Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma análise eletrofisiológica de célula única em uma população definida de neurônios sensoriais em fatias de tecido agudo do órgão vomeronasal de camundongo. Este método pode ajudar a elucidar questões fundamentais na área da quimiossensação, como os mecanismos de detecção de substâncias químicas imperceptíveis. A principal vantagem desta técnica é que, ao realizar registros de neurônios sensoriais em fatias de tecido agudo, essas células podem ser investigadas em seu ambiente nativo.

Para iniciar este procedimento, após sacrificar o animal, remova sua mandíbula inferior inserindo um par de tesouras cirúrgicas grandes na cavidade bucal e corte os ossos da mandíbula e os músculos de cada lado separadamente. Em seguida, remova a pele da maxila superior e ao redor da ponta do nariz com pinça média, para obter melhor acesso aos incisivos. Depois, use a tesoura óssea para cortar a maior parte dos incisivos em um ângulo de 45 graus na direção rostral, facilitando a remoção da cápsula do VNO da cavidade nasal.

Não corte a raiz do dente para evitar danos à ponta da cápsula do VNO. Em seguida, segure o palato superior rígido em sua parte rostral com uma pinça média e retire cuidadosamente em uma única peça, em um ângulo plano. Enxágue repetidamente a cavidade nasal com a solução S2 gelada. Em seguida, use tesoura microcirúrgica de mola para cortar a efusão óssea entre a ponta do osso vômer e a mandíbula.

Insira as pontas da tesoura com a parte curva voltada para longe do órgão vomeronasal. E corte cuidadosamente o osso em pequenos passos em ambos os lados esquerdo e direito, lateralmente à cápsula do órgão vomeronasal. Para remover a cápsula do órgão vomeronasal, corte o osso vômer na parte caudal e levante cuidadosamente o osso vômer para fora da cavidade nasal utilizando pinça média.

Transfira imediatamente o órgão vomeronasal (VNO) para uma pequena placa de Petri sob um microscópio estereoscópico sobre uma bolsa de gelo, onde os passos restantes da dissecação devem ser realizados. Em seguida, lave o VNO com uma pequena quantidade de S2 gelado para evitar que o tecido seque. Depois, separe as cápsulas cartilaginosas que contêm os tecidos moles do VNO segurando a parte posterior do osso vomer com pinça de força média.

Para isso, posicione a cápsula em vista dorsal de modo que uma fissura entre os dois VNOs fique visível. Use a ponta de uma pinça fina para separar ambas as cápsulas cartilaginosas dos VNOs do osso central, mantendo o osso vômer fixo na parte traseira. Certifique-se de que a parede cartilaginosa medial, anteriormente ligada ao osso vômer, seja removida.

Ao remover a cartilagem ao redor do VNO, use a pinça apenas na borda da cápsula cartilaginosa. E tenha muito cuidado para não danificar o epitélio sensorial delicado. Para remover a cartilagem remanescente, vire o VNO com seu lado lateral curvo voltado para o fundo do recipiente e fixe firmemente a cartilagem em um dos lados usando a pinça.

Em seguida, mova cuidadosamente a segunda pinça fina a partir do lado posterior, em um ângulo muito rasante entre a cartilagem e o órgão vomeronasal (VNO), para soltar a conexão entre o tecido e a cartilagem. Para evitar danificar o epitélio sensorial, desprenda lentamente o VNO da cartilagem segurando-o pela sua extremidade caudal. Uma vez que o VNO tenha sido separado da cápsula, remova todas as pequenas partes restantes de cartilagem, pois quaisquer fragmentos remanescentes de cartilagem farão com que o tecido se desprenda do agarose circundante durante o processo de corte em fatias.

Em seguida, coloque uma pequena gota de S2 gelada sobre o primeiro VNO dissecado para prevenir danos teciduais. Para incorporar os VNOs, encha ambos os pequenos recipientes de Petri até a borda com S3 derretido. Depois disso, imerja cada VNO em agarose e mova-o horizontalmente para frente e para trás várias vezes para remover a película de solução extracelular, bem como quaisquer bolhas de ar de sua superfície. Posicione o VNO verticalmente, com a ponta rostral voltada para o fundo do recipiente.

Posteriormente, coloque ambos os recipientes sobre uma bolsa de gelo, e aguarde até que a agarose tenha solidificado. Não altere a orientação do órgão vomeronasal uma vez que a agarose tenha começado a solidificar, pois isso fará com que o tecido se desprenda da agarose ao redor. Neste procedimento, utilize uma espátula pequena para remover o bloco de agarose do recipiente pequeno para a tampa de uma placa de Petri grande, e vire a agarose de cabeça para baixo, deixando a ponta rostral do órgão vomeronasal voltada para cima.

Em seguida, corte o bloco em formato piramidal usando um bisturi cirúrgico, tomando cuidado para não danificar o tecido embutido. Depois, use cola instantânea para fixar o bloco em forma de pirâmide ao centro da placa do espécime do vibrátomo. Aguarde cerca de um minuto para que a cola seque completamente.

Corte o espécime em seções com espessura de 150 a 200 micrômetros. Inspecione brevemente a morfologia das seções ao microscópio estereoscópico. Em seguida, transfira todas as seções para a câmara de oxigenação até o uso.

Nesta etapa, transfira uma fatia de VNO para a câmara de imagem e fixe a posição da fatia usando um suporte de aço inoxidável com fios sintéticos de diâmetro de um milímetro. Não cubra a fatia de tecido com nenhum dos fios sintéticos. Em seguida, transfira a câmara de imagem para o sistema de gravação e suprafaça continuamente a fatia com S2 oxigenado à temperatura ambiente.

Ajuste a pipeta de sucção até a superfície da solução para criar uma troca constante da solução de banho. Em seguida, posicione o lápis de perfusão multibocal de oito em um acima e próximo à parte não sensorial da fatia do órgão vomeronasal que contém o vaso sanguíneo. Posteriormente, conecte o eletrodo de referência à solução de banho utilizando a ponte de ágar em formato de L preenchida com cloreto de potássio 150 milimolar.

Posteriormente, preencha a pipeta de registro com a solução de pipeta S4. Monte a pipeta sobre o eletrodo revestido com cloreto de prata conectado ao estágio de cabeçote sem remover o revestimento e fixe firmemente. Em seguida, aplique uma leve pressão positiva à pipeta de registro antes de inseri-la no banho. Monitore a pipeta e certifique-se de que sua resistência esteja entre quatro megaohms e 10 megaohms.

Visualize o corte do órgão vomeronasal com uma câmera CCD usando DIC otimizado para infravermelho e identifique células que expressam FPR-rs3 i-Venus ou neurônios rotulados de maneira semelhante utilizando iluminação de fluorescência e um cubo de filtro apropriado. Aproxime-se do corpo celular usando rodas manuais para máxima sensibilidade. Devido à pressão positiva, uma pequena reentrância na membrana do soma celular torna-se visível assim que a ponta da pipeta estiver em proximidade próxima.

Em seguida, libere a pressão positiva e aplique uma leve pressão negativa para aspirar a membrana celular, a fim de obter um selamento de alta resistência de um a 20 gigaohms. Posteriormente, aplique sucção suave e breve para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de célula inteira. Nesta figura, uma imagem confocal de um corte coronal de tecido do órgão vomeronasal mostra a distribuição de neurônios fluorescentes positivos para FPR-rs3 Tau Venus no epitélio sensorial vomeronasal.

Os neurônios positivos para FPR-rs3 Tau Venus exibem um único dendrito apical que termina em uma estrutura semelhante a um botão na borda luminar. E aqui são mostrados os registros de grampo de célula inteira realizados no soma do VSN. Abaixo estão traçados representativos de grampo de célula inteira de uma corrente de sódio rápida e ativável, sensível à TTX, em VSNs positivos para FPR-rs3.

As gravações com degrau de tensão em condições de controle revelam uma corrente interna rápida e transitória dependente da tensão. O tratamento com TTX a um micromolar reduz fortemente a corrente. E o traçado subtraído digitalmente mostrado aqui revela a corrente de sódio sensível ao TTX e regulada por voltagem.

Os traços representativos do clamp de corrente mostram despolarização e hiperpolarização, bem como trens de potenciais de ação gerados por injeção escalonada de corrente positiva e negativa. Uma vez dominado, todo o processo de dissecção e corte de tecido pode ser realizado em aproximadamente uma hora para ambos os VNOs. Após este procedimento, outros métodos, como gravações por patch solto extracelular ou imagem de cálcio, podem ser realizados para aumentar a produtividade ao analisar populações maiores de neurônios.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar fatias agudas de tecido do órgão vomeronasal da boca e como realizar gravações eletrofisiológicas em nível de única célula de neurônios sensoriais vomeronasais.