Criação e transplante de uma folha de células-tronco adiposo-derivado (ASC) em um modelo de cicatrização de feridas diabética

O objetivo geral deste procedimento é verificar o efeito de folhas de células-tronco derivadas de tecido adiposo combinadas com pele artificial na cicatrização de feridas para um grande defeito cutâneo de espessura total em ratos diabéticos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a cicatrização de feridas crônicas, como grande ferida diabética com osso exposto. A principal vantagem dessa técnica é que as células são transplantadas para a ferida em folhas sólidas usando a tecnologia de folha de células, e o resultado é um transplante viável e estável.

Para um doador de almofada gorda, planeje usar ratos Lewis de oito a 33 semanas de idade. No local da cirurgia, prepare vários aplicadores estéreis com ponta de algodão, gazes, bisturi, porta-agulhas, tesouras cirúrgicas, uma pinça e sutura de náilon 5-0. Para colocação temporária de tecido, carregue uma placa de Petri de 100 mililitros com 10 mililitros de PBS.

Pese o prato carregado com PBS para depois encontrar a massa do tecido colhido. Depois de anestesiar o rato, posicione-o em decúbito dorsal sobre uma cortina estéril. Em seguida, raspe a área operatória e esfregue a pele exposta usando vários esfoliantes alternados de etanol a 70%.

Agora, faça uma incisão cutânea de três centímetros na parte inferior lateral do abdômen. Em seguida, exponha e disseque o músculo oblíquo externo. Em seguida, exponha o tecido adiposo do epidídimo ao redor do epidídimo.

Em seguida, excise cuidadosamente o tecido adiposo epididimal. Evite danificar o epidídimo, testículos e vasos sanguíneos do epidídimo. Transfira o tecido para o prato de PBS.

Em seguida, feche o rato doador e siga as práticas padrão de cuidados pós-operatórios. Isole os ASCs de dois a três gramas de tecido adiposo colhido. Digerir o tecido por uma hora em colagenase tipo A a 0,1% para obter a fração vascular estromal, ou SVF.

Após purificar o SVF, suspenda-o em 20 mililitros de meio. Divida a suspensão em dois pratos de cultura de 60 centímetros quadrados e cultive-os por 24 horas em condições padrão. No dia seguinte, lave as placas com PBS três vezes para remover quaisquer células soltas e detritos.

Após a lavagem final, adicione novamente o meio completo fresco. Em seguida, continue a passar as células até que estejam quase subconfluentes no terceiro dia de cultivo. Em seguida, usando um mililitro de 0,25% de tripsina EDTA em uma breve incubação.

Remova as células da placa. Não deixe as células serem expostas à tripsina ativa por mais de 10 minutos. Depois de observar e contar as células, subcultive-as a uma densidade de 1.700 por centímetro quadrado.

Em seguida, passe as células a cada três dias e complete três passagens antes de prosseguir. Depois de passar os ASCs de ratos subcultivados pela terceira vez, coloque 150.000 células em uma placa de cultura responsiva à temperatura de 35 milímetros de diâmetro e dois mililitros de meio de cultura. Cultive o prato por três dias em uma incubadora para fazer uma folha de células uniforme.

Três dias depois, troque o meio e adicione 16,4 microgramas por mililitro de AA. Em seguida, cultive as células, trocando o meio AA a cada dois dias. Após quatro ou cinco dias no meio contendo AA, verifique a proliferação dos ASCs. Procure lacunas entre as células e a folha de células contíguas.

Uma vez que uma folha de célula contígua é estabelecida, as células podem ser usadas para o modelo. Quando necessário, colete a folha de células colocando a placa em temperatura ambiente por 15 a 20 minutos. Como a placa é sensível à temperatura, as células se desprendem espontaneamente como uma folha contígua e a folha pode ser removida com uma pinça.

Para o modelo de cicatrização de feridas de obesidade, use ratos ZDF machos adultos, de 16 a 18 semanas de idade, pesando entre 500 e 600 gramas. Posicione e anestesiar o rato no campo cirúrgico e, antes de raspar a cabeça, limpe-a com etanol 70%. Em seguida, raspe a área operatória e limpe a pele exposta com esfoliações alternadas de etanol a 70%.

Por volta dessa época, transfira a placa sensível à temperatura das células-tronco adiposas para a bancada. Antes que a folha de célula se desprenda da placa, remova o meio e lave a folha de célula com PBS três vezes. Depois de coletar a folha de célula, mergulhe-a em PBS até que seja necessário.

Quando as células estiverem prontas, faça um defeito cutâneo de espessura total de 15 por 10 milímetros na cabeça do rato. Primeiro, remova o tecido cutâneo até o periósteo. Em seguida, excise a pele de um tecido cutâneo com um bisturi e uma tesoura cirúrgica.

Para completar o defeito, remova o periósteo com o raspatório periosteal. Em seguida, coloque a folha de célula sobre o defeito. A folha de células-tronco é macia e flexível.

Use uma pinça para estendê-lo a todos os cantos do defeito. Agora, cubra a folha celular e o defeito com um remendo de 10 por 15 milímetros de pele artificial embebida em solução salina logo antes do uso e feche a ferida com aproximadamente 10 pontos usando sutura de náilon 5-0. Para proteger a ferida, use sutura de náilon 5-0 para prender um remendo de 15 por 20 milímetros de curativo não adesivo sobre a pele artificial.

Planeje observar o curativo em dias alternados, pois o rato invariavelmente o removerá e, se necessário, substituirá o curativo imediatamente. Em dois grupos de seis ratos gordurosos diabéticos Zucker, o protocolo descrito foi usado para criar um defeito no crânio. Os ratos experimentais foram tratados com uma lâmina de células-tronco adiposas de rato, e os controles não.

Após 14 dias, as feridas do grupo de tratamento eram significativamente menores do que as dos controles. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer uma ferida grande com osso exposto em ratos e, em seguida, tratar essa ferida com células-tronco derivadas do tecido adiposo. Ao tentar este procedimento, certifique-se de usar um gerenciamento rigoroso da temperatura durante todo o processo de uso de placas de cultura responsivas à temperatura.

Caso contrário, as células podem se desprender espontaneamente dos pratos, atrasando seus experimentos.