Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled
9 de dezembro de 2016
Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.
O objetivo geral deste Protocolo de Captura de Afinidade é isolar complexos proteicos endógenos de células de mamíferos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular e molecular, como quais proteínas se formam juntas em módulos funcionais fisicamente ligados. A principal vantagem desta técnica é que inúmeras interações físicas associadas à proteína alvo de interesse podem ser observadas simultaneamente.
Cultive de um a oito gramas de células, conforme descrito no protocolo de texto. Despeje o meio de crescimento em um béquer grande. Em seguida, coloque o prato de cultura no gelo em uma grande panela retangular.
Adicione 20 mililitros de solução salina tamponada com fosfato 1x gelada, ou PBS, à placa de cultura e libere as células da placa usando um raspador de células grandes. Transfira as células para um tubo de 50 mililitros pré-resfriado com gelo. Adicione mais 10 mililitros de 1x PBS gelado ao mesmo prato.
Recolha as células restantes e transfira-as para o tubo de 50 mililitros. Repita esse processo para cada prato. Suspensões celulares de diferentes pratos podem ser combinadas para reduzir o número de amostras e o desperdício de plástico.
Em seguida, centrifugue as amostras por cinco minutos a 1.000 x g em quatro graus Celsius. Após a centrifugação, despeje cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda cada pellet em dez mililitros de 1x PBS gelado.
Consolide os pellets ressuspensos em até cinco por tubo de 50 mililitros. Lave os tubos vazios com 10 mililitros de PBS. Adicione a solução às amostras consolidadas e centrifugue como antes.
Depois de remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de 1x PBS gelado. Retire o êmbolo de uma seringa de 20 mililitros e reserve. Tampe o bico da seringa, coloque a seringa dentro de um tubo de 50 mililitros e transfira a suspensão celular para lá.
Centrifugue por cinco minutos a 1000 x g, quatro graus Celsius. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de ponta fina ligada a um sistema de armadilha de vácuo até que a camada superior das células comece a ser aspirada. Isso resulta em um pellet de célula úmida.
Destampe a seringa, insira o êmbolo e pingue as células diretamente em um grande copo de plástico cheio de nitrogênio líquido mantido em um banho de nitrogênio líquido em uma caixa de isopor. Mergulhe à força as células restantes da seringa. Em seguida, despeje as células congeladas em tubos de 50 mililitros.
Tampe frouxamente os tubos para permitir que o excesso de nitrogênio líquido evapore. Segure-os durante a noite a 80 graus Celsius. Aperte totalmente as tampas no dia seguinte.
As células congeladas podem ser armazenadas dessa maneira a 80 graus Celsius até a criomoagem. Remova as esferas das células do freezer de 80 graus Celsius e coloque-as em um suporte de tubo de 50 mililitros em um banho de nitrogênio líquido. Pré-resfrie um frasco de 50 mililitros, duas bolas de 20 milímetros e a tampa do frasco em um balde de gelo retangular limpo contendo nitrogênio líquido.
Além disso, pré-resfrie um isolador de PTFE. Use um conjunto de discos ou uma manga e disco. Defina o contrapeso apropriado no moinho.
Usando uma pinça, coloque as duas esferas de fresagem pré-resfriadas de 20 milímetros e as células congeladas dentro do frasco de fresagem pré-resfriado. Adicione nitrogênio líquido ao frasco até a metade, coloque a tampa no frasco e transfira o conjunto para o moinho. Prenda o conjunto no lugar e execute três ciclos de fresagem, usando um programa de 400 rpm, três minutos, rotação reversa a cada minuto e sem quebra de intervalo.
É fundamental ouvir as bolas chacoalhando durante a moagem, isso indica que as bolas estão colidindo e pulverizando o material. Deixar de ouvir esse som significa que a fresagem não está ocorrendo. Após a conclusão de três ciclos de moagem, mova o frasco de volta para nitrogênio líquido e deixe-o descansar momentaneamente para esfriar.
Remova a tampa com cuidado. Remova as bolas usando uma pinça e transfira o pó para um tubo pré-resfriado de 50 mililitros usando uma espátula pré-resfriada. Observe que adicionar nitrogênio líquido ao frasco pode ajudar a desalojar o pó que está endurecido nas bolas.
Para a preparação do extrato celular, pesar 100 miligramas de pó celular em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado de 1,5 ou dois mililitros. Tara uma balança analítica com o tubo de microcentrífugas vazio. Dispense o pó celular no tubo usando uma colher ou espátula resfriada com nitrogênio líquido.
Verificar a massa do pó dispensado no tubo da balança analítica antes de voltar a colocar o tubo em nitrogénio líquido. Abra o tubo com pó de célula e deixe-o repousar em temperatura ambiente por um minuto para liberar a pressão dentro do tubo e evitar o congelamento imediato do tampão de extração quando adicionado ao pó. Adicione 400 microlitros de extrator, suplementado com inibidores de protease ao tubo.
Vortex o tubo brevemente e depois segure no gelo. Use um ultrassônico de microponta para dar à amostra um breve pulso de baixa energia e dispersar quaisquer agregados. Clarificar o extracto por centrifugação.
Por fim, remova o sobrenadante e prossiga para a captura de afinidade. Para pré-lavar o meio de afinidade, coloque os tubos contendo esferas paramagnéticas acopladas a anticorpos no ímã. As esferas se acumularão na lateral do tubo em segundos, permitindo que a solução de armazenamento seja removida.
Em seguida, adicione 500 microlitros de tampão de extração às contas. Brevemente vórtice em velocidade média para misturar. Além disso, gire os tubos em uma mini centrífuga para coletar todo o conteúdo para o fundo do tubo.
Em seguida, coloque os tubos no ímã e aspire a solução. Inicie a captura de afinidade transferindo brevemente o extrato de células clarificadas para os tubos contendo meio de afinidade pré-lavado e vórtice. Incube os tubos por 30 minutos a quatro graus Celsius com mistura suave contínua em uma roda rotadora.
As esferas devem permanecer suspensas durante toda a incubação. Aspirar o sobrenadante e lavar as esferas três vezes com um mililitro de tampão de extracção a frio. Para eluir as proteínas, adicione tampão de amostra de página SDS sem agente redutor, para mitigar a liberação de cadeias de anticorpos das contas.
Incube por cinco a dez minutos em temperatura ambiente com agitação. Colete e salve o sobrenadante e, em seguida, submeta as amostras à página SDS, seguida de coloração de proteínas usando técnicas padrão. Podem ser excisadas bandas de proteínas individuais para identificação, ou toda a amostra pode ser caracterizada numa única análise por electroforese da amostra apenas brevemente.
O material que compreende o meio insolúvel usado para a captura de afinidade pode afetar o proteoma recuperado. Aqui são mostradas contas magnéticas, acarose impregnada de ferro e agarose tradicional. Cada meio foi acoplado a anticorpos anti-FLAG M2 e usado para capturar fosfatase alcalina bacteriana marcada com FLAG enriquecida em extratos produzidos a partir de células HEK 293 criomoizadas.
As esferas magnéticas em escala de mícron mostraram o perfil mais limpo, indicando um nível relativamente baixo de adsorção de proteínas não específicas. O método de lise celular também pode afetar o proteoma recuperado. Aqui, um complexo proteico endógeno foi submetido à captura de afinidade de extratos de células criomoteladas ou sonicadas.
Menos contaminantes de alta massa foram observados quando o extrato celular foi produzido a partir de pó de célula criomolado. Embora os meios magnéticos possam exibir um fundo mais baixo do que outros meios, o próprio anticorpo pode facilitar a adsorção de contaminação por falsos positivos, especialmente na ausência de seu antígeno alvo. Para determinar a ligação de fundo contribuída pelo meio magnético anti-FLAG quando os paratopos de anticorpos estão ou não ocupados, experimentos de captura de afinidade simulada foram conduzidos usando extratos de células HEK 293T na presença ou ausência de um pico de peptídeo 3x FLAG.
Na ausência de seu epítopo cognato, o meio alfa FLAG captura um nível detectável de proteínas de fundo que podem ser iludidas competitivamente com o peptídeo 3x FLAG e iludidas em maior extensão pelo buffer de amostra de página SDS. Uma espécie contaminante dominante foi observada entre 37 e 50 kilodaltons. Na presença de um epítopo concorrente, as eluições baseadas em 3x FLAG e SDS são comparativamente livres de ligação às proteínas de fundo.
Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar com cuidado, rapidez e precisão. Acompanhe seus procedimentos e quaisquer variações observadas para saber quais etapas são mais críticas para seus resultados. Seguindo este procedimento, outros métodos, como espectrometria de massa, centrifugação zonal e microscopia eletrônica, podem ser realizados para analisar a composição da mistura, seu nível de homogeneidade e o tamanho e a forma dos complexos macromoleculares constituintes.
Após seu desenvolvimento, a captura de afinidade abriu caminho para pesquisadores no campo da proteômica explorarem as composições de complexos fisiológicos de proteínas em detalhes incomparáveis, o que continua sendo um esforço de pesquisa global em andamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar células de mamíferos para criomoagem e como executar a captura de afinidade de uma proteína de interesse.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a desagregação de células de mamíferos utilizando moagem no estado sólido a temperaturas criogênicas. O processo inclui a produção de um extrato celular e o isolamento de complexos proteicos por captura de afinidade com esferas paramagnéticas acopladas a anticorpos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Biologia Molecular
- Química de Proteínas
Contexto
- Compreender as interações proteicas é fundamental na biologia celular e molecular.
- Técnicas de captura por afinidade permitem a observação simultânea de múltiplas interações proteicas.
- A moagem no estado sólido em temperaturas criogênicas aumenta a eficiência da ruptura celular.
- Este método pode facilitar o estudo de complexos proteicos em células de mamíferos.
Objetivo do Estudo
- Isolar complexos proteicos endógenos de células de mamíferos.
- Fornecer um método confiável para estudar interações proteicas.
- Melhorar a eficiência das técnicas de isolamento de complexos proteicos.
Métodos Utilizados
- Cultivo celular e colheita utilizando PBS frio a 4 °C.
- Moinho criogênico de células para produzir um pó fino.
- Preparação de extratos celulares com inibidores de protease.
- Captura por afinidade utilizando esferas paramagnéticas conjugadas com anticorpos.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de complexos proteicos a partir de células de mamíferos rompidas.
- Eficiência demonstrada da moagem criogênica no rompimento celular.
- Uso eficaz da captura por afinidade para análise de complexos proteicos.
- Reprodutibilidade dos resultados em múltiplas tentativas.
Conclusões
- O protocolo descrito é uma ferramenta valiosa para o estudo de interações proteicas.
- A moagem no estado sólido a temperaturas criogênicas aumenta significativamente a ruptura celular.
- Este método pode ser aplicado a diversas questões de pesquisa em biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite que equipes de P&D de biofármacos isolam complexos proteicos endógenos de células de mamíferos utilizando pó celular criomoido e esferas paramagnéticas acopladas a anticorpos, auxiliando na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Ao preservar interações proteicas nativas e reduzir a ligação não específica, o método aumenta a confiança preditiva dos dados de interação proteína-proteína, orientando decisões de identificação de compostos líderes e triagem de portfólios. A abordagem resolve um desafio fundamental na fase de descoberta: obter perfis reprodutíveis do interatoma com relevância fisiológica, reduzindo o risco biológico no desenvolvimento terapêutico subsequente.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar módulos funcionais fisicamente ligados de proteínas-alvo.
- Valor Operacional: Reduz a dissociação de macromoléculas e a degradação enzimática durante o preparo do extrato, melhorando a integridade dos complexos.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da captura fiel de complexos endógenos, minimizando falsos positivos no mapeamento de interações.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz extratos celulares clarificados adequados para ensaios baseados em afinidade e triagem de interações.
- Valor Operacional: Utiliza esferas magnéticas em escala micrométrica que eliminam limites de exclusão por tamanho e permitem separação magnética rápida, aumentando a produtividade.
- Prontidão para Ensaios: Fornece proteomas de baixo fundo quando combinado com criomoagem, melhorando a relação sinal-ruído em campanhas de triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a composição nativa do complexo desde a descoberta até a validação pré-clínica, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a comparação de métodos de lise (por exemplo, criomoinho versus sonicação) para avaliar o impacto nos perfis de contaminantes e na homogeneidade do complexo.
- Avanço Ajustado ao Risco: Facilita decisões de prosseguimento ou interrupção ao quantificar a ligação de fundo por meio de experimentos de captação simulada com adição de peptídeos marcadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde o engajamento inicial do alvo até a otimização do composto líder, onde o isolamento confiável de complexos fornece subsídios para a compreensão mecanicista e o desenho de ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar complexos endógenos para análises adicionais.
- Triagem: Gera extratos reprodutíveis com concentração proteica consistente, permitindo avaliação confiável de compostos em ensaios de interação.
- Análises: Fornece resultados quantitativos compatíveis com espectrometria de massa, centrifugação em gradiente de velocidade e eletroforese para caracterização de complexos.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de interação da fase de descoberta à continuidade pré-clínica por meio de complexos mantidos em seu estado nativo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e escalável para análise de interatoma, aplicável a múltiplos alvos e projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em redes de interação proteica.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio do manuseio de pós criomoidos e manipulação de microesferas magnéticas.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em alvos, reduzindo falhas em estágios avançados devido a pressupostos biológicos incorretos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer perfis comparáveis de interação entre diferentes métodos de lise e tipos de microesferas.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em manipulação criogênica, ruptura celular e técnicas de captura por afinidade.
- Depende do acesso a equipamentos de criomoinho, infraestrutura de nitrogênio líquido e ferramentas de separação magnética.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de preparação de extratos e lavagem de microesferas para garantir reprodutibilidade.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o método para diferentes linhagens celulares de mamíferos ou fontes de tecidos.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de monitorar a colisão das bolas durante a moagem e evitar o congelamento prematuro do tampão de extração.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:30
Cell Harvesting and Freezing
3:09
Cryogenic Disruption of Frozen Cells
4:50
Affinity Capture of Protein Complexes from Cell Extracts
6:02
Affinity Capture
7:41
Results: Comparing Some Different Aspects of Affinity Capture Optimization
9:38
Conclusion
