Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

O objetivo geral deste procedimento é realizar a análise eletrofisiológica de uma única célula de uma população definida de neurônios sensoriais em fatias de tecido agudo do órgão vomeronasal de camundongo. Este método pode ajudar a elucidar questões-chave no campo da quimiossensação, como os mecanismos de detecção química see-no. A principal vantagem dessa técnica é que, ao registrar neurônios sensoriais em fatias de tecido agudas, essas células podem ser investigadas em seu ambiente nativo.

Para iniciar este procedimento, depois de sacrificar o animal, remova sua mandíbula inferior, inserindo uma tesoura cirúrgica grande na cavidade bucal e corte os ossos da mandíbula e os músculos de cada lado separadamente. Em seguida, remova a pele da mandíbula superior e ao redor da ponta do nariz com uma pinça média, para obter melhor acesso aos incisivos. Em seguida, use a tesoura de osso para cortar a maior parte dos incisivos em um ângulo de 45 graus na direção rostral para facilitar a remoção da cápsula VNO da cavidade nasal.

Não corte a raiz do dente para evitar danos à ponta da cápsula VNO. Depois disso, pegue o palato superior rígido em sua parte rostral com uma pinça média e retire cuidadosamente em uma peça em um ângulo plano. Enxágue repetidamente a cavidade naval com a solução gelada S2. Em seguida, use uma tesoura de micromola para cortar o derrame ósseo entre a ponta do osso vômer e a mandíbula.

Insira as pontas da tesoura com a parte curva apontando para longe do VNO. E corte cuidadosamente o osso em pequenos passos no lado esquerdo e direito, lateral à cápsula VNO. Para remover a cápsula VNO, corte o osso vômer na parte caudal e levante cuidadosamente o osso vômer para fora da cavidade nasal usando uma pinça média.

Transfira imediatamente o VNO para uma pequena placa de Petri sob um microscópio estéreo em uma bolsa de gel de gelo, onde as etapas restantes da dissecção devem ser realizadas. Em seguida, enxágue o VNO em uma pequena quantidade de S2 gelado, para evitar que o tecido seque. Em seguida, separe as cápsulas cartilaginosas que contêm os tecidos moles do VNO agarrando a parte de trás do osso vômer com uma pinça média.

Para isso, posicione a cápsula para uma vista dorsal de modo que uma divisão entre os dois VNOs se torne visível. Use a ponta de uma pinça fina para separar ambas as cápsulas de VNO da cartilagem do osso central, mantendo o osso vômer preso na parte traseira. Certifique-se de que a parede da cartilagem medial que estava anteriormente presa ao osso vômer seja removida.

Ao remover a cartilagem ao redor do VNO, use uma pinça apenas na borda da cápsula da cartilagem. E tenha muito cuidado para não danificar o delicado epitélio sensorial. Para remover a cartilagem restante, gire o VNO com o lado lateral curvo para o fundo do prato e prenda firmemente a cartilagem de um lado usando uma pinça.

Em seguida, mova cuidadosamente a segunda pinça fina da parte de trás em um ângulo muito plano entre a cartilagem e o VNO para afrouxar a conexão entre o tecido e a cartilagem. Para evitar danificar o epitélio sensorial, retire lentamente o VNO da cartilagem, segurando-o em sua ponta caudal. Uma vez que o VNO é alavancado da cápsula, remova todas as pequenas partes de cartilagem restantes, pois quaisquer pedaços restantes de cartilagem separarão o tecido da agarose circundante durante o processo de corte.

Em seguida, coloque uma pequena gota de S2 gelado no primeiro VNO dissecado para evitar danos aos tecidos. Para incorporar os VNOs, encha as duas placas de Petri pequenas até a borda com S3 derretido. Depois disso, mergulhe cada VNO em agarose e mova-o horizontalmente para frente e para trás várias vezes para remover o filme de solução extracelular, bem como quaisquer bolhas de ar de sua superfície. Posicione o VNO verticalmente, com a ponta rostral voltada para o fundo do prato.

Em seguida, coloque os dois pratos em uma bolsa de gelo de gel e espere até que a agarose solidifique. Não altere a orientação do VNO quando a agarose começar a se solidificar, pois isso separará o tecido da agarose circundante. Neste procedimento, use uma pequena espátula para remover o bloco de agarose do prato pequeno para a tampa de uma placa de Petri grande e vire a agarose de cabeça para baixo, deixando a ponta rostral do VNO voltada para cima.

Em seguida, corte o bloco em forma piramidal usando um bisturi cirúrgico e tome cuidado para não danificar o tecido embutido. Em seguida, use super cola para fixar o bloco em forma de pirâmide no centro da placa de amostra de vibratomo. E espere cerca de um minuto para que a cola seque completamente.

Corte a amostra em seções de 150 a 200 micrômetros de espessura. Inspecione brevemente a morfologia do corte sob o microscópio de dissecação. Em seguida, transfira todas as fatias para a câmara de oxigenação até o uso.

Nesta etapa, transfira uma fatia VNO para a câmara de imagem e fixe a posição da fatia usando uma âncora de aço inoxidável conectada com fibras sintéticas de ponta de um milômetro de espessura. Não cubra a fatia de tecido com nenhum dos fios de fibra sintética. Em seguida, transfira a câmara de imagem para a configuração de gravação e superfunda continuamente a fatia com S2 oxigenado à temperatura ambiente.

Ajuste o capilar de sucção à superfície da solução para criar uma troca constante de solução de banho. Em seguida, ajuste o lápis de profusão de oito em um barril múltiplo acima e perto da parte não sensorial da fatia VNO que contém o vaso sanguíneo. Em seguida, conecte o eletrodo de referência e a solução do banho usando a ponte de ágar em forma de L preenchida com cloreto de potássio 150 milimolar.

Em seguida, encha a pipeta de remendo com a solução de pipeta S4. Monte a pipeta sobre o eletrodo revestido de cloreto de prata conectado ao estágio principal sem raspar o revestimento e prenda firmemente. Em seguida, aplique uma leve pressão positiva na pipeta antes de entrar no banho. Monitore a pipeta e certifique-se de que ela esteja entre quatro megaohms e 10 megaohms.

Visualize a fatia VNO com uma câmera CCD usando DIC otimizado para infravermelho e identifique células que expressam FPR-rs3 i-Vênus ou neurônios marcados de forma semelhante usando iluminação de florescência e um cubo de filtro apropriado. Aproxime-se do corpo da célula usando volantes para obter a máxima sensibilidade. Devido à pressão positiva, um pequeno amassado na membrana do soma celular torna-se visível quando a ponta da pipeta está próxima.

Em seguida, libere a pressão positiva e aplique uma leve pressão negativa para sugar a membrana celular, a fim de obter uma vedação de alta resistência de um a 20 gigaohms. Em seguida, aplique uma sucção curta e suave para romper a membrana celular e estabelecer toda a configuração celular. Nesta figura, uma imagem confocal de uma fatia de tecido VNO coronal mostra a distribuição de neurônios positivos fluorescentes FPR-rs3 Tau Venus no epitélio sensorial vomeronasal.

Os neurônios positivos FPR-rs3 Tau Venus exibem um único dendrito apical terminando em uma estrutura semelhante a um botão na borda luminal. E aqui são mostradas as gravações de grampos de patch de células inteiras realizadas a partir do soma VSN. Aqui estão os traços representativos de gravações de patch clamp por atacado de uma corrente de sódio de ativação rápida sensível TTX e VSNs positivos FPR-rs3.

Os registros de passos de tensão sob condições de controle revelam uma corrente interna rápida e transitória dependente da tensão. O tratamento com TTX em um micromolar diminui fortemente a corrente. E o traço subtraído digitalmente mostrado aqui revela a corrente de sódio dependente de tensão sensível TTX.

Os traços representativos da pinça de corrente mostram despolarização e hiperpolarização e trens de potenciais de ação gerados na injeção de corrente positiva e negativa passo a passo. Uma vez dominado, todo o processo de dissecção e fatiamento de tecido pode ser feito em aproximadamente uma hora para ambos os VNOs. Após este procedimento, outros métodos, como registros extracelulares de manchas soltas ou imagens de cálcio, podem ser realizados para aumentar o rendimento ao analisar populações maiores de neurônios.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer fatias de tecido agudo do órgão vomeronasal da boca e como realizar registros eletrofisiológicos de célula única a partir de neurônios sensoriais vomeronais.