Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

O objetivo geral deste procedimento é obter simultaneamente medidas em tempo real das taxas miocárdicas de oxidação de glicose e oxidação de ácidos graxos, bem como da função contrátil cardíaca em um coração de rato isolado trabalhando. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área cardiovascular, tais como como o coração se adapta metabolicamente a mudanças agudas nas demandas energéticas e como essas respostas são afetadas em condições patológicas.

A principal vantagem desta técnica é que ela fornece ao pesquisador controle total sobre as variáveis ambientais, como a natureza e as concentrações de substratos, fármacos ou hormônios administrados ao coração. A principal responsável seria Bhavisha Bakrania, pesquisadora pós-doutoranda do centro de recursos cardiovasculares Reno no Centro Médico da Universidade do Mississippi. Para começar, inicie a bomba para escorvar o aparelho de perfusão e oxigenar o tampão.

Após preparar os materiais, anestesie uma rata e prepare-a para a cirurgia. Retire os pelos do abdômen e realize uma incisão mediana com extensão lateral. Desloque o estômago e o intestino para o lado para acessar a veia cava inferior e injete 200 unidades USP de Heparina.

Aguarde cinco a 10 segundos, depois use uma tesoura para cortar o diafragma e os lados da caixa torácica, expondo o conteúdo da cavidade torácica. Em seguida, segure delicadamente o coração com a mão e remova juntos o coração e os pulmões. Corte ao nível da aorta descendente, tomando cuidado para não danificar o arco aórtico e a aorta ascendente no processo.

Transfira imediatamente o coração e os pulmões para uma bacia de dissecação contendo tampão KH gelado. Após o coração parar de bater, aprenda a trabalhar rapidamente para que possa ser reiniciado em um ou dois minutos. Agora, submerja o coração e os pulmões em uma nova bacia com tampão KH gelado.

Remova rapidamente quaisquer pedaços grandes de tecido pulmonar e, em seguida, corte a aorta descendente logo acima do arco aórtico. Para as etapas seguintes, tome as precauções necessárias para o uso de materiais radioativos. Em seguida, usando pinça, abra cuidadosamente a aorta e deslize o coração para cima sobre a cânula.

Tenha muito cuidado para não obstruir a artéria aorta com uma cânula, pois isso pode causar hipoperfusão do coração e danos às válvulas aórticas. Agora, fixe a junção com um clipe microcirúrgico e inicie a perfusão de Langendorff do coração. Sem pressa, fixe a aorta à cânula aórtica utilizando um fio de seda 3-0 e remova o clipe microcirúrgico.

Em seguida, localize a veia pulmonar e remova os tecidos não cardíacos conforme necessário. Deixe tecido suficiente para fixar o átrio esquerdo à cânula. A cânulagem do átrio esquerdo é o segundo passo mais crítico do protocolo, pois a inserção inadequada da cânula ou a presença de vazamento enfraquecerá as contrações e comprometerá a quantificação das taxas metabólicas.

Em seguida, prepare a cânula da linha atrial esquerda, da mesma forma que foi feito para a cânula direita. Depois, com pinça, segure delicadamente a abertura da veia pulmonar e deslize o coração para cima na cânula atrial. Mova os tecidos conforme necessário, sem dobrar a aorta ou esticar excessivamente o coração.

Em seguida, fixe a cânula com um fio de seda 3 0. Por fim, abra a linha atrial enquanto simultaneamente comuta a linha aórtica para o modo de trabalho. Se o tampão vazar pelo átrio esquerdo, feche a linha atrial e volte ao modo Lagendorff.

Em seguida, use mais pontos para fixar melhor a cânula e tente alternar novamente para o modo de trabalho. Se o experimento incluir a medição direta da função do VE com um cateter, comece perfurando o ápice do VE usando uma agulha de calibre 26, introduza um cateter de pressão-volume e alinhe o eixo do cateter com o eixo longitudinal do VE. Em seguida, posicione o eletrodo distal E1 logo abaixo da válvula aórtica, adjacente à borda endocárdica, e posicione o eletrodo proximal E4 logo dentro da parede ventricular.

Agora, feche o coração em uma câmara com jaqueta d'água. Em seguida, comece a monitorar os parâmetros funcionais no software. Uma vez que os parâmetros basais tenham permanecido estáveis por pelo menos cinco minutos, inicie o registro dos dados.

Para medir o fluxo coronariano, registre o tempo necessário para coletar 20 mililitros do efluente. Em seguida, retire dois mililitros do efluente em uma seringa através do torneira de três vias e descarte o restante. Transfira imediatamente a amostra de dois mililitros para um tubo de microcentrífuga e retire uma alíquota de meio mililitro para determinar a taxa de oxidação da glicose.

Guarde o restante em gelo. Continue coletando amostras de efluentes coronarianos periodicamente e, antes de finalizar, injete 10 microlitros de solução salina hipertônica na linha atrial. Imediatamente antes de ela se conectar à cânula.

Utilize a resposta a este bólus para calcular a condutância paralela, a fim de determinar com precisão o volume cardíaco. Em seguida, desobstrua a câmara cardíaca e remova o cateter do VE. Então, corte o coração das cânulas e coloque-o em tampão KH gelado. Agora, seque rapidamente o coração com um papel-toalha e meça seu peso úmido.

Após pesar, proceda à dissecação das amostras de tecido necessárias e, em seguida, congele o tecido restante utilizando pinças resfriadas em gelo seco. Como preparação, carregue frascos de cintilação de vidro com um mililitro de hidróxido de hyamine 10x. Prepare um frasco para cada amostra de efluente coronariano e dois para os controles.

Assim que um frasco de amostra for carregado, coloque-o diretamente em um frasco de cintilação já carregado. Para a análise, tampe cuidadosamente o frasco com uma rolha de manga de borracha e use parafilm para selar o frasco. Agora, utilizando uma seringa de um mililitro com uma agulha longa de 23 gauge, injete 200 microlitros de ácido perclórico a 60% através da manga de borracha.

Deixe todos os frascos de amostra em repouso durante a noite. No dia seguinte, retire cuidadosamente cada tubo de amostra com pinças e lave o fundo dos mesmos sobre os frascos abertos com um mililitro de coquetel de cintilação para recuperar todo o hidróxido de hyamine. Em seguida, adicione mais nove mililitros de coquetel de cintilação a cada frasco.

Para obter a atividade específica, adicione 0,5 mililitros de tampão de profusão em dois dos frascos. Agite agora os frascos vigorosamente e deixe o frasco repousar por pelo menos seis horas antes de realizar as medições. Para determinar as taxas de oxidação de oleato miocárdico, prepare primeiro uma coluna de resina de troca aniônica para cada amostra.

Basta carregar as pontas de tubos de seringa de três mililitros com lã de vidro. Em seguida, adicione a pasta aquosa da resina até a marca de dois mililitros em cada coluna, utilizando uma pipeta de transferência. A seguir, lave a resina passando dois mililitros de água ultrapura por cada coluna três vezes.

Em seguida, coloque frascos de cintilação sob as colunas e carregue as colunas com meio mililitro de efluente coronariano. Para a medição do fundo, utilize tampão de perfusão. Agora, elua as colunas sucessivamente com meio mililitro, um mililitro e, finalmente, dois mililitros de água ultrapura.

Descarte as colunas. Em seguida, adicione 13 mililitros de coquetel de cintilação aos frascos. Adicione 0,5 mililitro de tampão de perfusão diretamente a dois frascos preenchidos com 13 mililitros de coquetel de cintilação líquida para determinação da atividade específica.

Agite vigorosamente os frascos, deixe repousar por mais de seis horas e realize as medições. Os corações foram isolados de duas ratas de 16 semanas e submetidos a diferentes condições de estresse. Em um coração, um aumento agudo na carga de trabalho foi simulado pelo aumento da pós-carga em 40% e pela adição de epinefrina ao tampão de perfusão.

A frequência cardíaca aumentou imediatamente em mais de 50% com a indução do salto de trabalho. A potência cardíaca aumentou em mais de 40% no salto de trabalho, o que foi acompanhado por um aumento nas taxas de oxidação de glicose e oleato. O aumento relativo em relação à linha de base para a oxidação de glicose foi acentuado.

O outro coração foi submetido a 15 minutos de isquemia global e 30 minutos de reperfusão. Nessas condições experimentais, uma pressão do pulso próxima à normal foi restabelecida alguns minutos após o início da reperfusão. Dentro de 10 minutos, a potência cardíaca aumentou rapidamente para valores superiores aos pré-isquemia antes de retornar a valores próximos aos basais.

Isso resultou de uma oxidação aumentada de oleato. Enquanto a oxidação da glicose foi rápida em retomar a atividade pré-isquêmica. Uma vez dominada, a isolamento do coração até a reperfusão inicial no modo de funcionamento pode ser realizado em menos de cinco minutos, se realizado corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como análises de expressão de RNA e proteínas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o efeito de uma droga ou condição de estresse sobre vias de sinalização molecular. Não se esqueça de que o trabalho com traçadores radioativos pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso completo de equipamentos de proteção individual, devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.