência cardíaca 5-7. A recente publicação de uma declaração científica da American Heart Association sobre &quot;Avaliação Cardiac Metabolism&quot;, enfatiza o crescente interesse da comunidade científica para tseu campo de pesquisa 8. Mas, enquanto os avanços tecnológicos na imagem cardíaca agora permitir uma avaliação rápida e precisa da morfologia e função cardíaca, o estudo in vivo do metabolismo cardíaco continua a ser limitado e oneroso: espectroscopia e ressonância magnética (NMR) nuclear Positron Emission Tomography de imagem (PET) pode ser usado para seguir cardíaca metabolismo do fosfato de alta energia e atividade do ciclo de Krebs, mas essas técnicas são atormentados por altos custos operacionais e pela sua incapacidade de determinar a contribuição dos vários substratos para o metabolismo oxidativo em condições de estado estacionário 9 .Para esta data, o ex vivo trabalhando preparação do coração representa a técnica única e exclusiva disponível para estudar, simultaneamente e em tempo real, a função contrátil e do fluxo dos substratos utilizados em vias metabólicas oxidativas 7,9. O protocolo seguinte tem como objetivo fornecer orientações na preparação e utilização de reagentes usados ​​para determinar o ratoes de utilização de substratos no coração isolado de rato de trabalho. O Aparelho coração isolado Rodent Trabalho Embora a técnica é quase meio século de idade, a preparação de trabalho isolado coração de rato continua a ser um método de escolha para a investigação cardiovascular. Tal como acontece com a preparação de coração de Langendorff, o funcionamento do coração roedor oferece uma maneira relativamente simples, fiável e barato para medir uma vasta gama de parâmetros cardíacos, independentemente dos efeitos de confusão de outros órgãos, e outros factores neuro-hormonais circulantes. Mas, em contraste com o coração de Langendorff-perfundidos, o funcionamento do coração continua a executar o trabalho cardíaco quase fisiológica, um pré-requisito para a geração de fluxo metabólico oxidativo para níveis que são relevantes para condições in vivo. Isto é conseguido através da entrega do tampão de perfusão para o ventrículo esquerdo (VE) através de uma cânula ligada ao átrio esquerdo, e como o LV e contratos enche, otampão é ejectado através da linha aórtica contra uma determinada pressão hidrostática pós-carga. O design do aparelho de perfusão originalmente descrito por Neely e colegas 10 foi posteriormente melhorado por Taegtmeyer, bainhas e Krebs 11, mas mudou muito pouco desde então. Conforme descrito no aparelho original, função contrátil pode ser avaliada através da determinação do débito cardíaco, usando não mais que os cilindros graduados e um cronômetro para medir aórtica e coronariana flui 10,11. Vários fornecedores oferecem agora sistemas completos de perfusão cardíaca de trabalho de roedores. Estes aparelhos disponíveis comercialmente podem ser adquiridos com flowprobes, transdutores de pressão, um cateter de pressão-volume e todo o equipamento necessário para a aquisição de dados e análise funcional cardíaca. Os fornecedores oferecem extensas sessões de documentação e de formação para dar a conhecer o novo usuário com o seu equipamento. Vários artigos de revisão também protocolos detalhes sobre o instrum coração a trabalharentação e sobre a utilização de cateteres para medir a função cardíaca em roedores 12-15. Por esta razão, vamos citar apenas brevemente o set-up do aparelho de perfusão e do equipamento de gravação. O presente protocolo tem a finalidade de complementar a informação já disponível com uma descrição dos métodos que podem ser utilizados para medir, simultaneamente, as taxas de glucose e oxidação de ácidos gordos de cadeia longa, os dois principais substratos energéticos proporcionando, no coração normal. Descrevemos aqui todos os passos envolvidos na a utilização de substratos de energia radiomarcados para o estudo do metabolismo oxidativo do miocárdio, a partir da preparação de reagentes e tampões para a extracção e processamento de amostras, para a análise de dados. Princípios do Método Cardiomiócitos gerar a maior parte de sua energia para a contração da fosforilação oxidativa de ácidos graxos (ácidos graxos de cadeia longa principalmente) e carboidratos (GlucosE e lactato). O coração tem muito limitado reservas energéticas e depende de um fornecimento constante desses substratos energéticos prestar a partir da circulação. O catabolismo da glicose através da via glicolítica produz piruvato que é então descarboxilado por o complexo piruvato desidrogenase da membrana mitocondrial interna. ácidos gordos de cadeia longa, extraídos a partir de albumina ou de circulação de lipoproteínas de triglicéridos, são em primeiro lugar activados em moléculas de acil-CoA no citosol e, posteriormente, transportados para dentro da matriz mitocondrial de transporte através da carnitina para entrar na via beta-oxidação. As moléculas de acetil-CoA produzidas pelo catabolismo da glicose e os ácidos gordos de combustível do ciclo de Krebs para gerar os equivalentes redutores (NADH e FADH2) que são usados pela cadeia de transporte de electrões para construir a força motriz protónica através da membrana mitocondrial interna e gerar ATP por meio da actividade da ATP sintase. Água e dióxido de carbono são os subprodutos finais deas reacções enzimáticas que ocorrem dentro do ciclo de Krebs. O fornecimento de 14 C e 3 H- substratos marcados radioactivamente (tais como 14 C-glicose e ácido oleico radiomarcado 3H-radiomarcado) para o coração isolado irá consequentemente levar à produção de 14 CO 2 e H 2 O 3 que pode ser quantitativamente recuperada a partir do efluente coronário. A recolha de 14 CO 2 é levada a cabo mantendo o coração perfundido isolado dentro de uma câmara selada e por imediatamente a recuperar o efluente coronário medida que sai do coração. Uma coluna de permuta aniónica pequena é usado para separar e recuperar 3 H2O a partir do efluente coronário. A radioactividade das amostras processadas é medido com um contador de cintilação líquida, e com o conhecimento da actividade específica dos substratos marcados radioactivamente utilizado, é então possível quantificar individualmente o fluxo de glicose e de ácido gordo nooxidação percursos 16,17.

<table><tbody><tr><td>Cloreto de Sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio Heptahidratado (MgSO4*7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8 resina, forma de cloreto, malha seca 100 - 200, 500 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1401441</td><td>Este item pode ser substituído comprando diretamente a forma de hidróxido&nbsp; (veja a referência abaixo), mas isso custará quase 8 vezes mais</td></tr><tr><td>resina AG 1-X8, forma de hidróxido, tamanho de malha seca de 100 - 200, 100 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1432445</td><td>A compra deste item permite ignorar a conversão da resina de troca aniônica da forma de cloreto para a forma de hidróxido (consulte a seção 1.2 do protocolo) Suporte de</td></tr> <tr><td>filtro a vácuo de microanálise de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-2</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td>Corrosivo. Consulte a MSDS do produto para manuseio e armazenamento adequados.</td></tr><tr><td>Tubo de Dispersão de Gás com Cilindro Frito</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>Probumin Soro Bovino Albumina Sem Ácidos, Pó</td><td>EMD Millipore</td><td>820027</td><td>Recomendamos o uso de um BSA desengordurado com carvão, pois outros processos de purificação, como o fracionamento de etanol frio, podem deixar resíduos tóxicos para o coração.</td></tr><tr><td>Oleato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico, [9,10-3H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>Material radioativo. Siga as diretrizes do escritório de segurança de radiação da sua instituição para pedidos e manuseio.</td></tr><tr><td>Tubo de membrana de diálise, diâmetro de 29 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glicose, D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>Material radioativo. Siga as diretrizes do escritório de segurança de radiação da sua instituição para pedidos e manuseio.</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>Eli Lilly and Company</td><td>NDC 0002-8215-01 (HI-210)</td><td></td></tr><tr><td>Inactin Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>Substância controlada no USDEA Schedule III</td></tr><tr><td>3-0 Silk Black Braid</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x Hyamine Hydroxide</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>Altamente tóxico e causa queimaduras graves. Consulte o produto MSDS para manuseio e armazenamento adequados</td></tr><tr><td>Frascos de cintilação de vidro de 20 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25E</td><td>Use frascos de vidro para recuperação quantitativa de 14CO2</td></tr><tr><td>20 ml Frascos de cintilação HDPE</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23B</td><td>Use frascos de HDPE para recuperação quantitativa de 3H2O</td></tr><tr><td>Vermelho Rolhas de Manga de Borracha</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-126DD</td><td>Fit Frascos de cintilação de 20 mL; Agulha Reutilizável</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 23G x 40 mm</td><td>BD</td><td>305194</td><td>Use para injetar ácido perclórico através da tampa de borracha da armadilha CO2</td></tr><tr><td>Ácido Perclórico, 60%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A228</td><td>Altamente corrosivo e pode atuar como oxidante e/ou causar risco de explosão. Consulte o produto MSDS para manuseio e armazenamento adequados</td></tr><tr><td>Ultima Gold, Coquetel de Cintilação</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>Lã de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean Detergente em Pó</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>Para limpeza de copos, peças plásticas e tubos</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme Enzyme-Active Detergent</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-000-115</td><td>Para limpeza de superfícies "difíceis de alcançar" (tubos, vidraria) contaminadas por resíduos de ácidos graxos-BSA</td></tr></tbody></table>

os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de trabalho

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

O coração dos mamíferos é um grande consumidor de ATP e necessita de um fornecimento constante de substratos de energia para contracção. Não surpreendentemente, alterações do metabolismo do miocárdio têm sido associados ao desenvolvimento de disfunção contráctil e insuficiência cardíaca. Portanto, desvendar a relação entre o metabolismo e contração deve lançar luz sobre alguns dos mecanismos que regem a adaptação cardíaca ou má adaptação em estados de doença. A preparação trabalhar isolado coração de rato pode ser utilizado a seguir, simultaneamente e em tempo real, a função contrátil cardíaca e fluxo de energia fornecendo substratos em vias metabólicas oxidativas. O presente protocolo tem como objectivo proporcionar uma descrição detalhada dos métodos utilizados para a preparação e a utilização de tampões para a medição quantitativa das taxas de oxidação de glucose e ácidos gordos, a principal energia fornecendo substratos do coração. Também são discutidos os métodos utilizados para a análise da amostra e interpretação de dados.Em resumo, a técnica é baseada no fornecimento de 14C-glucose radiomarcada e um ácido gordo de cadeia longa 3 H- radiomarcado a um coração a bater ex vivo através de perfusão de cristalóide normotérmica. 14 CO 2 e 3 H 2 O, derivados finais de as reacções enzimáticas envolvidas na utilização destes substratos de energia fornecendo, são então quantitativamente recuperada a partir do efluente coronário. Com o conhecimento da actividade específica dos substratos radiomarcados utilizados, é então possível quantificar individualmente o fluxo de glicose e de ácido gordo nas vias de oxidação. função contráctil do coração isolado pode ser determinado em paralelo com o aparelho de controlo apropriado e correlacionado directamente com os valores de fluxo metabólico. A técnica é extremamente útil para estudar a relação metabolismo / contracção em resposta a várias condições de estresse, tais como alterações no pré e pós carga e isquemia, uma droga ou um Circulafactor de Ting, ou após a alteração na expressão de um produto génico.

Duas experiências representativas estão descritas nas figuras abaixo. Em ambos os casos, o centro de um 16 semanas de idade do sexo masculino Sprague Dawley foi isolado e perfundido no modo de funcionamento com tampão de KH preparado de acordo com o protocolo anterior. Em cada experimento, o coração foi submetido a uma condição de tensão de afectar o trabalho cardíaco. função contráctil cardíaca foi avaliada por registo contínuo da pressão de pulso através da inserção de um transdutor de...

O protocolo a seguir descreve a preparação e utilização de tampões para a medição quantitativa das taxas de oxidação de glicose e ácidos graxos no coração isolado de rato em funcionamento. Os métodos utilizados para análise da amostra e interpretação dos dados também são discutidos.

Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

O objetivo geral deste procedimento é obter simultaneamente medidas em tempo real das taxas miocárdicas de oxidação de glicose e oxidação de ácidos graxos, bem como da função contrátil cardíaca em um coração de rato isolado trabalhando. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área cardiovascular, tais como como o coração se adapta metabolicamente a mudanças agudas nas demandas energéticas e como essas respostas são afetadas em condições patológicas.A principal vantagem desta técnica é que ela fornece ao pesquisador controle total sobre as variáveis ambientais, como a natureza e as concentrações de substratos, fármacos ou hormônios administrados ao coração. A principal responsável seria Bhavisha Bakrania, pesquisadora pós-doutoranda do centro de recursos cardiovasculares Reno no Centro Médico da Universidade do Mississippi. Para começar, inicie a bomba para escorvar o aparelho de perfusão e oxigenar o tampão.Após preparar os materiais, anestesie uma rata e prepare-a para a cirurgia. Retire os pelos do abdômen e realize uma incisão mediana com extensão lateral. Desloque o estômago e o intestino para o lado para acessar a veia cava inferior e injete 200 unidades

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O objectivo é para monitorar o estado redox mitocondrial de corações isolados dentro do contexto de pré-carga fisiológica e pressões pós-carga. Um modelo de coração biventricular trabalhando coelho é apresentado. Alta resolução espaço-temporal de imagens de fluorescência de NADH é usado para monitorar o estado redox mitocondrial do tecido epicárdico.

NADH Fluorescência de Imagem biventricular isolado de coelho

Métodos para biópsia de vasto lateral, a preparação de mitocôndrias purificada e profiling respirométrico são descritos. O uso de volume muscular pequeno torna esta técnica adequada para aplicações de pesquisa clínica.

Preparação e Avaliação respirométrico de mitocôndrias isoladas de tecido muscular esquelético Obtido por meio de agulha de biópsia percutânea

De novo a lipogênese e oxidação do ácido β-gordo constituem vias metabólicas importantes em hepatócitos, caminhos que são perturbados em vários distúrbios metabólicos, incluindo a doença de fígado gordo. Aqui demonstramos isolamento de hepatócitos primários de rato e descrever quantificação da oxidação de ácidos graxos e β-lipogênese.

Determinação da oxidação de ácidos gordos e Lipogênese em Rato Os hepatócitos primária

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

A glicólise é um marcador metabólico definidor em vários sistemas biológicos. O monitoramento da glicólise medindo o fluxo extracelular de H+ é comum, mas requer correção para ser quantitativa e inequívoca. Aqui, demonstramos como coletar e corrigir dados de fluxo extracelular para distinguir entre fontes respiratórias e glicolíticas de acidificação extracelular.

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

O estudo do metabolismo está se tornando cada vez mais relevante para a pesquisa imunológica. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a glicólise e a respiração mitocondrial em esplenócitos de camundongos e linfócitos T e B.

Um protocolo otimizado para analisar glicólise e respiração mitocondrial nos linfócitos

Aqui nós introduzimos um método para usar um cateter ótico do intra-ventrículo em corações perfundidos para executar a espectroscopia da absorvência através da parede do coração. Os dados obtidos fornecem informações robustas sobre a tensão do oxigênio tecidual, bem como a utilização do substrato e o potencial de membrana simultaneamente com medidas de desempenho cardíaco nesta preparação onipresente.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

A regulação intacta da absorção de glicose muscular é importante para manter a homeostase de glicose corporal inteira. Este protocolo apresenta avaliação da absorção de glicose estimulada pela insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado ao delinear o impacto de várias intervenções fisiológicas em todo o metabolismo da glicose corporal.

Medição da absorção de glicose estimulada por insulina e contração em músculo esquelético maduro isolado e incubado de camundongos

O ácido graxo β-oxidação é uma via metabólica essencial responsável pela geração de energia em muitos tipos diferentes de células, incluindo hepatócitos. Aqui, descrevemos um método para medir o ácido graxo β-oxidação em hepatócitos primários recém-isolados usando ácido palmítico de 14C.

Medição do ácido graxo β-oxidação em uma suspensão de hepatócitos de rato recém-isolados

Descrito aqui é um protocolo detalhado para a realização de ensaios de estresse mitocondrial e ensaio de taxa glicólítica em amostras de tecido de retina ex vivo usando um bioanalzer comercial.

Determinação da respiração mitocondrial e glicolise em amostras de tecido retinal ex vivo

Descrevemos uma configuração experimental para administrar metabólitos hiperpolarizados marcados com 13C no modo de perfusão contínua a um coração de rato perfundido isolado. Uma abordagem dedicada à aquisição de 13C-NMR permitiu a quantificação da atividade enzimática metabólica em tempo real, e uma análise multiparamétrica de 31P-NMR permitiu a determinação do conteúdo de ATP tecidual e do pH.

Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [1-13C]Piruvato e Espectroscopia de RMN 13C/31P

Aprenda a medir taxas de oxidação de glicose e ácidos graxos em coração isolado de rato. Este método permite avaliar função cardíaca e adaptações metabólicas em tempo real com controle total de variáveis experimentais.

Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

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