Name: In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a rotular a replicação do DNA mitocondrial em ovários adultos de Drosophila usando coloração EdU. Este método preserva a estrutura tecidual e permite visualizar a biogênese mitocondrial durante a oogênese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a K. Delaney pelos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Intramural do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (NHLBI).

1. Tissue Recolha e Dissection <ol><li> Em cada frasco contendo levedura seca, a cultura 10 adultos do sexo feminino voa com 10 homens para 2-3 dias. Nota: Manter as moscas fêmeas bem alimentados irá melhorar a qualidade global eo rendimento da produção de ovário e facilitar a dissecção. </li><li> Anestesiar a fêmea voa em um dióxido de carbono (CO 2) Voa pad. </li><li> Sob o estereoscópio, colocar várias gotas de meio de RT (meio de Drosophila de Schneider suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS)) em uma almofada de dissecação. Realizar todos os procedimentos de dissecação na média a manter os tecidos vivos e saudáveis. </li><li> Agarrar uma fêmea engordados voar com uma pinça fina de nariz nítidas em seu tórax inferior. Use um outro conjunto de pinça para puxar delicadamente na posterior extremo da mosca até que os tecidos do abdômen estão expostos. Retire os dois ovários de outros tecidos (por exemplo, tripas). Nota: cada ovário exibe uma estrutura opaca que é compord de 16-20 ovarioles anexas. </li><li> Para aumentar a penetração de reagentes, abrir os ovários, puxando-os separados e passando as pontas das pinças em cada ovaríolo entre um par de vezes. Manter as ovarioles ligados dentro de um ovário para minimizar a perda de tecidos durante os seguintes procedimentos. </li><li> Transferir os ovários imediatamente para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 ul de meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS. </li><li> Repita a dissecção e recolher 10-15 ovários em cada tubo de microcentrífuga. </li></ol> 2. EdU Labeling <ol><li> Aspirar o meio em cada tubo, e substituir com 500 ul de meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS contendo 7 ^ M de afidicolina. Nota: A afidicolina é utilizado para bloquear a síntese de ADN nuclear através da inibição da polimerase de ADN α sem afectar a replicação do mtDNA 7, 12. É possível aumentar a concentração acima de afidicolinaa 70 uM para conseguir uma melhor inibição. A solução estoque de afidicolina 3-30 mM em DMSO pode ser armazenada no escuro a -20 ° C durante até 6 semanas. </li><li> Para manter os ovários saudável, garantir que eles estão imersos sob soluções ao mudar o meio. Use meio de Drosophila de Schneider com 10% de FBS até a etapa 2.6. </li><li> Incubar ovários durante 3 horas à temperatura ambiente num agitador de bancada com rotação suave. <ol><li> Para o tratamento de drogas, por exemplo, cianeto de desacoplador mitocondrial carbonil fenil-hidrazona 4-trifluorometoxi (FCCP), adicionar a concentração apropriada de droga (por exemplo, 10 uM FCCP) para o meio após 2 horas de tratamento com afidicolina. Continuar a incubação durante mais 1 h. </li></ol></li><li> Remover o meio contendo afidicolina com ou sem fármaco. Resumidamente enxaguar os ovários com meio (afidicolina não é necessário) duas vezes. </li><li> Adicionar 1 ml de meio contendo 10 uM EdU e 7 | iM de afidicolina e continuar incubating à temperatura ambiente durante 2 h. Guardar a solução estoque de 10 mM EdU (em DMSO) a -20 ° C. </li><li> Remova o meio contendo EdU e afidicolina. Lave com meio (sem afidicolina) duas vezes por 3 min cada um. </li></ol> 3. Tissue Fixação e permeabilização <ol><li> Prepara-se uma solução de paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4). Observação: Usamos comercial disponível paraformaldeído armazenado em ampolas pré-marcados. Abra uma nova ampola e diluir a 4% antes da utilização. CUIDADO: O formaldeído é tóxico; que deve ser manuseado em um exaustor com a pele e proteção para os olhos. </li><li> Fix ovários com 4% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente com rotação suave. </li><li> Remover o fixador e lava-se duas vezes ovários em 1 ml de BSA a 3% em PBS durante 5 min de cada vez. </li><li> Para permeabilizar as tecidos, remover a solução de lavagem e adicionar 1 ml de 0,5% de Triton X-100 em PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Remover a solução de permeabilização e lavar duas vezes em 1 mlde 3% de BSA em PBS. </li></ol> 4. Detecção EdU Nota: EdU detecção baseia-se na química &quot;clique&quot;, Cu (I) catalisada por [3 + 2] cicloadição 13, que adiciona as azidas fluorescentes ao grupo alcino terminal da edu, e a molécula fluorescente é submetida a detecção subsequente. Desde Cu (I), o qual é facilmente oxidado para as espécies não catalíticas de Cu (II), é necessária para catalisar a reacção, recomenda-se reduzir o (II) sulfato de Cu in situ para se obter Cu (I). Isto é, Cu sulfato (II) é utilizado na presença de um redutor tal como o ácido ascórbico (aqui o &quot;tampão aditivo&quot;) para gerar cobre (I). <ol><li> Antes do experimento, preparar a solução de trabalho da azida Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 azida, Alexa Fluor 555 azida ou outros, dependendo do fluoróforo preferida, as quais são designadas como &quot;corante azida&quot; daqui em diante), tampão de reacção EdU e tampão EdU aditivo de acordo com o fabricanteinstruções. <ol><li> Reconstituir o corante azida em 70 mL de DMSO. Guardar a solução de trabalho à temperatura de -20 ° C durante até 1 ano. </li><li> Preparar tampão fresco reacção EdU diluindo a EdU tampão 10x reacção com água deionizada. Nota: Após o uso, armazenar qualquer solução 1x restante a 4 ° C. A solução 1x é estável por até 6 meses. </li><li> Faça uma solução 10x estoque do aditivo tampão EdU dissolvendo completamente o pó em 2 mL de água deionizada. Nota: Esta solução é estável durante até 1 ano à temperatura de -20 ° C. Se a solução desenvolve uma cor castanha, que foi degradada e deverá ser descartado. </li></ol></li><li> Prepare o coquetel de reacção EdU fresco de cada vez, e utilizar no prazo de 15 min de preparação. Para obter resultados reprodutíveis, certifique-se os componentes da reacção são mantidas nas mesmas proporções. <ol><li> Adicione fresco 1x tampão EdU solução aditiva por diluição da solução estoque 10x (preparado no passo 4.1.3) 1:10 em água desionizada. Utilize este sOlution no mesmo dia. </li><li> Prepare 1 ml de cocktail EdU reacção através da combinação dos seguintes ingredientes por ordem: 860 ul EdU 1x tampão de reacção, 40 ul de CuSO 4, 2,5 uL de corante de azida, 100 ul de 1x tampão de EdU aditivo. Nota: É importante que os ingredientes são adicionados a fim de assegurar um desempenho óptimo. </li></ol></li><li> Remover o PBS com BSA a 3% e adicionar 0,5 ml do cocktail de reacção EdU a cada tubo. Incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos com rotação suave. Manter as amostras protegidas da luz. </li><li> Remover o cocktail de reacção EdU e lavar uma vez com 1 ml de BSA a 3% em PBS. </li><li> Lavam-se as amostras de uma vez com 1 ml de PBS. </li></ol> 5. Rotulagem de anticorpos Nota: Execute rotulagem de anticorpos após a coloração EdU. Se nenhuma coloração adicional é desejado, pode-se proceder à montagem e de imagem directamente. É importante que as amostras de ser protegida da luz em todos os seguintes procedimentos. <ol><li> Remover a solução de lavagem. Bloquear os ovários em 1 ml de solução de bloqueio contendo 0,2% de BSA e 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 30 min. </li><li> Remover a solução de bloqueio e substituir com anticorpo primário diluído em solução de bloqueio (por exemplo, rato ATP sintase subunidade α anticorpo, diluição 1: 1000). Incubar no escuro a 4 ° CO / N. </li><li> Lavam-se as amostras com 1 ml de solução de bloqueio 3 vezes, 10 min de cada vez. Para minimizar o fundo, lavar mais duas vezes durante 30 minutos cada. Remover a solução de bloqueio. </li><li> Incubar com anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio (por exemplo, anticorpo secundário de cabra anti-rato Alexa Fluor 568, diluição 1: 200) durante 2 horas à TA. Nota: Use uma cor diferente do que acoplado a EdU. </li><li> Repita os passos de lavagem executados no passo 5.3. </li><li> Lavar com 1 ml de PBS uma vez para remover o detergente. </li></ol> 6. Montagem e imagem <ol><li> Remova cuidadosamente todo o PBS e immediately cobrir ovários com 50 ul de meio de montagem (com ou sem DAPI). Nota: Utilizar um meio de montagem que não endurecer enquanto os ovarioles estão a ser separadas umas das outras. Os ovários podem ser armazenadas em meio de montagem, a 4 ° C durante até uma semana. </li><li> Cortar a extremidade de uma ponta de pipeta e usá-lo para transferir ovários cuidadosamente sobre uma lâmina de microscópio. </li><li> Completamente separado cada ovaríolo com uma pinça fina de nariz afiadas sob o microscópio estereoscópico. Remover os tecidos de ligação na extremidade posterior e estágio 14 ou câmaras de ovos maduros. As câmaras de ovo jovens estão na extremidade anterior e transparente. </li><li> Alinhar as câmaras de ovo com uma pinça, para que eles não se sobrepõem uns com os outros. </li><li> Lentamente inferior uma lamela de vidro # 1.5 na parte superior das amostras. Permitir que o meio de montagem para polimerizar durante várias horas à temperatura ambiente. Selo com unha polonês transparente. </li><li> Imagem desliza no dia seguinte, ou armazenar a 4 ° C antes da imagem. </li><li> Visualize sob a mi confocalcroscope com um objetivo de imersão em óleo 63X. Capturar imagens tridimensionais z-pilhas. Nota: Existe uma forte EdU sinalizar na tarde-estágio câmaras de ovos e fluorescência de fundo na bainha epitelial. Ao examinar rotulagem EdU em um germário particular, deve-se evitar germariums que são sobrepostos por ou perto de outros tecidos ou câmaras de ovos em fase posterior. </li></ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Wallace, D. C., Chalkia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+genetics+and+the+heteroplasmy+conundrum+in+evolution+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220(2013).</li>
<li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).</li>
<li>Riechmann, V., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+formation+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Axis formation during Drosophila oogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).</li>
<li>Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+fusome%2C+a+germline-specific+organelle%2C+contains+membrane+skeletal+proteins+and+functions+in+cyst+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation.</a> Development. 120 (4), 947-956 (1994).</li>
<li>Cox, R. T., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balbiani+body+and+the+fusome+mediate+mitochondrial+inheritance+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis.</a> Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).</li>
<li>Davis, A. F., Clayton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+localization+of+mitochondrial+DNA+replication+in+intact+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells.</a> J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).</li>
<li>Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+mitochondrial+genomes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of mitochondrial genomes in human cells.</a> BMC Biol. 2, (2004).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+adult+primate+neocortex%3A+an+evaluation+of+the+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence.</a> Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propagation+of+functional+mitochondrial+DNA+during+oogenesis+restricts+the+transmission+of+a+deleterious+mitochondrial+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant.</a> Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).</li>
<li>Lentz, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+%28mtDNA%29+Biogenesis%3A+Visualization+and+Duel+Incorporation+of+BrdU+and+EdU+Into+Newly+Synthesized+mtDNA+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).</li>
<li>Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28i%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Horwitz, H. B., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+by+ethidium+bromide+of+mitochondrial+DNA+synthesis+in+physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum.</a> J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).</li>
<li>Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+the+biochemistry+of+eucaryotic+DNA+replication+revealed+by+aphidicolin%2C+an+unusual+inhibitor+of+DNA+polymerase+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha.</a> Cell. 23 (3), 647-648 (1981).</li>
<li>McClung, C., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+behavioral+responses+to+free-base+cocaine+and+the+development+of+behavioral+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila.</a> Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).</li>
<li>Moore, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+intoxication+in+Drosophila%3A+Genetic+and+pharmacological+evidence+for+regulation+by+the+cAMP+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway.</a> Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-aminobutyric+acid+B+receptor+1+mediates+behavior-impairing+actions+of+alcohol+in+Drosophila%3A+adult+RNA+interference+and+pharmacological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

EdU rotulagem é um método novo e eficiente para detectar a síntese de DNA em células em proliferação, o que é baseada na incorporação de coloração e de análogos de nucleósidos em ADN recém-sintetizado. Este método é superior para o método de marcação com BrdU na medida em que é mais rápido e altamente sensível. Mais importante, ele permite uma boa preservação estrutural e eficiente penetração EDU-corante de tecidos conjunto de montagem 9, 10. Historicamente, como uma alternativa superior para marcação com BrdU, a rotulagem EdU foi utilizado para estudar a replicação do ADN nuclear durante a fase S do ciclo de célula. A afidicolina é um inibidor de α ADN-polimerase, que é o principal polimerase para a replicação do ADN nuclear em fase S 12 15. replicação mtDNA é realizada por γ ADN-polimerase, que é insensível ao tratamento afidicolina. Assim, o tratamento com afidicolina, antes e durante a incubação EdU inibiu significativamente EdU incorporação no ADN nuclear. Deveria-se notar que a afidicolina possa ser estável durante várias semanas, se apropriadamente armazenada, e a eficácia da afidicolina na inibição da replicação do ADN nuclear foi variável nas nossas mãos. Os ovarioles ou câmaras de ovo com rotulagem DNA nuclear forte devem ser excluídos da análise de novos dados. replicação mtDNA pode ser facilmente visualizado como pontos lacrimais no citoplasma, que também proporciona uma maneira simples para quantificar o nível de replicação do mtDNA por contagem do número de pontos lacrimais EdU, normalizada para o volume total do citoplasma. software de imagem pode ser aplicado para identificar automaticamente EdU pontos lacrimais em imagens microscópicas, o que é especialmente útil para análises computacionais de grandes conjuntos de dados. No entanto, devem ser tomadas precauções, porque a inibição incompleta da replicação do ADN nuclear pode levar à incorporação EdU em loci distintos no cromossoma e exibir como pontos lacrimais dentro do núcleo. Também, em outros casos, a intensidade de incorporação EdU replicando mtDNA pode ser fraca, enquanto o fundo e ruído pode ser alto. Portanto, os parâmetros individuais para análises automáticas de imagem deve ser cuidadosamente definido. Também é recomendado que as imagens devem ser examinadas com os olhos treinados para se certificar de que adequada puncta EdU são identificados. Visualização de mtDNA recém-sintetizado durante Drosophila oogenesis oferece uma oportunidade para investigar como a replicação mtDNA é regulado sob condições fisiológicas ou patológicas, realizando o experimento em moscas sujeitas a uma variedade de perturbações farmacológicas ou genéticas. Em um estudo anterior, ensaio de incorporação EdU foi realizado em uma mtDNA mutante Drosophila mt: CoI T300I 11. Além disso, a perturbar o potencial de membrana mitocondrial, ovários foram tratadas com várias concentrações de FCCP desacoplador mitocondrial ou 2,4-dinitrofenol (DNP), antes da incorporação EdU. Dependendo dos fins experimentaise as características de drogas, pode ser adotado diferentes métodos para a entrega eficaz. Para moscas adultas, as drogas podem ser apresentadas como um vapor (por exemplo, etanol e cocaína) 16,17 drogas ou pode ser injectado no abdómen, onde rapidamente difunde-se por todo o corpo 18. A prática mais comum é que as drogas são adicionados ao alimento ou uma mosca / papel de filtro saturado com a droga sacarose. Por exemplo, o inibidor de montagem de microtúbulos, colchicina, foi alimentada para moscas durante 2-3 dias antes da dissecação do ovário 19. Por isso, é importante para avaliar o método de administração de fármaco e escolher as concentrações apropriadas. Para garantir a imagem de sucesso da replicação do mtDNA em ovários de Drosophila, vários passos críticos devem ser cuidadosamente executado. Acima de tudo, preservar a viabilidade ea saúde dos ovários durante a dissecção e Edu incorporação é essencial (etapas 1 e 2). O meio de Drosophila de Schneider com FBS precisa de ser aquecida até à TAantes de usar. Deve-se minimizar o contato direto entre as câmaras de ovos e ferramentas de dissecação ou pontas de pipeta. Os ovários deve ser imersa a soluções de todos os tempos para evitar a desidratação. O manuseio incorreto dos tecidos podem facilmente levar a desmaiar ou nenhuns sinais fluorescentes. Durante o passo de montagem do tecido, ovarioles devem ser separados uns dos outros e espalhar-se sobre a lâmina de microscópio. Certifique-se as câmaras de ovos não são empilhados em cima uns dos outros. Notamos que as câmaras de ovos para além fase 14 demonstrou pouca incorporação EdU. Além disso, por causa do tamanho grande, as câmaras de ovos fase tardia, muitas vezes fazer com que os vizinhos câmaras de ovos mais jovens a ficar fora de foco. Assim, recomenda-se que as câmaras de fase final de ovo ser descartado. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a rotulagem replicar mtDNA nos ovários adultos Drosophila. Este método permite a simples quantificação de replicação mtDNA sob várias perturbações genéticas e farmacológicas,e será útil para dissecar os mecanismos subjacentes biogênese mitocondrial desenvolvimento e herança mtDNA.

Além do genoma nuclear, cada célula eucariótica também contém milhares de cópias de DNA circular pequena na matriz mitocondrial. Enquanto DNA mitocondrial (mtDNA) codifica subunidades essenciais da cadeia de transporte de electrões, a maioria do proteoma mitocondrial, incluindo todos os factores de replicação e transcrição de mtDNA são codificados pelo genoma nuclear. Em contraste com o genoma nuclear que segue as leis da hereditariedade mendeliana, o genoma mitocondrial animais é herdado exclusivamente através da linhagem materna. Portanto, compreender como mtDNA é proliferaram e transmitida de uma geração para a outra através do oócito feminino é de fundamental importância. No entanto, há um debate contínuo sobre a forma como a replicação mtDNA é regulada na linha germinativa feminina. Além disso, a teoria gargalo mtDNA amplamente aceites para a transmissão de mtDNA sugere que a população de mtDNA em células germinativas primordiais é sub-amostrado a um número relativamente pequeno durang desenvolvimento 1 2. Implica também que a replicação do mtDNA é temporal e espacialmente regulamentado durante oogenesis. Assim, a detecção in situ de replicação mtDNA durante o desenvolvimento da linha germinativa irá facilitar a compreensão do mecanismo de herança mtDNA. Drosophila oogenesis fornece um sistema geneticamente tratável para estudar a replicação mtDNA e transmissão. Em cada um dos dois ovários de Drosophila, existem 16-20 cadeias independentes de câmaras de ovo chamados ovarioles 3, que são as unidades funcionais de produção de ovos (ver Figura 1A). Cada ovaríolo contém uma organização linear progressiva de oogï¿½ese, onde a ponta anterior é composto de uma estrutura chamada germário. O germário é ainda dividido em quatro regiões que contêm as células germinativas em diferentes estágios de desenvolvimento. Na região 1, as células-tronco germinativas passam por divisão assimétrica para produzir células filhas conhecidos como cystoblasts. Região 2a contém os cistoblastos que tenham concluído a sua divisão final. Cistoblastos sofrer quatro rodadas de grupos de 16 Divisão Celular produzindo. As células 16 permanecem ligadas umas às outras por pontes citoplasmáticas chamados canais de anel. Apenas uma das células compromete-se a diferenciação como o oócito, enquanto o outro 15 desenvolver-se como células poliplóides enfermeira. Uma estrutura citoplasmática essencial, conhecido como fusoma, é proposto para facilitar com a formação de canais de anel, determinar a polaridade cisto e a enfermeira interacções célula-oócitos 4,5. Como os cistos avançar para 2b região, as estruturas de quisto abranger toda a largura do germário, e tornar-se mais associado com as células do folículo. As estruturas germário acabar com a região 3 que contém a primeira câmara de ovo brotamento. Subsequentemente, as câmaras de ovo são montados na extremidade posterior da germário, que progridem através do ovaríolo em 14 etapas morfologicamente distintas. O crescimento do oócito depende das células enfermeira, WHproteínas de transporte ich, mRNA e estruturas endomembrane (por exemplo, de Golgi) através dos canais de anel para o oócito. Durante Drosophila oogï¿½ese, verificou-se que uma fracção de mitocôndrias em cada cisto 16 células foram associados com a fusoma, mudou-se através dos canais de anel e foram entregues no único oócito em uma grande massa chamada Balbiani corpo 6. Este fenômeno foi proposta para contribuir para o controle de qualidade de herança mitocondrial através de ovários femininos. Detecção de síntese mtDNA baseia-se na incorporação de precursores de ADN marcados no ADN celular. Tradicionalmente, um análogo de nucleósido de timidina 5-bromo-2&#39;-desoxiuridina (BrdU) foi utilizado para marcar o mtDNA de replicação em células de cultura de tecidos de 7,8. No entanto, a rotulagem BrdU à base de anticorpo apresenta várias limitações, especialmente para a coloração de tecidos whole-mount. Uma grande desvantagem da marcação com BrdU é que requer a desnaturação do ADN para exporo epitopo de BrdU, de modo que pode ser detectada pelo anticorpo anti-BrdU. A amostra tem que ser tratada sob condições de desnaturação duras, tais como produtos químicos (por exemplo, ácido clorídrico ou misturas de metanol e ácido acético), calor, ou digestão com ADNase, o que poderia interromper a estrutura da amostra e complicam o seguinte procedimento de coloração 9, 10. Aqui, uma alternativa timidina análogo 5-etinil-2&#39;-desoxiuridina (EdU) é utilizado para marcar o ADN mitocondrial replicar em ovários adulto de Drosophila. Este método é mais rápido e altamente sensível. EdU é prontamente incorporado no ADN celular durante a replicação do ADN. A detecção que se segue baseia-se numa reacção &quot;clique&quot;, Cu (I) catalisada por reacção covalente entre o grupo alcino terminal e uma azida fluorescente 10. Uma vez que a reacção não requer a desnaturação do espécime, que permite uma boa conservação estrutural. Além disso, o tamanho de um coranteZide só é 1/500 de que uma molécula de anticorpo de 10, o que permite a penetração rápida e eficiente de tecidos conjunto de montagem. Temos utilizado este método para detectar replicação mtDNA durante Drosophila oogenesis e encontrou um padrão espacial marcante na região germário de Drosophila ovário 11, o que nos levou a propor um mecanismo de herança mtDNA seletiva dependentes de replicação. Nós apresentamos aqui um protocolo detalhado sobre rotulagem EdU da replicação do mtDNA em ovários de Drosophila. Para demonstrar a aplicação do protocolo, que também testou a replicação do mtDNA em mtDNA mutante de Drosophila (mt: CoI T300I) 11, bem como com o tratamento de diversas desacopladores mitocondriais, que dissipam o potencial de membrana mitocondrial e, potencialmente, perturbam a replicação do mtDNA.

<table><tbody><tr><td>Schneider' s Drosophila medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Par de Dumont # 5 Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Aphidicolin</td><td>Sigma</td><td>A0781</td><td>Alíquota após dissolução em DMSO. Evite descongelamento e congelamento repetitivos. Proteja da luz. Pode ser usado dentro de 6 semanas após a dissolução.&nbsp;</td></tr>Paraformaldeído <tr><td>de FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr>, ciências <td>15710</td> da <td>microscopia eletrônica</td><td>da categoria do EM de 16%</td> O <td>formaldeído é tóxico; deve ser segurado em uma capa das emanações com proteção da pele e dos olhos.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3190</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imagem</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>EdU, CuSO4, azida Alexa Fluor 488, tampão de reação EdU e aditivo tampão Edu estão incluídos</td></tr><tr><td>Subunidade ATP sintase de camundongo e anticorpo, (15H4C4)</td><td>MitoSciences</td><td>Ab14748</td><td>diluição 1:1,000</td></tr><tr><td>Camundongo Hts anticorpo (clone RC)</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma (DSHB)</td><td>hts RC</td><td>1:1,000 Cabra</td></tr><tr><td>anti-camundongo Alexa Fluor 568 anticorpo secundário</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>diluição 1:200</td></tr><tr><td>Meio de montagem Vectashield com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro, #1.5 22 mm x Lâmina</td> de microscópio <td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td>de 22 mm</tr><tr><td></td><td>Esmalte Fisher Scientific</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Elf</td><td></td><td></td><td>Muitos dos pigmentos usados em esmaltes são fluorescentes e penetram em espécimes. Apenas esmalte transparente deve ser usado.</td></tr></tbody></table>

in situ rotulagem de replicação de dna mitocondrial em drosophila adulto ovários por edu coloração

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

O genoma mitocondrial é herdado exclusivamente pela linha materna. A compreensão de como a mitocôndria e seu genoma são proliferados e transmitidos de uma geração para a próxima através do oócito feminino é de fundamental importância. Por causa da tratabilidade genética e da simplicidade elegante e ordenada pela qual o desenvolvimento do oócito prossegue, a oogênese de Drosophila tornou-se um sistema inestimável para o estudo mitocondrial. Um método de marcação EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina) foi utilizado para detectar a replicação do DNA mitocondrial (mtDNA) em ovários de Drosophila. Este método é superior ao método de marcação BrdU (5-bromo-2'-desoxiuridina), pois permite uma boa preservação estrutural e penetração eficiente de corante fluorescente em tecidos de montagem inteira.
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para rotular o DNA mitocondrial replicante em ovários adultos de Drosophila com EdU. Algumas soluções técnicas são oferecidas para melhorar a viabilidade dos ovários, manter sua saúde durante o preparo e garantir imagens de alta qualidade. A visualização do mtDNA recém-sintetizado nos ovários não apenas revela o impressionante padrão temporal e espacial da replicação do mtDNA por meio da oogênese, mas também permite a quantificação simples da replicação do mtDNA sob várias perturbações genéticas e farmacológicas.

O protocolo acima permite a visualização das estruturas puntiformes associados com mitocôndrias (Figura 1B-C), que indicam a replicação do ADN mitocondrial durante a oogénese Drosophila. O ponto lacrimal EdU localizada com mitocôndrias marcadas por coloração para o ATP sintase subunidade alfa (Figura 2). Os sinais observados foram ausentes nos ovários tratados com brometo de etídio 11, um inibidor de replicação de mtDNA 14, validando que estes pontos lacrimais fato etiqueta replicar mtDNA.Aphidicolin foi usada para inibir a coloração do ADN nuclear, sem afectar a replicação do mtDNA (Figura 2). Sem tratamento afidicolina, sinais Edu intensas rotular os núcleos, e mtDNA puncta quase não foram detectados (Figura 3). No entanto, na presença de afidicolina, a incorporação nuclear foi dramaticamente reduzida e foram observados diversos pontos lacrimais associadas com mitocôndrias. (Figura 1B). No entanto, nomeadamente, a replicação do mtDNA exibido um padrão espacial na germário. Como indicado pelo número de pontos lacrimais EdU, há um nível moderado de replicação mtDNA na região 1 do germário, mas quase sem incorporação EDU nas 2A região (Figura 1C). Como o cisto se move para baixo para 2B região na germário, a replicação é retomada mtDNA e o número de pontos lacrimais EdU no quisto posterior da região 2B foi muito maior do que na região 2A (Figura 1C). Especificamente, a incorporação intensiva EdU foi concentrada em torno dos canais de anel e as estruturas fusoma, como manchado pela hu li tai Shao (HTS) proteína. mtDNA mantidos replicando a um nível elevado na região 3 do germário (Figura 1C) Para demonstrar a associação de especigenes ou tratamento com proliferação mtDNA ic, ovários de Drosophila podem ser submetidos a manipulação genética ou tratamento da toxicodependência. Foram tratados ovários com diferentes concentrações de FCCP, um protonophore mitocondrial clássico, que dissipa o potencial de membrana mitocondrial. Como um controlo, DMSO não tinha efeito na replicação do DNA mitocondrial (Figura 4A). Altas doses de FCCP (10 uM) quase esgotada replicação mtDNA inteiramente todo o germário (Figura 4D). No entanto, menor concentração de FCCP (2 ou 5 uM) teve um impacto menor na replicação do mtDNA na região 1 mas a replicação inibida em regiões 2B e 3 (Figura 4B-C), sugerindo que as regiões 2B e 3 são mais sensíveis à ruptura mitocondrial, ou eles mantêm cinéticas de replicação mais lentas relativos. Os resultados acima indicaram que a replicação do mtDNA está associada com a actividade mitocondrial. Particularmente, diferentes regiões do germário responderam diferentemente às imp mitocondrialairment. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> Figura 1. replicação mtDNA durante Drosophila oogenesis. (A) Diagrama de um ovaríolo Drosophila e uma visão ampliada da germário. O ovaríolo ilustra da esquerda para a direita, anterior para posterior, estádios de desenvolvimento sucessivos de câmaras de ovos. No germário, o fusoma (vermelho), células-tronco germinativas (azul), mitocôndrias (verdes), oócitos futuro (linha tracejada, reconhecido pelo posicionamento, estrutura fusoma e grupamentos mitocondriais), desenvolvimento de cistos (pêssego) e quatro regiões de desenvolvimento são apresentados . (B) z-projecção pilha representativas de um ovaríolo de tipo selvagem marcado por EDU e o anticorpo contra HTS-RC, um marcador para canais circulares e fusoma. Na presença de afidicolina, a EdU foi incorporado no mtDNA (pontas de setas) e núcleos (setas). Barra de escala, 10 | im.(C) vista ampliada de germaria descritas na região encaixotado B. As quatro regiões de desenvolvimento são indicados. Barra de escala, 5 m 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> Figura 2. replicação mtDNA na germário Drosophila visualizados por incorporação EdU com o tratamento afidicolina (A) -. Seção confocal representante de um germário tipo selvagem mostrando EdU incorporação (D) (verde, b), mitocôndrias, marcada pela ATP sintase subunidade alfa coloração (vermelho, C), e os núcleos, marcado com coloração DAPI (azul, D) com pré-incubação com afidicolina inibidor de ADN polimerase-α. (A &amp;# ;-D 39 &#39;) Uma imagem ampliada da área de box em (A) mostrando EdU incorporação (B&#39;), mitocôndria (C &#39;) e núcleos (D&#39;). Na presença de afidicolina, a incorporação nuclear (setas) é reduzido e muitos pontos lacrimais estavam localizados dentro da mitocôndria (pontas de seta). As barras de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> Figura 3. replicação mtDNA quase não é detectado no germário Drosophila sem tratamento afidicolina (A) - (D). Seção confocal representante de um germário tipo selvagem mostrando EdU incorporação (verde), mitocôndrias, marcado porATP sintase coloração subunidade alfa (vermelho), e núcleos, marcado com coloração DAPI (azul) na ausência do inibidor da afidicolina ADN polimerase-α. &#39;Uma imagem ampliada da área de box em (A) mostrando EdU incorporação (B (A&#39;-D)&#39;), mitocôndria (C &#39;) e núcleos (D&#39;). Sem afidicolina, etiqueta sinais intensos Edu núcleos (setas), e mtDNA puncta quase não foram detectadas. As barras de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> Figura 4. mitocondrial desacoplador prejudica a replicação mtDNA. Projectos z-stack representativos mostrando tipo selvagem germário tratado com DMSO(A) ou o desacoplador FCCP mitocondrial em concentrações de 2 uM (B), 5 uM (C), 10 uM (D) durante EdU incorporação. Note-se a marcação auditivos EdU na região 2B tratada com 2 uM FCCP (B), e em ambos 2B região 3 e tratou-se com 5 uM FCCP (descrito em caixas). Quatro regiões de desenvolvimento são mostrados. Flechas, DNA nuclear; pontas de seta, mtDNA. Barra de escala, 10 | im. A figura foi modificada a partir de 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A oogênese de Drosophila continua a ser excepcionalmente útil no estudo da proliferação e herança mitocondrial. Este manuscrito descreve um protocolo detalhado usado para rotular o DNA mitocondrial replicante (mtDNA) em ovários adultos de Drosophila com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), o que facilita a descoberta de mecanismos associados à herança mitocondrial que antes eram discutíveis.

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

O objetivo geral deste experimento é rotular a replicação do DNA mitocondrial em ovários de adultos de drosófila por meio da coloração com EdU. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de mitocôndrias, como o processo de biogênese mitocondrial e a herança do DNA mitocondrial durante o desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é que permite boa preservação da estrutura e eficiente penetração de corantes fluorescentes em tecidos inteiros fixados.Para iniciar o experimento, pegue um frasco com meio de drosófila contendo levedura seca e cultive 10 moscas fêmeas adultas com 10 machos adultos a 25 graus Celsius por dois a três dias. Certifique-se de que as moscas permaneçam bem alimentadas durante toda a incubação. Anestesie as moscas em um suporte com dióxido de carbono e selecione as moscas fêmeas com um pincel.Adicione várias gotas de meio para drosófila em temperatura ambiente, suplementado com 10% de FBS, a uma placa de dissecação e coloque-a sob um microscópio estereoscópico. Usando pinças finas e afiadas, segure uma mosca fêmea engordurada na região inferior do tórax. Mantendo todos os tecidos imersos no meio, com um segundo par de pinças, puxe suavemente a extremidade posterior da mosca até que os tecidos do abdômen sejam expostos.Em seguida, desprenda os dois ovários do intestino circundante e dos tecidos extranhos. Abra os ovários puxando suavemente e exponha os ovárioslos. Para facilitar a penetração dos reagentes, passe as pontas da pinça entre cada ovaríolo várias vezes.Por fim, transfira os ovários para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de meio limpo de drosófila com 10% de FBS. Repita a dissecação para coletar quantos ovários forem desejados, colocando de 10 a 15 em cada tubo microcentrífugo. Para iniciar a marcação, aspire o meio dos tubos contendo os ovários, garantindo que o tecido permaneça imerso na solução durante todo o processo, e substitua-o por 500 microlitros de meio contendo sete micromolares de afidicolina, um agente inibidor da síntese de DNA nuclear.Incube os ovários durante três horas à temperatura ambiente em um agitador de bancada com rotação suave. Se desejar tratamento com fármaco, adicione a concentração apropriada do fármaco escolhido ao meio após duas horas de incubação e, em seguida, permita que a incubação prossiga pelo tempo desejado para o fármaco selecionado. Remova o meio dos ovários e enxágue brevemente com meio de drosófila fresco duas vezes.Adicione um mililitro de meio contendo dez micromolares de EdU e sete micromolares de afidicolina e incube os ovários à temperatura ambiente por duas horas com rotação suave. Por fim, remova o líquido contendo EdU e afidicolina e lave os ovários com meio de drosófila limpo duas vezes, por três minutos cada. Para fixar o tecido, incube primeiro os ovários em paraformaldeído 4% por vinte minutos à temperatura ambiente com rotação suave.Em seguida, remova o fixador e lave o tecido duas vezes em um mililitro de BSA a 3% em PBS, durante cinco minutos cada vez, com rotação. Para permeabilização, remova a solução de lavagem, adicione um mililitro de Triton X-100 a 0,5% em PBS e, então, incube os ovários à temperatura ambiente por vinte minutos com rotação. Por fim, remova a solução e lave o tecido duas vezes em um mililitro de BSA a 3% em PBS.Antes do experimento, prepare e armazene o aditivo do tampão EdU de acordo com as instruções do fabricante. Dissolva completamente o pó do aditivo do tampão EdU em dois mililitros de água desionizada para obter uma solução estoque 10x. Para iniciar a detecção, prepare um tampão de reação EdU fresco diluindo o tampão de reação EdU 10x com água desionizada até obter um mililitro de solução de trabalho 1x, que pode rotular dois tubos de ovários.Prepare 100 microlitros de solução fresca de tampão aditivo de EdU 1x diluindo o estoque 10x na proporção de 1:10 em água desionizada. Prepare um mililitro do coquetel de reação de EdU combinando os reagentes na seguinte ordem: 860 microlitros de tampão de EdU 1x, 40 microlitros de sulfato de cobre, 2,5 microlitros de azida de corante e 100 microlitros de aditivo de tampão de EdU. É importante adicionar os reagentes nesta ordem específica e utilizá-los dentro de 15 minutos após a preparação.Remova a solução de BSA das amostras e adicione 0,5 mililitros do coquetel de reação EdU a cada tubo. Incube as amostras à temperatura ambiente por 30 minutos com rotação suave. Proteja as amostras da luz.Por fim, lave as amostras uma vez com um mililitro de BSA a 3% em PBS e, em seguida, lave uma vez com um mililitro de PBS. Para iniciar a marcação com anticorpos, remova primeiro a solução de lavagem dos ovários e adicione um mililitro de solução bloqueadora contendo BSA a 0,2% e Triton X-100 a 0,1% em PBS. Incube as amostras por 30 minutos à temperatura ambiente com agitação suave, tomando cuidado em cada etapa de marcação para proteger as amostras da luz.Remova a solução bloqueadora. Substitua-a pelo anticorpo primário diluído na solução bloqueadora e incube durante a noite a quatro graus Celsius no escuro. Lave as amostras com um mililitro de solução bloqueadora três vezes, por dez minutos cada, e depois lave mais duas vezes por 30 minutos cada para minimizar a coloração de fundo.Por fim, remova a solução bloqueadora. Em seguida, incube o tecido em 500 microlitros de anticorpo secundário diluído na solução bloqueadora por duas horas, à temperatura ambiente, com agitação. Repita os passos de lavagem usando um mililitro de solução bloqueadora três vezes por 10 minutos e duas vezes por 30 minutos.Por fim, lave o tecido com um mililitro de PBS para remover o detergente. Remova cuidadosamente todo o PBS e cubra imediatamente o tecido com 50 microlitros de meio de montagem. Usando uma pipeta com a ponta cortada, transfira cuidadosamente os ovários para uma lâmina de microscopia.Sob o microscópio estereoscópico e utilizando pinças de ponta fina, separe completamente cada ovaríolo. Remova os tecidos conectivos na extremidade posterior e as câmaras de ovos em estágio 14, ou maduras, deixando as câmaras de ovos jovens e transparentes no interior. Usando a pinça, alinhe cuidadosamente as câmaras de ovos para que não se sobreponham.Abaxe lentamente uma lamínula de vidro número 1,5 sobre as amostras e deixe o meio de montagem polimerizar por várias horas à temperatura ambiente. Sobre as bordas com esmalte transparente e visualize as amostras, ou armazene-as a quatro graus Celsius em condições escuras até o uso. As lâminas podem ser armazenadas por cerca de duas semanas.Visualize as lâminas em um microscópio confocal utilizando uma objetiva de imersão em óleo de 63x e capture imagens tridimensionais em Z-stack do tecido ovariano. Os ovários de drosófila mostrados aqui exibem os estágios típicos e sucessivos de desenvolvimento das câmaras de ovos, de anterior para posterior. As imagens confocais mostram marcação por EdU da estrutura pontuada associada às mitocôndrias, e confirma-se que o EdU foi incorporado ao DNA mitocondrial e aos núcleos durante a oogênese em drosófila.Aqui, a replicação do DNA mitocondrial no germário de drosófila é visualizada pela incorporação de EdU na presença do inibidor da DNA polimerase nuclear, afidicolina. Nessas condições, demonstra-se que a incorporação nuclear de EdU é reduzida, e muitos pontos foram localizados dentro das mitocôndrias. Na ausência do tratamento com afidicolina, a replicação do DNA mitocondrial é detectada em nível muito baixo no germário de drosófila.Uma seção confocal de um germário do tipo selvagem mostra intensa incorporação de EdU nos núcleos, com pontos de DNA mitocondrial mal detectáveis. Quando germários do tipo selvagem são tratados com um desacoplador mitocondrial, FCCP, em concentrações variadas, a replicação do DNA mitocondrial é prejudicada. Isso é confirmado pela redução da marcação com EdU, conforme observado nos tratamentos com dois micromolares, cinco micromolares e 10 micromolares.Após este procedimento, pode-se realizar a quantificação simples da replicação do DNA mitocondrial sob diversas condições genéticas e farmacológicas.

in-situ-labeling-mitochondrial-dna-replication-drosophila-adult

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este protocolo descreve o uso de microinjeção e imagens de alta resolução...

Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

Nós desenvolvemos uma técnica sensível para identificar recém-sintetizado DNA mitocondrial (mtDNA) em células individuais, a fim de estudar a biogênese mtDNA. A técnica combina a incorporação de Edu, juntamente com um sinal de protocolo de amplificação tiramida (TSA) para visualizar a replicação do mtDNA em compartimentos subcelulares dos neurônios.

Visualização de replicação do DNA mitocondrial em células individuais por Edu amplificação de sinal

O cinetocoro é onde o SAC inicia seu sinal de monitoramento da segregação mitótica das cromátides irmãs. Um método é descrito para visualizar o recrutamento e de rotação de uma das proteínas cinetocoro e pela sua coordenação com o movimento cromossoma...

Estudar checkpoint mitótico por Ilustrando comportamento dinâmico cinetocoro Proteína e Movimento de cromossomos em Viver<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões Sincicial

Aqui, descrevemos uma técnica usada para visualizar o DNA genômico em nematóides fixos e intactos. O vídeo inclui um exemplo de protocolo para contar a cromatina em oócitos de C. elegans não fertilizados.

Fixação de etanol e coloração DAPI: um método para visualizar o DNA em C. elegans

A imunocoloração é uma técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células e proteínas dentro dos tecidos. Ao utilizar a sonicação, o protocolo descrito aqui alivia a necessidade de dissecar tecidos de Drosophila melanogaster de embriões e larvas em estágio avançado antes da imunocoloração. Fornecemos uma metodologia eficiente para a imunocoloração de larvas de montagem inteira fixadas em formaldeído.

Facilitou-Sonication Imunofluorescência Coloração de Late-estágio embrionário e larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos<em&gt; In Situ</em

Apresentamos protocolos para coleta, preparação e imagem de oócitos maduros de Drosophila. Esses métodos permitem a visualização do comportamento cromossômico e da montagem e função do fuso durante a meiose.

Técnicas de imagem Prometáfase e Metaphase da meiose I em Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; oócitos

A análise da relação estrutura-função mitocondrial é necessária para uma compreensão completa dos mecanismos regulatórios da funcionalidade mitocondrial. Métodos específicos para estudar a estrutura e função mitocondrial em ovários vivos e fixos de Drosophila são descritos e demonstrados neste artigo.

Estudar mitocondrial estrutura e função em Drosophila ovários

O protocolo descrito de RNA em situ hibridização permite a detecção de RNA em toda Drosophila embriões ou tecidos dissecados. Usando placas de 96 poços da microplaca e amplificação do sinal de tyramide, transcrições podem ser detectadas no throughput, sensibilidade e alta resolução e a um custo relativamente baixo.

Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

Aqui, apresentamos um protocolo para a visualização, detecção, análise e rastreamento do tráfico endógeno de mRNA em câmara de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo usando balizas moleculares, microscopia confocal de disco giratório e análise de código aberto Software.

Visualizando e rastreando mRNAs endógenas em câmaras de ovo de Drosophila melanogaster ao vivo

O objetivo deste protocolo é analisar a divisão celular em tecido intacto por microscopia celular viva e fixa usando espermatocitos meióticos drosophila. O protocolo demonstra como isolar testículos inteiros e intactos das larvas de Drosophila e pupas primitivas, e como processá-los e montá-los para microscopia.

Preparação de Drosophila Larval e Pupal Testes para Análise de Divisão Celular em Tecido Vivo e Intacto

A análise do ciclo celular com 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) e rotulagem phospho-histone H3 (pH3) é um procedimento de várias etapas que pode exigir uma otimização extensiva. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que descreve todas as etapas para este procedimento, incluindo análise de imagens e quantificação para distinguir células em diferentes fases do ciclo celular.

5-Ethynyl-2'-Desoxyuridine/Phospho-Histone H3 Protocolo de rotulagem dupla para análise de progressão do ciclo celular em células-tronco neurais Drosophila

Aprenda a rotular a replicação do DNA mitocondrial em ovários adultos de Drosophila usando coloração EdU. Este método preserva a estrutura tecidual e permite visualizar a biogênese mitocondrial durante a oogênese.

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

Explorar mais vídeos