Viabilidade imagens de células em Scaffolds não-transparentes - usando o exemplo de um Titanium Implant Novel malha
September 7th, 2016
Aqui nós apresentamos uma técnica de imagem fluoróforo base para detectar a viabilidade celular em um andaime de titânio não-transparente, bem como para detectar vislumbres das impurezas de andaime. Este protocolo soluciona o problema de imagiologia de interacções célula-célula ou célula-metal em andaimes não transparentes.
O objetivo geral deste experimento é visualizar a microestrutura e a adesão celular em um implante de núcleo de titânio tricotado não transparente, usando técnicas de imagem fluorescente. Este método avança na análise da engenharia de tecidos com andaimes não transparentes. Uma vantagem desta técnica é que se pode rastrear a viabilidade celular, bem como a proliferação no andaime com ar comprimido de cultura definido.
A demonstração visual desse método é fundamental, pois a coloração fluorescente e, posteriormente, a visualização são desafiadoras. As propriedades individuais do andaime, como o tamanho dos poros, podem afetar o tempo e/ou a fluorescência do andaime pode afetar a escolha dos fluoróforos que você está usando. Coloque até cinco andaimes de seis ou sete milímetros de espessura em um tubo de 50 mililitros e lave-os com água três vezes por 20 minutos por lavagem.
Faça isso em temperatura ambiente com agitação suave. Em seguida, lave os andaimes em 30 mililitros de solução 1%Triton X-100 nas mesmas condições. Em seguida, faça mais duas lavagens com água.
Agora, sonicar sequencialmente os andaimes em grau reagente 99% acetona, 99% isopropanol e 99% etanol. Execute cada etapa de sonicação duas vezes por cinco minutos por sonicação. Em seguida, sonicar o andaime mais três vezes em água por um total de 15 minutos.
Termine colocando os andaimes em um lenço de papel sem fiapos e secando-os ao ar durante a noite em temperatura ambiente. No dia seguinte, autoclave os andaimes por 15 minutos a 121 graus Celsius e 15 PSI. Para confirmar se a limpeza funcionou, use fluorescência indireta.
Carregue um poço de uma placa de 12 poços com 2000 microlitros da solução de coloração de enxofre-rodamina B recém-feita e, usando uma pinça, transfira um andaime para esse poço. Em seguida, capture imagens negativas do andaime usando um microscópio de fluorescência equipado com um conjunto de filtros de cubo de LED RFP e procure impurezas em alta ampliação. Usando o gabinete de biossegurança, transfira os andaimes limpos para os poços de uma placa de 24 poços.
Adicione 500 microlitros de meio de cultura a 37 graus Celsius a cada poço e deixe o andaime de molho por 15 minutos. Enquanto isso, prepare 500.000 células SEP1 infectadas com Ad-GFP por 1 mililitro de meio. Após 15 minutos, aspire completamente o meio dos andaimes e assente-os com 100 microlitros da suspensão celular.
Em seguida, incube-os por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a breve incubação, adicione mais 500 microlitros de meio de cultura e incube os andaimes por 24 horas. No dia seguinte, troque o meio de cultura para remover as células não aderentes.
Em seguida, avaliar a aderência e o espalhamento das células nos scaffolds, utilizando um microscópio de fluorescência equipado com um conjunto de filtros de cubo de LED GFP. Para uma coloração de mortos-vivos, primeiro coloque as células SEP1 no andaime como antes. Após 24 a 48 horas, aspirar completamente o meio de cultura e lavar os andaimes com DPBS durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Agora, core as células usando meio de cultura contendo Calcein AM, Hoechst 33342 e homodímero de Ethidium. Esses três fluoróforos são todos sensíveis à luz, por isso é vital manter as células no escuro avançando. Incube as células por 30 minutos com os fluoróforos para obter uma distribuição uniforme em todo o andaime.
Características específicas do andaime afetarão esse tempo de incubação. Após a incubação, lave as células três vezes com DPBS usando um mililitro por poço. Execute cada lavagem por cinco minutos em temperatura ambiente.
Imediatamente após as lavagens, documente os andaimes usando microscopia de fluorescência. Para medir a viabilidade celular ao longo do tempo, use medições de conversão de resazurina. Primeiro, aspire completamente o meio de cultura das células SEP1 assentadas em uma placa de 24 poços e lave as células com 500 microlitros de DPBS por poço.
Em seguida, cubra as células com o volume necessário de solução de trabalho estéril de resazurina e inclua um poço apenas com resazurina. Em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por cerca de 30 minutos. Após a incubação, transfira 100 microlitros do sobrenadante condicionado de cada poço para uma placa de 96 micropoços para medir sua fluorescência conforme descrito no protocolo de texto.
Para posterior cultivo, retire a resazurina do poço e lave três vezes com um mililitro de DPBS. Realize cada lavagem por cinco minutos em temperatura ambiente. Após a terceira lavagem, adicione 500 microlitros de meio de cultura a cada poço de células e continue sua incubação para outras medições de curso de tempo.
Usando coloração fluorescente indireta, as impurezas pré-limpeza foram documentadas para otimizar o protocolo de limpeza. Uma redução significativa na carga de substâncias no andaime mostra a eficiência do protocolo de limpeza descrito. Os sucessivos implantes usados para o tratamento da artroplastia são determinados por eventos que ocorrem na interface do material celular.
Após 24 horas de aderência com os andaimes, as células SEP1 se fixaram. Os fluoróforos foram então aplicados para examinar a morte e proliferação celular durante um período de tempo nos andaimes. A coloração de mortos-vivos mostrou coloração nuclear azul com fluorescência vermelha nas células mortas e fluorescência verde nas células viáveis.
Além disso, a viabilidade celular no arcabouço foi quantificada usando o ensaio de conversão de resazurina. Ao longo de duas semanas, os dados foram coletados em células cultivadas com ou sem andaimes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ajustar os fluoróforos que você está usando para o andaime e o microscópio que você tem disponível.
Após esse procedimento, outros métodos, como a coloração imunofluorescente, podem ser aplicados para visualizar a presença de proteínas ou a ativação de cascatas de sinalização. A implicação desta técnica se estende para a terapia da artroplastia, pois a interação da face celular com o tecido circundante in vivo definirá sua função e durabilidade.
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Visão Geral
Este estudo apresenta uma técnica de imagem fluorescente para visualizar a adesão celular e a viabilidade em um andaime de titânio não transparente. O método aborda os desafios na imagem das interações celulares com materiais não transparentes, melhorando a análise de engenharia de tecidos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Engenharia de Tecidos
Fundamentos
- Andaimes não transparentes apresentam desafios para a imagem de interações celulares.
- A imagem fluorescente pode fornecer insights sobre a viabilidade e proliferação celular.
- As propriedades do andaime, como o tamanho dos poros, podem influenciar os resultados da imagem.
- A demonstração visual é essencial devido à complexidade da coloração fluorescente.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a microestrutura e a adesão celular em implantes de titânio.
- Melhorar os métodos de análise para andaimes não transparentes.
- Solucionar desafios de imagem associados a esses materiais.
Métodos Utilizados
- Técnicas de imagem fluorescente para avaliação da viabilidade celular.
- Preparação de andaimes de titânio para imagem.
- Protocolos de lavagem para garantir clareza nos resultados de imagem.
- Consideração das propriedades do andaime que afetam a escolha do fluoróforo.
Principais Resultados
- Visualização bem-sucedida da adesão celular em andaimes de titânio.
- Demonstração da capacidade de rastrear a viabilidade e proliferação celular.
- Identificação do impacto das propriedades do andaime na imagem.
- Fornecimento de um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- A técnica melhora a compreensão das interações célula-material.
- Oferece uma solução para os desafios de imagem com andaimes não transparentes.
- Aplicações futuras podem melhorar os resultados da engenharia de tecidos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Imaging cell viability on non-transparent scaffolds, such as knitted titanium implants, addresses a critical bottleneck in tissue engineering and regenerative medicine R&D. This capability enables direct assessment of cell-material interactions, supporting predictive confidence in scaffold biocompatibility and functional integration. The method is strategically positioned to inform early discovery, target validation, and risk-adjusted advancement of novel implantable materials.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cell adhesion and viability on opaque biomaterials, clarifying cell-material interface mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying cell proliferation and survival on candidate scaffolds.
- Facilitates mechanistic de-risking of new implant materials prior to in vivo studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for preparing and imaging non-transparent scaffolds in vitro.
- Delivers reproducible, quantitative outputs for cell viability and proliferation using fluorescence-based assays.
- Enables reliable comparison of scaffold cleaning protocols and surface modifications for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biocompatibility data with translational requirements for implantable devices.
- Supports continuity from discovery-stage scaffold evaluation to preclinical model selection.
- Reduces biological risk by enabling early detection of adverse cell-material interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for implantable biomaterials, bridging early hypothesis testing and translational validation.
- Discovery Biology: Quantifies cell adhesion, viability, and proliferation on candidate scaffolds to inform material selection.
- Screening: Standardizes viability and proliferation assays for non-transparent materials, supporting reproducibility and scalability.
- Analytics: Provides fluorescence-based quantitative readouts for cross-condition and time-course comparisons.
- Translational Research: Aligns in vitro cell-material interaction data with preclinical implant requirements.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for evaluating diverse non-transparent scaffold platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in scaffold biocompatibility and functional integration.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible imaging and quantification protocols for opaque materials.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for novel implant candidates, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of scaffold technologies for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cell culture techniques.
- Demands access to appropriate fluorophores and imaging instrumentation compatible with scaffold properties.
- Necessitates cross-team standardization of cleaning and staining protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different scaffold geometries, pore sizes, or material compositions.
- Fluorophore selection and imaging parameters must be optimized for each scaffold type to avoid signal interference.
