Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos, Ceratitis capitata

O objetivo geral deste procedimento é fornecer ácidos nucléicos aos embriões de Ceratitis Capitata, uma importante praga agrícola, para expandir a caixa de ferramentas para seu controle. Este método ajuda a corrigir funcionalmente genes em um organismo imóvel, bem como gerar cepas transgênicas. A principal vantagem desta técnica é que quantidades muito baixas de ácidos nucléicos são injetadas para obter os efeitos desejados.

Manter todos os estágios de vida da colônia de moscas a 25 graus Celsius com 65% de umidade e um fotoperíodo de 12 horas de 12 horas com uma fotofase começando às 8h. Insira uma tira de esponja através de uma pequena abertura na base da gaiola para fornecer água às moscas por meio de ação capilar. Você estabelece uma gaiola de seis litros, carrega uma com entre 1.500 e 2.000 pupas.

Para comer, carregue a gaiola com cerca de 45 gramas de uma mistura de um a 10 de fermento e açúcar. Para coletar os ovos, coloque um prato cheio de água abaixo da gaiola. As fêmeas depositam ovos através da malha, que então se acumulam na água.

Como as fêmeas virgens podem ovado-positar, certifique-se de que os ovos sejam todos fertilizados esperando até que as moscas tenham pelo menos uma semana de idade, antes de coletar os ovos. Para coletar os ovos, filtre a água com uma peneira fina. Em seguida, usando uma pipeta pasteural, transfira os ovos para uma caixa de plástico carregada com cerca de 0,5 litro de alimento larval padrão.

Se não houver ovos suficientes, aumente o teor de fermento da comida do adulto em até 25%Coloque cada caixa em um recipiente transparente, contendo uma camada de farelo para favorecer a pupação. Cubra o recipiente com uma tampa de rede para permitir a circulação de ar. Após cerca de 10 dias, verifique se há larvas de terceiro ínstar que saltaram para a camada de farelo para pupação.

Uma vez encontrado, prepare-se para verificar se há pupas nos dias seguintes. Para coletar a pupa, use uma escova macia para varrê-la do recipiente. Inicialmente, colete as pupas em um copo pequeno.

Após a conclusão das coletas, transfira as pupas para uma nova gaiola de adulto. Os adultos devem emergir em cerca de 10 dias. Para a microinjeção, prepare as lâminas com antecedência.

Prenda uma tira de dois centímetros de fita dupla face a uma lâmina e marque as bordas com um marcador de porcelana para fazer uma parede para uma camada de óleo que mantém os embriões hidratados. Para coletar embriões recém-postos, permita que as fêmeas jovens fertilizadas ova-positem por 30 minutos em uma nova bandeja e, em seguida, colete os embriões. Para remover o córion dos embriões, mergulhe a peneira e os ovos em uma solução comercial de alvejante a 50% por cinco segundos.

É fundamental não branquear demais os embriões. Lave imediatamente os embriões branqueados mergulhando cuidadosamente o filtro em água limpa e ultrapura. Faça isso pelo menos quatro vezes.

Em seguida, mantenha o filtro em água ultrapura e transparente e injete os embriões em duas horas. Em seguida, usando um pincel fino, colete cerca de 50 embriões e coloque-os em um disco de papel de filtro preto embebido em água. Sob um microscópio estereoscópico de dissecação, enfileire os embriões na fita dupla face de uma lâmina de microscópio preparada.

Oriente todos os embriões na mesma direção. É importante manipular os embriões com cuidado, pois a perfuração da membrana do embrião com o pincel pode causar danos que reduzem a sobrevivência do embrião. Agora cubra os embriões com uma camada de óleo de etileno cloro-trifloro.

O óleo deve ser contido pelas bordas do marcador de porcelana. Não transborde as fronteiras. Usando uma micropipeta, carregue a agulha de injeção com alguns microlitros de solução de ácido nucleico a um a dois microgramas por microlitro.

Em seguida, conecte a agulha ao aparelho de microinjeção e ajuste-a para fornecer uma injeção de meio segundo a 800 hecto-pascais com uma contrapressão de 150 hecto-pascal. Para injetar, use um gatilho de pedal e use o micromanipulador para controlar a agulha enquanto usa os controles de estágio para mover o slide. Confirme se o bolus de injeção está sendo ejetado corretamente e, em seguida, alinhe a agulha com o pólo posterior do primeiro embrião na fileira.

Movendo o estágio, insira a agulha no embrião e injete o bolo de ácidos nucléicos. O líquido injetado induzirá um aumento na pressão interna, resultando em um leve movimento do embrião. Solte o pedal e, imediatamente, mas com cuidado, remova a agulha do embrião.

Um pouco de citoplasma vazará no local da injeção. Isso é normal. Se os embriões estiverem estourando com a injeção, deixe-os secar por alguns minutos antes de cobri-los com óleo.

Após a injeção, transfira a lâmina para uma placa de Petri. Coloque um disco de papel de filtro na tampa do prato. Mergulhe o filtro com água e feche a placa de Petri com filme de parafina.

Incube a câmara a 25 graus Celsius. Dois dias após a injeção, verifique as lâminas várias vezes ao longo do dia para ver se há larvas eclodidas. Procure larvas no óleo e, usando um pincel fino, transfira-as para uma placa de Petri com comida larval à base de cenoura.

Carregue cada prato com até 200 larvas. A larva não pode sobreviver no óleo por muito tempo, então procure com frequência. Incube as larvas com a tampa quase fechada, para que ainda haja fluxo de ar para as larvas.

Verifique os pratos diariamente e depois de uma semana prepare-se para coletar as larvas, colocando-os em um recipiente com farelo. Colete as pupas e logo depois espere que elas surjam. Mais tarde, anestesiar adultos nascidos usando dióxido de carbono e inspecioná-los quanto à transformância.

Ao rastrear, esse método de mobilização pode ser crítico. Adultos Medfly podem ser anestesiados com gelo ou CO2, mas a exposição prolongada pode reduzir a sobrevivência de outras pessoas. Verifique a presença de fluorescência vermelha usando um filtro largo vermelho DS.

Ou verifique se há fluorescência verde usando um filtro EYFP. Transfira os indivíduos transformados para uma pequena gaiola com adultos selvagens do sexo oposto para estabelecer uma linhagem heterozigótica. Em um experimento, o RNA de dupla tensão foi usado para silenciar a expressão do gene inx5.

A linha germinativa adulta de controles não injetados parece ser normal como esperado, enquanto os indivíduos tratados mostraram testículos e ovários subdesenvolvidos. A quantificação da abundância de transcritos inx5 no abdômen de indivíduos de ambos os sexos confirmou a expressão significativamente menor do gene em comparação com os controles. Em um segundo experimento, duas cepas com espermatozóides marcados foram geradas usando o promotor beta-2 tubulina para conduzir diferentes marcadores fluorescentes.

Os machos transgênicos mostraram um padrão de fluorescência distinto no corpo e nos testículos. Com este vídeo, fornecemos nossos protocolos otimizados para a criação e microinjeção de ácidos nucléicos em embriões de moscas. Uma vez dominados, podem ser injectados até 1 000 embriões ao longo de um dia de trabalho de oito horas.

Após este procedimento, outros metais como thy-lino-crisp-er, cas-min-eta-geno-meta-tine podem ser realizados para desenvolver uma nova geração de cepas de mosca.