Name: A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda a preparar fatias oblíquas da medula espinhal de camundongos jovens para estimulação das raízes ventrais. Esta técnica permite identificar motoneurônios e estudar células ventrais inervadas por colaterais axonais motoneurais.

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Os autores agradecem Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer por sua ajuda em tomar as fotografias. Os autores agradecem também Arjun Masukar e Tobias Bock pela revisão do manuscrito. apoios financeiros foram fornecidos pela Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), o NIH-NINDS (R01NS077863), a Fundação Latran Thierry (OHEX Projeto), a associação francesa para miopatia ( número de concessão 16026) e Target ALS é reconhecido agradecimento. Felix Leroy foi o destinatário de um &quot;Contrato de Doutorado&quot; da Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Os experimentos foram realizados em conformidade com as directivas europeias (86/609 / CEE e 2010-63-UE) e da legislação francesa, e foram aprovados pelo comitê de ética Paris Descartes University. 1. Spinal Cord Slice Preparação <ol><li> Prepare as seguintes soluções diárias ou um dia de antecedência. Se mantida durante a noite, bolha, com 95% de O2 e 5% de CO 2 e manter refrigerado em frascos bem fechados. <ol><li> Prepare baixo Na + fluido artificial cerebrospinal (ACSF): KCl a 3 mM, 1 mM de NaH 2 PO 4, sacarose 230 mM, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM de CaCl 2, 8 mM de MgCl2, glucose 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 1 mM de Na-cinurenato, 2 mM de Na-piruvato. Bolha com 95% de O2 e 5% de CO 2 (pH 7,4). Desde Na-cinurenato é muitas vezes difícil de dissolver-se, certifique-se de comprar o que está listado na tabela de materiais. </li><li> Prepare solu K-gluconatoção: mM de K-gluconato 130, KCl 15 mM, EGTA 0,05 mM, HEPES 20 mM, glicose 25 mM, 1 mM de Na-cinurenato, 2 mM de Na-piruvato, ajustado para pH 7,4 com KOH. </li><li> Prepare ACSF: 130 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 1 mM de NaH 2 PO 4, 26 mM de NaHCO3, glucose 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 2 mM de Na-piruvato. Bolha com 95% de O2 e 5% de CO 2 (pH 7,4). </li><li> Antes do início da dissecção, dissolve-se 2% de agar em 80 ml de solução de K-gluconato, e mantê-lo aquecido a 60 ° C. </li></ol></li><li> intracardíaca perfusão <ol><li> Executar esta preparação em ratos fêmeas e machos, com idade variando de P2 para P11. </li><li> Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de 0,1 ml de 25 mM de pentobarbital sódico (50 mg / kg). </li><li> Usando agulhas ou fita, imobilizar o mouse sobre as suas costas em uma grande placa de petri preenchida com silicone. Use um microscop dissecandoe para o resto da dissecção. </li><li> Segurando a extremidade do esterno, levantar o peito e corte do diafragma utilizando uma tesoura fina. Em seguida, abra o baú em ambos os lados, cortando as costelas para expor o coração. </li><li> Corte o átrio direito antes de perfurar o ventrículo esquerdo com uma agulha 27G. </li><li> Perfundir com gelado de baixo Na + ACSF. Depois de 30 segundos, de baixo Na + ACSF deve ser visto que flui para fora do átrio. Baixa quantidade de sódio evitar que as células de spiking e reduzir a morte celular durante a dissecção. </li><li> Manter que prende a agulha no coração sob o microscópio de dissecação até que o fígado torna-se amarela quando o sangue é drenada. </li></ol></li><li> Dissecção da medula espinhal <ol><li> Decapitar o animal e colocá-lo em seu estômago. </li><li> Remover rapidamente a pele das costas (Figura 1A1). Faça dois cortes através dos ombros e indo para baixo da caixa torácica (Figura 1A2). Em seguida, corte o cabo como lOW quanto possível na secção de caudal de modo a isolar a coluna vertebral com o início das nervuras a partir da parte inferior do animal. Virar o animal novamente e remover as vísceras ainda ligado às costelas. </li><li> Transferir a coluna vertebral para outro, menor placa de Petri cheia de silício e utilizar 4 pinos de insectos para segurá-la dorsal voltada para cima (Figura 1A). </li><li> Continuamente perfundir o animal com ACSF borbulhou-carbogénio (a cerca de 4 ° C) durante a execução de uma laminectomia de lado dorsal, e expor a medula espinal a partir da extremidade rostral (Figura 1B). Para fazer isso, insira a ponta de uma tesoura fina entre o osso e da medula espinhal e cortar o osso, pouco a pouco a partir do final rostral, certificando-se de ficar longe da matéria branca. Suplente de cada lado ao usar uma pinça para manter longe a banda do osso já cortadas (Figura 1B1). </li><li> Usando as mais pequenas tesouras primavera disponíveis e pinças, levante a dura e cortarem ambos os lados ao mesmo tempo que prende a parte solta da dura-máter de modo a evitar danificar a espinal medula com a tesoura. Corte ao longo do eixo rostro-caudal. NOTA: A dura-máter é uma membrana contínua semi transparente; nesta idade a pia-máter é muito frágil e se parta durante a dissecção e corte (Figura 1B2). </li><li> Uma vez que a dura-máter é a utilização removeu um vidro sem corte ou a ponta de plástico para empurrar suavemente a cabo no lado esquerdo da ranhura formada pela coluna meia-cortada da coluna vertebral, e cortar as raízes ventrais e dorsais no lado direito, a partir do lado rostral , mais distante, onde eles entram na medula (alguns mm, pelo menos, Figura 1B2). </li><li> Repita a operação do lado esquerdo, sempre indo de rostral para caudal. Se canhoto, comece a partir do lado esquerdo e, em seguida, passar para o lado direito. </li></ol></li><li> Incorporação em agar <ol><li> Deslize o cabo da coluna vertebral. Use um pino de insetos menores de fixar para baixoo cabo com o dorsal superfície para cima e delicadamente remover qualquer pedaço de membrana ainda ligado a ele (Figura 1C1). </li><li> Uma vez limpo, cortar ambas as extremidades (Figura 1C2). Insira um pino de insetos dobrado na parte anterior da medula para manipular o cabo e observe a sua orientação (seta na Figura 1C2). Em seguida, transferir a medula espinal a uma solução de K-gluconato gelada. NOTA: Esta solução imita a composição intracelular do CSF e impedirá que as células morram de choque osmótico uma vez que os neurónios motores serão cortados 26. </li><li> Uma vez que a medula espinal está dentro da solução intra-celular, levar o copo com o ágar para fora do banho seco e arrefece-se para baixo sobre uma mistura de gelo e água. </li><li> Manter agitação enquanto se mede a temperatura. Quando a temperatura atinge 38 ° C mergulhe a medula espinhal, segurando-o pelo pino de insetos e colocá-lo lado rostral para baixo. Certifique-se a medula espinhal é como straight possível, longe das paredes, parte caudal ligeiramente para cima (Figura 1D1). </li><li> Deixar o copo na mistura de gelo e água, para permitir o agar solidificar mais rapidamente possível. Certifique-se de que fique no lugar e que o cabo é o mais reto possível (Figura 1D1). </li></ol></li><li> Cortando <ol><li> Após a solidificação, cortar o bloco de agar contendo a medula espinal, de tal maneira que a base do bloco é a um ângulo de 35 ° com a parte lombar da medula (seta na Figura 1D2). A superfície dorsal deve estar voltada para longe da base (Figura 1D2). NOTA: Este é um passo crítico no processo, para manter a continuidade das piscinas de neurónios motores para as raízes ventrais de onde eles saem. </li><li> Cole o bloco para dentro da câmara do vibratome utilizando de cola de cianoacrilato. Mergulhá-lo na solução de K-gluconato e adicionar solução de K-gluconato congelada slushed para mantero banho frio (abaixo de 2 ° C). </li><li> Corte 350 - 400 mm fatias grossas de região lombar (identificável pela sua curvatura e diâmetro maior). Na sua orientação adequada (ver 1.4.1.), Use a lâmina para cortar a partir da dorsal à superfície ventral e fazer fatias continuamente mais rostral. Normalmente, existem 4-5 fatias adequados, com raízes ventrais que se estendem 2 mm ou mais. Utilize os seguintes parâmetros: 10 ° de ângulo, frequência de vibração 70 Hz e 10 mm Velocidade / min de corte. </li></ol></li><li> Incubação <ol><li> Transferir as fatias para ACSF a 34 ° C. Após cerca de 30 min, arrefecer as fatias até à TA e começar a sessão de gravação. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> Figura 1. Dissecção A1:. A remoção da pele da parte de trás para expor a coluna dorsal A2:Corte dos ombros e costelas para libertar a coluna dorsal B1:. Coluna vertebral fixado na placa de Petri cheia de silício (lado dorsal para cima, lado caudal esquerda) B2:. Mesmo com a medula espinal exposta e dissecados C1:. Medular isolada . (lado rostral esquerda) C2: medular pronto para ser incorporado (lado ventral para cima, lado rostral esquerda). Observe o pino de insetos menores no lado rostral D1:.. Medular no copo de agar (lado rostral dow, lado ventral de frente para a parte inferior) D2: bloco de agar Cut com a medula espinhal incorporado. Nota o ângulo de 35 ° as formas medulares com a base do bloco e do alargamento lombar (Seta). Barras de escala 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Colocar a fatia para a Câmara NOTA: Ventral raízes são de tamanho variável. <ol><li> Prepara-se uma caixa de várias pipetas com diâmetros ponta variando de 40 a 170 um com antecedência. Para preparar pipetas de sucção, prepare muitos pipetas com um longo cone. Usando uma faca de diamante, fazer um corte em diferentes posições. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, quebrá-lo por bater a ponta com uma pinça. </li><li> Retire a câmara do microscópio de gravação e colocá-lo sob um microscópio de dissecação. </li><li> Seleccionar uma fatia que contém uma raiz ventral de comprimento suficiente (2 mm ou mais) para ser montado sobre um eléctrodo de estimulação de sucção. Marque a orientação correcta da fatia com as raízes ventrais para cima (Figura 2A) e delicadamente cortar o agar em torno das raízes ventrais, deixando o resto do agar em volta da fatia (Figura 2B). Observação: Uma vez que o ágar é mais firme do que a fatia, isto irá permitir que os fios da âncora da fatia para descansar sobre o agar em vez de sobre a fatia e, assim, a umnchor não irá danificar o tecido. Certifique-se os fios da âncora do fatia estão acima do agregado neuromotor (mostrado em vermelho na Figura 2C). </li><li> Montar a câmara de volta para o microscópio e continuamente perfundir a câmara de registo com ACSF a uma taxa de 1-2 ml / min, à RT. Usando uma pipeta de vidro preenchido com ACSF e ligado a uma seringa, uma chupar da raiz ventral (seta na Figura 2C). A fim de alcançar uma boa estimulação da raiz ventral, a ponta da pipeta tem de ser apertado em torno da raiz ventral. Um pólo deverá estar no eléctrodo estimulante e o outro no banho (ou ligada ao eléctrodo de referência de fixação adesivo). </li><li> Atingir gravação de patch-clamp do tipo de célula desejado e registar o efeito de estimulação da raiz ventral, tal como descrito materialização 10. <ol><li> Aqui, usar um amplificador para aquisição de dados. Filtrar gravações de célula inteira a 3 kHz. Digitalizar a 10 kHz. Compensar a resistência ponte em curreModo de NT-braçadeira. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Figura 2. Preparação de raiz ventral A: fatia lombar da medula espinhal incorporado em agar com a raiz ventral para cima B:. Fatia da medula espinal lombar com as raízes ventrais libertados do agar C:. Fatia da medula espinal lombar com um eletrodo estimulante firmemente colocados ao redor das raízes ventrais (seta) . Observe a localização das células que expressam Renshaw fluorescência vermelha na 28 chrna2-Cre rato cruzado com o repórter do mouse R26 Tom 17. Barras de escala de 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

corte oblíquo da medula espinhal é importante uma vez que permite a estimulação unilateral de piscinas de neurónios motores e células de Renshaw em um único segmento vertebral de uma forma fiável, completo e específico. Além disso, ele permite uma identificação rápida, elegante e não-ambígua de neurónios motores gravados. Em seguida, vamos destacar as vantagens desta técnica em comparação com outros métodos de preparação fatia, e depois vamos forçar para fora das armadilhas mais comuns para evitar durante a realização d...

Historicamente, as gravações de neurónios motores que utilizam afiado-eléctrodo foram realizadas in vivo em animais de grande porte, tais como gatos ou ratos 1, ou por um conjunto isolado da medula espinal em ratos 2. O surgimento da técnica de gravação de patch-clamp durante os anos 1980, chamado para o acesso directo à motoneurônio somas como a selagem necessária para ser alcançado sob a orientação visual. Assim, a preparação fatia da medula espinal foi prontamente alcançado desde o início da década de 1990 3. No entanto, a preparação fatia precoce muitas vezes não permitir a estimulação das raízes ventrais. Para o melhor de nosso conhecimento, apenas dois estudos relataram a estimulação bem sucedida das raízes ventrais em fatias transversais, e nenhuma foi obtido a partir de camundongos 4,5. Neste artigo apresentamos uma técnica para alcançar fatias de medula espinhal viáveis ​​de ratos neonatal (P2 - P11) em que o agregado neuromotor mantém suas raízes partida axônios ventral. respiradouroestimulação da raiz ral desencadeia potencial de ação antidrômica de volta para as somas do agregado neuromotor sair da mesma raiz ventral. Ele também excita os objectivos de garantia de neurónios motores, outros motoneurônios 6-10 e as células de Renshaw 11-13. Uma vez que apenas neurónios motores enviam seus axônios para baixo as raízes ventrais, usamos o registro de potenciais de ação antidrômicos como uma maneira simples e definitiva para fisiologicamente identificar neurónios motores 10. Além de usar critérios eletrofisiológicos e morfológicos potencialmente não incluído ou enganosas para confirmar a identidade motoneurônio, estudos recentes sobre neurónios motores da medula espinhal também contou com tediosa e demorada post hoc colorações 16. Esta identificação é normalmente realizado apenas numa amostra das células gravadas. Outras estratégias de identificação dependem de linhas de rato em que os neurónios motores expressar fluorescência endógena <sup&gt; 17-19. No entanto, usando marcadores codificados geneticamente pode ser difícil em uma idade jovem, quando a expressão do marcador ainda é variável ou se o estudo já requer o uso de uma linha de rato transgénico. Alternativamente, as gravações de potenciais de acção antidrômica pode ser realizado rotineiramente em todos os ratinhos a partir do início da gravação célula. Experimentadores de trabalho sobre os preparativos da medula espinhal intactas no gato, rato e rato, têm utilizado de forma confiável tais técnicas de identificação desde 1950, 1,2,20,21. Em condições óptimas, fomos capazes de desencadear potenciais de acção antidrômicos a partir de praticamente todos os neurónios motores gravados. Além disso, a estimulação raiz ventral pode ser usado com fiabilidade para excitar outros motoneurónios 22,23 ou os seus alvos. as células de Renshaw 10,24,25. Apresentamos aqui as aplicações da estimulação raiz ventral na forma de ação antidrômica potenciais gravações de somas motoneurônio, bem como excitação de células de Renshaw.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>dissolve-se melhor do que outras marcas</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4Sigma</td><td></td> <td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sacarose&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Qualidade Biológica</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glicose&nbsp;</td><td>Ácido</td> ascórbico Sigma <td>G5767</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-piruvato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>ácido glucônico</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de césio</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td> Tesoura de mola <td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas - 2.5mm&nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>só pode ser usado para cortar a dura-máter, pode ser danificado se cortar ossos</td></tr><tr><td>Estimulador</td> de Pulso Isolado <td>A-M Systems</td><td>Modelo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Micrótomo Vibratório 7000 - Modelo 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

a preparação de oblique spinal cord fatias de estimulação raiz ventral

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

gravações electrofisiológicos a partir de fatias de medula espinal têm provado ser uma técnica valiosa para investigar um grande número de questões, a partir de propriedades da rede celular. Mostramos como preparar fatias oblíquas viáveis ​​da medula espinhal de ratos jovens (P2 - 11). Nesta preparação, os motoneurónios reter os seus axónios que sai das raízes ventrais da medula espinal. A estimulação desses axônios provoca back-propagação potenciais de ação que invadem o somas motoneurônio e emocionantes garantias do motoneurônios na medula espinhal. Gravação de potenciais de ação antidrômicos é uma forma imediata, definitiva e elegante para caracterizar a identidade motoneurônio, que supera outros métodos de identificação. Além disso, estimular as garantias de neurónios motores é uma maneira simples e confiável para excitar os alvos colaterais dos neurónios motores na medula espinhal, como outros neurónios motores ou Renshaw células. Neste protocolo, apresentamos gravações antidrômicos do motoneurônio somas, bem como excitação celular Renshaw, resultante da estimulação da raiz ventral.

Confirmação do motoneurônio Identidade Usando Potenciais antidrômica Ação segmentação celular Os motoneurónios são encontrados no corno ventral (no vermelho visível na Figura 2C). Iniciar a partir do feixe de axônios que formam a raiz ventral e ir até o feixe dispersa totalmente e um começa a ver grandes células (eixo...

Mostramos como preparar fatias oblíquas da medula espinhal em ratos jovens. Esta preparação permite que a estimulação das raízes ventrais.

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias oblíquas da medula espinhal que permitam a estimulação das raízes ventrais. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a identificação de motoneurônios para estimulação da raiz ventral e o estudo das células ventrais inervadas pelos colaterais axonais dos motoneurônios. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método ao precisar de uma forma confiável de estimular células ventrais.Indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades devido à complexidade para executar corretamente as diferentes etapas da dissecação. Comece perfundindo um camundongo P2 a P11 com ACSF de baixo teor de sódio. Após decapitar o camundongo e remover a pele da região dorsal, faça dois cortes através dos ombros e descendo pela caixa torácica.Em seguida, corte a medula espinhal o mais baixo possível na seção caudal para isolar a coluna vertebral e as costelas da parte inferior do animal. Vire a coluna vertebral e remova as vísceras ainda aderidas às costelas. Transfira a coluna vertebral para outro disco de Petri menor, preenchido com silicone.Adicione ACSF frio e borbulhe com carbogênio, utilizando quatro pinos para insetos para fixar o tecido com o lado dorsal voltado para cima. Em seguida, realize uma laminectomia do lado dorsal inserindo primeiro a ponta de uma tesoura fina entre o osso e a medula espinhal e cortando o osso a partir da extremidade rostral, tomando cuidado para manter distância da substância branca. Alterne os cortes em cada lado, utilizando pinças para segurar a faixa óssea já seccionada.Em seguida, utilize pin&ccedil;as pequenas para levantar a dura-m&aacute;ter e tesouras pequenas para cortar ao longo do eixo rostrocaudal em ambos os lados. A remo&ccedil;&atilde;o da dura-m&aacute;ter &eacute; uma etapa cr&iacute;tica. Vale bem a pena gastar alguns minutos extras para fazer isso de forma completa.Uma vez removida a dura-máter, utilize uma ponta de vidro romba para empurrar suavemente a medula para o lado esquerdo do sulco formado pela coluna vertebral cortada ao meio. Em seguida, corte as raízes ventrais e dorsais no lado mais brilhante o mais distante possível do ponto onde entram na medula. Repita a operação no lado esquerdo, sempre seguindo da região rostral para a caudal.Após a dissecação, retire cuidadosamente a medula espinhal da coluna vertebral. Em seguida, use um pequeno pino para insetos para fixar a medula com a superfície dorsal voltada para cima. Remova delicadamente quaisquer fragmentos de membrana aderida.Após a limpeza, corte as duas extremidades do cordão e insira um alfinete curvado para insetos na parte anterior do cordão para marcar sua orientação. Em seguida, transfira a medula espinhal para uma solução intracelular fria com gelo. A seguir, resfrie o agar fundido previamente preparado em uma mistura de gelo e água.Agite o ágar enquanto mede a temperatura. Quando a temperatura do ágar atingir 38 graus Celsius, segure a medula espinhal com o alfinete de inseto e imerja-a no ágar, com o lado rostral para baixo. Certifique-se de que a medula espinhal esteja o mais reta possível, afastada das paredes, com a parte caudal ligeiramente voltada para cima.Deixe o béquer na mistura de gelo e água para permitir que a ágar solidifique ao redor do cordão o mais rapidamente possível. Após a solidificação, corte o bloco de ágar contendo a medula espinhal de modo que a base do bloco forme um ângulo de 35 graus com a parte lombar do cordão. A superfície dorsal deve ficar voltada para longe da base.Cole o bloco na câmara do vibrátomo, utilizando cola de cianoacrilato. É fundamental montar o bloco corretamente para manter a continuidade dos grupos motores com as raízes ventrais pelas quais eles saem. Mergulhe o bloco na solução de gluconato de potássio.Defina os parâmetros do vibrátomo. Em seguida, corte fatias de 350 a 400 mícrons de espessura da região lombar, identificável por sua curvatura e diâmetro maior. Transfira as fatias adequadas para ACSF a 34 graus Celsius.Normalmente, há quatro a cinco fatias adequadas com raízes ventrais estendendo-se por dois milímetros ou mais. Após aproximadamente 30 minutos a 34 graus Celsius, resfrie as fatias até a temperatura ambiente e, em seguida, inicie a sessão de gravação. Prepare com antecedência uma caixa com vários micropipetas com diâmetros de ponta variando de 40 a 170 mícrons.Para preparar as pipetas de seccionamento, selecione pipetas com uma ponta longa e fina. Em seguida, utilizando uma lâmina de diamante, faça cortes em diferentes posições e, sob um microscópio estereoscópico, quebre cada pipeta batendo na ponta com pinças. A seguir, remova a câmara do microscópio de gravação e coloque-a sob um microscópio estereoscópico.Selecione uma fatia que contenha uma raiz ventral de comprimento suficiente para ser montada em um eletrodo de estimulação por sucção. Monte a fatia, orientando-a com as raízes ventrais voltadas para cima, em seguida corte delicadamente o ágar ao redor das raízes ventrais, mantendo o restante do ágar ao redor da fatia, e coloque a grade para segurar a amostra para baixo. Recoloque a câmara no microscópio e perfunda continuamente a câmara de gravação com ACSF a uma taxa de um a dois mililitros por minuto à temperatura ambiente.Usando uma pipeta de vidro preenchida com ACSF e conectada a uma seringa, aspire uma das raízes ventrais. Para obter uma boa estimulação da raiz ventral, a ponta da pipeta precisa estar bem ajustada ao redor da raiz ventral. Realize o registro em configuração de patch-clamp do tipo celular desejado e registre o efeito da estimulação da raiz ventral conforme descrito anteriormente.Esta imagem mostra os resultados do registro em regime de tensão fixa (voltage-clamp). Os registros dos painéis superiores foram obtidos de diferentes motoneurônios em relação aos dos painéis inferiores. O painel superior mostra a resposta antidrômica de um motoneurônio a uma estimulação de um volt em vermelho e a uma estimulação de cinco volts em preto.O tra&ccedil;o inferior mostra a resposta do potencial de a&ccedil;&atilde;o ortodr&ocirc;mico a uma estimula&ccedil;&atilde;o de 20 volts em vermelho e a uma estimula&ccedil;&atilde;o de 30 volts em preto. Os pontos pretos indicam o momento do est&iacute;mulo. As cabe&ccedil;as de seta duplas enfatizam a diferen&ccedil;a nas lat&ecirc;ncias entre os potenciais de a&ccedil;&atilde;o ortodr&ocirc;micos e antidr&ocirc;micos.Aqui, são apresentados registros em regime de corrente constante. O painel superior mostra a resposta antidrômica a estímulos de 10 volts e 15 volts em vermelho e preto, respectivamente. O painel inferior mostra a resposta ortodrômica a estímulos de 25 e 40 volts em vermelho e preto, respectivamente.Novamente, o cronograma do estímulo e as diferenças nas latências são indicados. Esta imagem do grupo de células de Renshaw foi obtida utilizando um condensador oblíquo e uma objetiva de 20x. Observe os axônios de motoneurônios se fundindo com a raiz ventral, conforme indicado pela seta.Esta imagem da mesma região foi obtida utilizando um objetivo de 40x. Células de Renshaw putativas são indicadas com cabeças de seta. É mostrado aqui um registro em regime de fixação de voltagem de uma célula de Renshaw após estimulação da raiz ventral, indicada pelo ponto preto.O QX-314 na solução intracelular impediu a geração de potenciais de ação pela célula e as respostas à glicina e ao GABA foram bloqueadas por 3 micromolar de gabazina e um micromolar de estricnina, respectivamente. O traço vermelho é a média dos traços cinza. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em 20 ou 30 minutos.Embora realize este procedimento, é importante lembrar-se de manter o preparo em meio frio o tempo todo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar fatias oblíquas da medula espinhal adequadas para a estimulação da raiz ventral. A estimulação da raiz ventral pode ser usada para confirmar facilmente a identidade motoneural e, mais importante, para estimular de forma confiável as células ventrais.

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos processos de preparação e de gravação electrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm o eixo dorso-ventral do córtex entorrinal medial (MEC). Devido codificação neural da localização seguinte uma organização dorsal-ventral dentro do MEC, estes procedimentos facilitar a investigação dos mecanismos celulares importantes para navegação e de memória.

Preparação de fatias parassagital de Investigação de dorso-ventral Organização do Rodent córtex medial entorrinal

Este vídeo descreve o registro intracelular in vivo de motoneurônios de ratos sob estimulação transespinhal por corrente contínua. O protocolo descreve como medir as propriedades da membrana e registrar o disparo rítmico de motoneurônios antes, durante e após a polarização anódica ou catódica da medula espinhal.

Estimulação transespinhal por corrente contínua do motoneurônio espinhal de um rato

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em matriz de microeletrodos para estudar a atividade da rede neuronal em seções da medula espinhal de camundongos. Primeiro, a atividade eletrofisiológica do corno dorsal superficial (SDH) do corte é registrada. Em seguida, um inibidor do canal de potássio é introduzido para prolongar a despolarização, resultando em atividade rítmica síncrona em toda a rede neuronal.

Avaliação baseada em matriz de microeletrodos de redes neuronais em fatias da medula espinhal de camundongos

Registrar correntes de Ca2+ na membrana facial de liberação pré-sináptica é a chave para uma compreensão precisa da entrada de Ca2+ e da liberação de neurotransmissores. Apresentamos uma dissociação aguda da medula espinhal da lampreia que produz axônios reticuloespinhais isolados funcionais, permitindo o registro diretamente da membrana facial de liberação de terminais pré-sinápticos individuais.

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

A eficácia da captação intramuscular e do transporte retrógrado de moléculas para os neurônios motores correspondentes depende da localização dos locais de injeção em relação às placas terminais motoras (MEPs). Aqui, descrevemos como localizar MEPs nos músculos esqueléticos para otimizar o transporte retrógrado de traçadores para os neurônios motores.

Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Este protocolo visualmente se comunica a preparação de tronco cerebral-medular e clarifica a preparação de fatias transversais de tronco cerebral de uma forma abrangente e passo a passo. Ele foi projetado para aumentar a reprodutibilidade e aumentar a probabilidade de se obter fatias ritmicamente ativo, viáveis e duradouras, para gravar saída neural das regiões respiratórias do tronco cerebral.

Preparação de ritmicamente ativo em Vitro Neonatal roedores tronco cerebral-medular e fatia fina

Este protocolo descreve a gravação intracelular in vivo de motoneurons lombares de rato com estimulação simultânea de corrente trans-espinhal. O método permite medir as propriedades da membrana e registrar disparos rítmicos de motoneurons antes, durante e depois da polarização anodal ou catódal da medula espinhal.

In Vivo Intracelular Gravação de Motoneurons vertebrais de rato identificados tipo durante estimulação de corrente direta trans-espinhal

A integração de diversas entradas sinápticas aos neurônios é melhor medida em uma preparação que preserva todos os núcleos pré-sinápticos para o tempo natural e a plasticidade do circuito, mas as fatias cerebrais normalmente cortam muitas conexões. Desenvolvemos uma fatia cerebral modificada para imitar a atividade do circuito in vivo, mantendo a capacidade de experimentação in vitro.

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

O uso combinado da tecnologia de matriz de microeletrodos e estimulação química induzida por 4 aminopirdina para investigar a atividade nociceptiva em nível de rede no chifre dorsal da medula espinhal é delineado.

Atividade de rede de gravação em circuitos nociceptivos da coluna vertebral usando matrizes de microeletrodos

Este protocolo descreve um método que utiliza um patch-clamp para estudar as respostas elétricas dos neurônios motores à estimulação da medula espinhal (SCS) com alta resolução espaço-temporal, o que pode ajudar os pesquisadores a melhorar suas habilidades em separar a medula espinhal e manter a viabilidade celular simultaneamente.

A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Aprenda a preparar fatias oblíquas da medula espinhal de camundongos jovens para estimulação das raízes ventrais. Esta técnica permite identificar motoneurônios e estudar células ventrais inervadas por colaterais axonais motoneurais.

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

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