In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

A oogênese de Drosophila continua a ser excepcionalmente útil no estudo da proliferação e herança mitocondrial. Este manuscrito descreve um protocolo detalhado usado para rotular o DNA mitocondrial replicante (mtDNA) em ovários adultos de Drosophila com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), o que facilita a descoberta de mecanismos associados à herança mitocondrial que antes eram discutíveis.

O objetivo geral deste experimento é rotular a replicação do DNA mitocondrial em ovários adultos de drosófila por coloração EdU. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo mitocondrial, como o processo de biogênese mitocondrial e a herança do DNA mitocondrial durante o desenvolvimento. A principal vantagem desta técnica é que ela permite uma boa preservação da estrutura e penetração eficiente do corante fluorescente em tecidos inteiros ligados.

Para iniciar o experimento, pegue um frasco com meio de drosófila contendo fermento seco e cultive 10 moscas fêmeas adultas com 10 machos adultos a 25 graus Celsius por dois a três dias. Certifique-se de que as moscas permaneçam bem alimentadas durante a incubação. Anestesie as moscas em uma almofada de dióxido de carbono e pegue as moscas fêmeas com um pincel.

Adicione várias gotas de meio drosófila à temperatura ambiente, suplementado com 10% de FBS, a uma almofada de dissecação e coloque-a sob um microscópio estéreo. Usando uma pinça afiada de nariz fino, pegue uma mosca fêmea engordada na parte inferior do tórax. Mantendo todo o tecido imerso no meio, com um segundo par de pinças, puxe suavemente a extremidade posterior da mosca até que os tecidos do abdômen fiquem expostos.

Em seguida, separe os dois ovários do intestino circundante e do tecido estranho. Abra os ovários puxando suavemente e exponha os ovaríolos. Para ajudar na penetração dos reagentes, passe as pontas da pinça entre cada ovaríolo algumas vezes.

Finalmente, transfira os ovários para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de meio drosófila limpo com 10% de FBS. Repita a dissecção para coletar quantos ovários desejar, colocando de 10 a 15 em cada tubo de microcentrífuga. Para começar a rotular, aspire o meio dos tubos contendo os ovários, garantindo que o tecido permaneça imerso sob a solução por toda parte, e substitua-o por 500 microlitros de meio contendo sete afidicolinas micromolares, um agente bloqueador da síntese de DNA nuclear.

Incube os ovários por três horas em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço com rotação suave. Se o tratamento medicamentoso for desejado, adicione a concentração apropriada do medicamento escolhido no meio após duas horas de incubação e, em seguida, permita que a incubação prossiga pelo período de tempo desejado para o medicamento selecionado. Remova o meio dos ovários e enxágue brevemente com meio drosófila fresco duas vezes.

Adicione um mililitro de meio contendo dez EdU micromolares e sete afidicolinas micromolares e incube os ovários em temperatura ambiente por duas horas com rotação suave. Por fim, remova o líquido contendo EdU e afidicolina e lave os ovários com meio drosófila limpo duas vezes por três minutos cada. Para fixar o tecido, primeiro incube os ovários em 4% de paraformaldeído por vinte minutos em temperatura ambiente com rotação suave.

Em seguida, remova o fixador e lave o tecido duas vezes em um mililitro de 3%BSA em PBS, por cinco minutos de cada vez, com rotação. Para permeablização, remova a solução de lavagem, adicione um mililitro de 0,5% Triton X-100 em PBS e, em seguida, incube os ovários em temperatura ambiente por vinte minutos com rotação. Por fim, remova a solução e lave o tecido duas vezes em um mililitro de 3% BSA em PBS.

Antes do experimento, prepare e armazene o aditivo tampão EdU de acordo com as instruções do fabricante. Dissolva totalmente o pó aditivo tampão EdU em dois mililitros de água deionizada para fazer um estoque de 10x. Para iniciar a detecção, prepare o tampão de reação EdU fresco diluindo o tampão de reação EdU 10x com a água ionizada para um mililitro de solução de trabalho 1x, que pode rotular dois tubos de ovários.

Faça 100 microlitros de solução tampão aditiva 1x EdU fresca diluindo o estoque 10x 1:10 em água deionizada. Prepare um mililitro de coquetel de reação EdU combinando os reagentes na seguinte ordem: 860 microlitros 1x tampão EdU, 40 microlitros de sulfato de cobre, 2,5 microlitros de azida corante e 100 microlitros de aditivo tampão EdU. É importante adicionar os reagentes nesta ordem específica e usar dentro de 15 minutos após o preparo.

Remova a solução BSA das amostras e adicione 0,5 mililitros do coquetel de reação EdU a cada tubo. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 30 minutos com uma rotação suave. Proteja as amostras da luz.

Finalmente, lave as amostras uma vez em um mililitro de 3% BSA em PBS e, em seguida, lave uma vez em um mililitro de PBS. Para iniciar a rotulagem de anticorpos, primeiro remova a solução de lavagem dos ovários e adicione um mililitro de solução de bloqueio contendo 0,2% BSA e 0,1% Triton X-100 em PBS. Incube as amostras por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave, tomando cuidado em cada etapa de rotulagem para proteger as amostras da luz.

Remova a solução de bloqueio. Substitua-o por anticorpo primário diluído em solução de bloqueio e incube durante a noite a quatro graus Celsius no escuro. Lave as amostras com um mililitro de solução bloqueadora três vezes, por dez minutos cada, e depois lave mais duas vezes a 30 minutos cada para minimizar a coloração de fundo.

Por fim, remova a solução de bloqueio. Em seguida, incubar o tecido em 500 microlitros de anticorpo secundário diluído em solução bloqueadora por duas horas, à temperatura ambiente, com agitação. Repita as etapas de lavagem usando um mililitro de solução bloqueadora três vezes por 10 minutos e duas vezes por 30 minutos.

Por fim, enxágue o lenço com um mililitro de PBS para remover o detergente. Remova cuidadosamente todo o PBS e cubra imediatamente o tecido com 50 microlitros de meio de montagem. Usando uma pipeta com ponta cortada, transfira cuidadosamente os ovários para uma lâmina de microscópio.

Sob o microscópio estéreo e usando uma pinça de nariz fino, separe completamente cada ovaríolo. Remova os tecidos de conexão na parte posterior e no estágio 14, ou câmaras de ovos maduros, deixando as câmaras de ovos jovens e transparentes no interior. Usando a pinça, alinhe cuidadosamente as câmaras dos ovos para que não se sobreponham.

Abaixe lentamente uma lamínula de cobertura de vidro número 1,5 sobre as amostras e deixe o meio de montagem polimerizar por várias horas em temperatura ambiente. Sele as bordas com esmalte transparente e fotografe as amostras ou armazene-as a quatro graus Celsius em condições escuras até que sejam necessárias. As lâminas podem ser armazenadas por cerca de duas semanas.

Visualize as lâminas sob um microscópio confocal usando uma lente objetiva de imersão em óleo de 63x e capture imagens tridimensionais da pilha Z do tecido ovariano. Os ovaríolos de drosófila mostrados aqui, exibindo os estágios sucessivos típicos de desenvolvimento das câmaras de ovos de anterior para posterior. Imagens confocais mostram coloração EdU da estrutura pontilhada associada às mitocôndrias, e EdU é confirmado como incorporado ao DNA MT e núcleos durante a oogênese da drosófila.

Aqui, a replicação do DNA MT no germário drosophila é visualizada pela incorporação de EdU na presença do inibidor da polimerase do DNA nuclear afidicalina. Nessas condições, a incorporação nuclear de EdU mostra-se reduzida e muitos pontos foram localizados nas mitocôndrias. Na ausência de tratamento com afidicolina, a replicação do DNA MT é detectada em um nível muito baixo no germarium drosófila.

Uma seção confocal de um germário do tipo selvagem mostra intensa incorporação de EdU nos núcleos, com pontos de DNA MT quase indetectáveis. Quando germários do tipo selvagem são tratados com um desacoplador mitocondrial, FCCP, em concentrações variadas, a replicação do DNA MT é prejudicada. Isso é corroborado por uma redução na coloração EdU, como visto nos tratamentos de dois micromolares, cinco micromolares e 10 micromolares.

Seguindo este procedimento, a quantificação simples da replicação do DNA mitocondrial sob várias preparações genéticas e farmacológicas pode ser feita.