Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

ensaios de quimiotaxia visuais são essenciais para um melhor entendimento de como as células eucarióticas controlar a migração celular mediada por direccional quimioatractor. Aqui, descrevemos métodos detalhados para: 1) em tempo real, monitoramento de alta resolução de vários ensaios de quimiotaxia, e 2) visualizando simultaneamente o gradiente quimioatrativo ea dinâmica espaço-temporais de eventos de sinalização em células HL60 neutrófilos-like.

O objetivo geral deste modelo é permitir o monitoramento simultâneo de vários ensaios de quimiotaxia ou a visualização dos múltiplos eventos de sinalização de uma única célula de quimiotaxia. Os biólogos celulares da Overdeck desenvolveram várias abordagens diferentes para quantificar o comportamento da quimiotaxia das células. Até recentemente, somos capazes de responder a perguntas-chave no campo da quimiotaxia, como monitorar simultaneamente vários ensaios de quimiotaxia.

A principal vantagem dessa tecnologia é aplicar o princípio da microfluídica para gerar ingredientes altamente reprodutíveis e confiáveis para vários ensaios de quimiotaxia simultâneos com alta resolução em tempo real. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Xi Wen, um pós-doutorando do nosso laboratório. Para montar o suporte, primeiro use as alavancas para posicionar a base na posição vertical de forma que as alavancas possam inclinar em direção ao usuário.

Em seguida, cubra brevemente a superfície do vidro de 41 milímetros com etanol a 70% e use um pano para remover cuidadosamente o etanol. Insira o vidro na base do suporte e coloque uma lamínula quadrada de 2 milímetros revestida com BSA em cima do vidro. Em seguida, insira o pequeno O-ring na parte inferior do invólucro do wafer e monte o invólucro do wafer na base do suporte, com o orifício elíptico na parte traseira do instrumento.

Puxe o nível interno da base do suporte para a frente para a posição horizontal, para travar o alojamento do wafer no lugar. Use um espanador de ar para soprar quaisquer detritos do interior da carcaça do wafer. Em seguida, adicione 4 mililitros de meio RPMI 1640, complementado com 0,1% BSA, ao alojamento.

Agora, monte o chip do dispositivo de análise de mobilidade celular revestido com BSA no centro do invólucro do wafer com a face estrutural em contato com o vidro e com a marca de posicionamento na parte traseira. Encaixe as duas saliências da junta de borracha nos orifícios para fixar a junta na parte inferior do grampo do wafer e monte o O-ring grande na parte superior do alojamento do wafer. Em seguida, monte o grampo do wafer com o orifício do sensor na parte traseira e puxe a alavanca externa da base do mancal para frente para a posição horizontal para travar o grampo do wafer no lugar.

Quando o suporte estiver montado, coloque a parte inferior do suporte em uma caixa de luz para confirmar se não há bolhas de ar nos poços. Em seguida, remova a tampa, transfira o conjunto para a placa na parte superior da unidade do dispositivo de análise de mobilidade celular e conecte o bloco do sensor ao suporte. Para realizar o ensaio de mobilidade celular, primeiro suspendemos células HL60 diferenciadas em meio RPMI 1640 suplementado com BSA, e uma concentração de duas vezes dez elevado à sexta células por mililitro.

Em seguida, conecte a unidade do dispositivo de análise de mobilidade celular ao computador para a aquisição da imagem e ligue os dois dispositivos. Em seguida, abra o software do dispositivo de análise de mobilidade celular. No painel de controle da imagem da câmera, use as linhas horizontais e verticais para ajustar a posição do suporte em tempo real e centralize o dispositivo no painel de imagem da câmera.

Em seguida, selecione Canal Um para mover a câmera para o canal selecionado e use Mover para a esquerda de Mover para a direita para ajustar a coordenada X da câmera para centralizar o campo de exibição horizontalmente. Para ajustar verticalmente a imagem para o centro da tela, gire o botão de posição no painel frontal do dispositivo de análise de mobilidade celular. No painel de controle do aquecedor, defina a temperatura do suporte para 37 graus Celsius e a temperatura da placa para 39 graus Celsius.

Para controlar a temperatura usando o sensor térmico conectado ao suporte, clique em Aquecer para iniciar o aquecimento e, em seguida, em Suporte. No painel de disparo, insira 15 segundos para o Intervalo e 30 minutos para o Tempo para definir os intervalos e a duração do ensaio de quimiotaxia, respectivamente. Por motivos de segurança, selecione o Aquecedor desligado no final da caixa de disparo.

Em seguida, salve o arquivo, insira as especificidades do experimento no painel de memorandos e confirme se o dispositivo foi centralizado em todos os canais. Agora remova todo o tampão do suporte e oito microlitros de tampão do terceiro poço do topo do primeiro canal. Usando uma seringa, injete dois microlitros de células no segundo poço no mesmo canal, enquanto monitora a tela em tempo real para controlar o número de células e o fluxo durante a injeção.

Quando as células estiverem alinhadas, adicione imediatamente de volta os oito microlitros de tampão ao poço e repita a injeção de células nos canais de dois a seis, como acabamos de demonstrar. Depois que todas as células tiverem sido adicionadas, adicione dois mililitros de tampão de volta ao suporte e adicione um microlitro do quimioatraente ao terceiro poço a partir do topo nos canais apropriados. Por fim, inicie a aquisição da imagem.

Neste experimento representativo, as células HL60 começam a quimiotaxiar em um caminho reto imediatamente após a injeção do quimioatraente e continuaram por todos os 60 minutos do ensaio, de acordo com os resultados da simulação de estabilidade do gradiente. Traçar o caminho de viagem e a morfologia das células permite a medição quantitativa e a subsequente comparação dos comportamentos da quimiotaxia, usando um índice de quimiotaxia que inclui o comprimento total do caminho, direcionalidade, velocidade e redondeza das células. A aplicação de um corante fluorescente, em conjunto com o quimioatraente, permite o estabelecimento de uma relação linear entre a concentração do quimioatraente e a intensidade do corante fluorescente monitorado.

Além disso, em resposta à estimulação quimioatraente aplicada uniformemente, as células HL60 medeiam uma translocação robusta da membrana da proteína quinase GFP tact D1.In um gradiente quimioatraente, as células HL60 recrutam ativamente a quinase para a parte traseira da borda de ataque. Uma vez dominado, esse processo pode ser concluído em 30 minutos se executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante seguir rigorosamente as instruções do fabricante no conjunto do suporte e monitorar a injeção da célula.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da quimiotaxia explorarem a possibilidade de múltiplos ensaios de quimiotaxia, como um dictiotilium de monogenismo ou outros tipos de sistemas de células de mamíferos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar a unidade, realizar ensaios de quimiotaxia simultâneos ou visualizar simultaneamente vários eventos de sinalização em células de quimiotaxia.