Name: Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a diluição em série automatizada de peptídeos por dispensação acústica para determinação de potência em descoberta de fármacos. Este método minimiza a adsorção a plástico e elimina erros de carryover.

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1. Peptide Diluição Serial <ol><li> Preparar tampão de ensaio: Hanks tamponado com solução de sal (HBSS), suplementado com HEPES 25 mM, 0,1% de BSA e 3 mM-isobutil-1-metilxantina 0,5 (IBMX), pH 7,4. </li><li> Usar um distribuidor de reagente de grandes quantidades para adicionar sistematicamente 5 uL de tampão de ensaio a cada poço de cinco placas de 384 poços de baixo volume de ensaio de. <ol><li> Use software interno para criar um programa de distribuição de 5 ul volume de adição a cada poço de uma placa de 384 poços de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Mergulhe distribuição tubagem de caixa em tampão de ensaio e fluida prime. </li><li> Coloque 384 poços placa de ensaio de baixo volume no porta-placa. </li><li> Pressione começar. </li></ol></li><li> Dilui-se todas as amostras de péptidos, independentemente do veículo de armazenamento, em tampão de ensaio para produzir um péptido da 100x. NOTA: Os peptídeos que necessitam de rastreio pode ser fornecida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou o dimetilsulfóxido (DMSO) como for considerado apropriado (por exemplo, DMSO Wdoente ter um efeito deletério sobre a péptidos com modificações secundárias, tais como a PEGuilação). </li><li> Dispense 25 ul stocks peptídicas 100x em colunas 1-5 de uma microplaca de polipropileno de 384 poços acusticamente qualificado. Esta placa é designada &quot;fonte placa A &#39;. Assegurar que as placas de origem, mas não placas de destino, são de fundo plano e em conformidade com as tolerâncias acústicos específicos como definido pelo fabricante de instrumentos acústicos. </li><li> Dispense 25 ul de controlo de referência 100x em poços A23 e A24 de placa fonte A. </li><li> Pipetar 10 ul de tampão de ensaio em colunas 11-15 e 30 ul de tampão de ensaio em colunas 21-22 de placa fonte A. </li><li> Dispense tampão de ensaio de 10 mL em colunas 6-10 e 16-20 colunas de um segundo de 384 poços de microplacas de polipropileno acusticamente qualificado. Esta placa é designada &#39;placa fonte B&#39;. </li><li> Centrifugar as placas de origem A e B a 300 xg durante 1 min. Incluir uma placa de equilíbrio adequado. </li><li> Use Flui acústicad dispensadores integrado num sistema robotizado e automatizado para preparar três sequenciais 1: 100 diluições intermédias (em tampão de ensaio) de os estoques de péptidos 100x de uma coluna na fonte A. NOTA: A programação requer reformatação placa e software de dose-resposta (como fornecido pelo fabricante do distribuidor de fluido acústico) para permitir que três transferências acústicas entre Source A e Source B (veja a Figura 1 para layouts de placas). Passo 1.9 detalhes especificamente a utilização de distribuidores de fluidos usados neste laboratório sob controlo robotizado e automatizado (ver Materiais Tabela): <ol><li> placas origem de carregamento e placas de ensaio em hotel seção placa da robótica. </li><li> Abra o software automatizado robótico e de carga da placa reformatar e os protocolos de expansão programa de resposta à dose. Clique em &quot;Executar&quot;. NOTA: Automation instrui um distribuidor de fluidos acústica para transferir 250 nl de colunas 1-5 da fonte placa Um em colunas 6-10 da placa fonte B, e um segundo acoustiDistribuidor de fluido c capaz de lidar com volumes de fluido maiores para aterrar com tampão de ensaio de 15 mL para misturar. Automation, em seguida, transfere placa fonte de B para centrífuga e centrífugas em 300 g durante 1 min integrado (uma placa de equilíbrio adequado está incluído para todas as etapas de centrifugação). Fonte placa B é devolvido para o distribuidor de fluido acústico para a transferência de 250 nl de colunas 6-10 de chapa B de origem em colunas 11-15 de fonte placa A e preencher com tampão de ensaio 15 uL de mistura. Automation fonte transferências placa A para centrifugar e centrífugas a 300 xg durante 1 min integrado. Uma placa de fonte é então retornado para o distribuidor de fluido acústico para a transferência de 250 nl de colunas 11-15 de fonte Um prato em colunas 16-20 de chapa B Fonte e preencher com tampão de ensaio 15 uL de mistura. Automation, em seguida, transfere placa fonte de B para centrífuga e centrífugas integrado a 300 g durante 1 min. NOTA: Finalmente, o protocolo de resposta à dose dirige distribuição acústico para transferiro volume necessário de cada um dos 4 poços da placa de fonte diluídas em série (em ambas placa de origem A e placa fonte B) para construir uma curva de 11 pontos completo, em duplicado, em placas de ensaio (pré-cheia com tampão de ensaio 5 ul no passo 1.2 supra ). transferências de automação da placa de ensaio para centrífuga integrado e centrífugas em 300 g durante 1 min. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de células <ol><li> Descongelar as células criopreservadas de ovário de hamster chinês (CHO) que expressam o receptor de rato alvo de GLP-1 rapidamente num banho de água 37 ° C e ressuspender em 20 ml de tampão de ensaio. </li><li> suspensão de células Centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente (RT). Incluir um equilíbrio adequado. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender sedimento celular em 10 ml de tampão de ensaio. </li><li> Diluir estoque célula de 1: 1 em Trypan azul e determinar a densidade de células viáveis ​​utilizando um contador de células automatizado. Ressuspender as células em tampão de ensaio a 1,6 x 10 6 culas por ml (equivalente a 8.000 células por WELl de placas de ensaio). </li><li> Usar um distribuidor de reagente de grandes quantidades para adicionar 5 uL de suspensão de células a cada poço das placas de ensaio (contendo péptidos diluídos em série em tampão de ensaio 5 ul) e incubar à TA durante 30 min. </li></ol> Ensaio 3. HTRF Detecção de cAMP <ol><li> Traga o kit de ensaio de HTRF AMPc até à TA durante 30 min antes da utilização. </li><li> Prepare cada reagente HTRF (cryptate e d2) separadamente a diluição de 1:20 em tampão de lise (formulação proprietária, fornecido pelo fabricante do ensaio de detecção cAMP). NOTA: CUIDADO: O tampão de lise contém fluoreto de potássio (KF), que é tóxico e teratogênico 13. Para descarte, placas de ensaio contendo KF deve ser selado e incinerados, e qualquer resíduo líquido deve ser diluído na posição &lt;1 mmol / L com água antes de serem eliminados na pia. </li><li> Usar um distribuidor de reagente de grandes quantidades para adicionar reagente de criptato de 5 ul em todos os poços das placas de ensaio. </li><li> Use um distribuidor de reagente em massa para adicionar reagente d2 5 mL de ColumNS 1-22 das placas de ensaio. </li><li> Imediatamente pipetar manualmente tampão de lise 5 ul nos poços A23-D24 das placas de ensaio para dar uma ligação não específica poços de controlo (NSB), e 5 ul de reagente de D2 em poços E23-P24. </li><li> Centrifugar as placas de ensaio durante 1 minuto a 200 xg à temperatura ambiente para misturar os poços. </li><li> Cobrir as placas de ensaio para minimizar a evaporação e foto-branqueamento e incubar à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Medir sinal de fluorescência de transferência de energia de ressonância (FRET) utilizando excitação a 320 nm e emissão a 620 nm e 665 nm utilizando um leitor de placas. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Use significa NSB para subtrair fundo de todos os poços. </li><li> Calcular a% de delta F a partir da razão nm 665 nm / 620 como se segue: Rácio = (A 665 nm / 620 nm A) x 10 4 Delta F = ((Taxa de Amostra - Rácio NSB) / Proporção NSB)) x 100 onde Rácio NSB = poços com nenhum reagente D2. </li><li> Calcular a% de activatiónica entre as células não estimuladas e estimuladas com células máximo de GLP-1 o ligando como se segue: activação% = (% Delta Famostra -% células DeltaFunstimulated) / (% de células DeltaFGLP-1 estimulou% - células não estimuladas) x 100 deltaF </li><li> Analisar curvas de concentração-resposta por 4-parâmetros logísticos de análise, e o gráfico de activação%, tal como definido por um controlo de referência. </li></ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
<li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li>
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<li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917(2008).</li>
<li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening%3A+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li>
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<li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li>
<li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac.J.Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li>
<li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle%3A+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comput.+Aided+Mol.Des%22%5BJournal%5D)">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve a aplicação bem sucedida de distribuição automatizada acústico para diluir em série amostras de péptido ao longo de um intervalo de concentrações de 3 x 10 6 necessitando de menos de 1 ml de amostra. A principal vantagem deste método é o de aumentar a qualidade dos dados através de minimizar a adsorção de péptidos para utensílios de plástico através da exposição reduzida das amostras experimentais para recipientes e utensílios de plástico (tais como pontas de pipeta) que são normalment...

O GLP-1R é um alvo de droga estabelecida no tratamento de diabetes tipo 2 2. O agonista do péptido nativo para este receptor, o GLP-1, tem uma semi-vida in vivo de 2-3 min 3. A ligação do GLP-1 aos seus receptores alvo resultados acoplados a proteína G na produção a jusante do segundo mensageiro cAMP através do acoplamento à proteína G nativa para a activação da adenilil-ciclase. A medição do AMPc acumulado proporciona um ensaio robusto para monitorizar a activação do receptor e para o rastreio de activos análogos de GLP-1 com propriedades físico-químicas preferidas. Um tal ensaio requer a diluição em série de amostras de ensaio para a construção de curvas de concentração-resposta, e isto é particularmente complicado quando distribui amostras de péptidos. Possíveis erros de preparação diluição em série ponta baseada foram previamente descritos 1,4,5. Peptídeos será adsorvido pelas plasticware, resultando em estimativas de potência não confiáveis. perda de peptídeo pode ser minimizado através de tele inclusão de albumina de soro bovino (BSA) em tampões e a utilização de utensílios de plástico siliconizado, ainda de ligação da proteína permanece imprevisível. Em particular, a variação na ligação de GLP-1 para recipientes experimentais foi descrito 6. Há uma complicação adicional em que os agentes de estabilização utilizados na plasticware laboratório podem contaminar a partir de dicas e placas de microtitulação em buffers de ensaio aquosas e interferir com a função da proteína 7, 8. Portanto, métodos para reduzir a exposição a plasticware são necessárias para aumentar a precisão das medições. Acústicos dispensadores de líquidos concentrar um sinal acústico de alta frequência sobre a superfície de uma amostra de fluido, o que resulta na ejecção de gotículas nanolitros precisos em uma placa de ensaio adjacente 9. O uso de ejeção acústica é padrão na indústria farmacêutica para a preparação e triagem de grandes bibliotecas de compostos sintéticos, ea tecnologia tem sido bem validada para pequenas molecules 10. Para o nosso conhecimento, nós somos o primeiro grupo a descrever distribuição acústico para a preparação de péptidos recombinantes e sintéticos e temos relatado anteriormente a precisão melhorada em comparação com métodos baseados em ponta convencionais 1. Este artigo descreve a integração da preparação de peptídeos diluições em série e diretas por transferência acústica sem contato para um manuseamento placa sistema robótico totalmente automatizado. Um número de métodos que englobam transferência acústica de amostras foram descritos anteriormente 11. Nós utilizamos um método de dois passos para preparar as concentrações de banco de intermediários e para diluir em série análogos de péptidos para a geração da curva de dose-resposta completa. Os péptidos assim preparados são incubados com células que expressam o rato alvo de GLP-1R, e usamos um ensaio disponível comercialmente homogénea de fluorescência resolvida no tempo (HTRF) para medir a acumulação de cAMP dentro destas células como uma leitura de Activ agonistas peptídicosdade. O ensaio é robusto e propícios a um formato de alto rendimento de 384 poços e rotineiramente aplicada tanto para o desenvolvimento e ensaio de rastreio de fármacos projecta 12.

<table><tbody><tr><td>Hanks ' Solução salina balanceada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Preparado como um estoque de 0,5 M em</td></tr><tr><td>DMSO GLP-1 (7-36) amida</td><td>Bachem</td><td>H-6795</td><td>Preparado como um estoque de 1 mg/ml em PBS, referido como 'controle de referência 100x'Peptídeos</td></tr> <tr><td>de teste</td><td>Produzido internamente na MedImmune</td><td></td><td>Fornecido em várias concentrações em DMSO ou PBS, conforme apropriado</td></tr>, <tr><td>estoque de peptídeos 100x</td><td>Produzido internamente na MedImmune</td><td></td><td>Teste peptídeo diluído em tampão de ensaio para 100x a concentração final necessária</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de células Cedex XS</td><td>Placas de 384 poços Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning, baixo volume</td> Microplaca de polipropileno de 384 poços qualificada <td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Echo</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Reservatório Qualificado Echo</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 Manipulador de Líquidos</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Volumes de transferência de gotículas em incrementos de 2,5 nl</td></tr><tr><td>Echo 525 Manipulador de Líquidos</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>Volumes de transferência de gotículas em incrementos de 25 nl</td></tr><tr><td>ACell Benchtop Automation&nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>Cellario Lab Automation Software de agendamento para Life Science Robotics</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>5840300</td><td>Referido como 'dispensador de reagente a granel'HTRF</td></tr> <tr><td>cAMP Dynamic 2 kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision Multilabel Reader</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

automated acústico de distribuição para a diluição de série do peptide agonistas em potência determinação ensaios

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Tal como acontece com a descoberta de drogas de molécula pequena, o rastreio de agonistas peptídicos requer a diluição em série de péptidos para a produção de curvas de concentração-resposta. Rastreio péptidos proporciona um nível adicional de complexidade como métodos de manuseamento de amostras ponta baseada convencionais expor péptidos a uma grande área de superfície de utensílios de plástico, proporcionando uma maior oportunidade para a perda de péptido através de adsorção. Evitar a exposição excessiva aos utensílios de plástico reduz a perda de péptido através de aderência a plásticos e, portanto, minimiza a imprecisões na previsão de potência, e que descrevemos anteriormente os benefícios de acústica não-contacto para distribuir in vitro de rastreio de alto rendimento de agonistas peptídicos 1. Aqui nós discutimos uma solução de automação totalmente integrado para a preparação de não-contacto acústico de diluições em série de péptidos em placas de microtitulação, utilizando o exemplo de rastreio de péptidos agonistas no receptor de peptídeo-1 semelhante ao glucagon de ratinho (GLP-1R). Nossos métodos permitem em altaOs ensaios para o rastreio de agonistas -throughput célula com base e são facilmente escalável para suportar aumento de produção da amostra, ou para permitir o aumento do número de cópias da placa de ensaio (por exemplo, por um painel de mais linhas de células-alvo).

<html> Rotineiramente usar um método de duas etapas para diluir péptidos por via de transferência acústica. Para a primeira etapa, um distribuidor acústico alinhada com a automação é usado para criar quatro peptídicos intermediários da diluições através de duas placas de código (Figura 1a, b). Para o segundo passo, utiliza-se um distribuidor acústico para diluir ainda mais diluições imagens de placas de origem A e B para criar um intervalo de concentração...

A adsorção de peptídeos em plásticos durante diluições seriais tradicionais baseadas em ponteiras pode afetar significativamente a determinação da potência e confundir a compreensão das relações estrutura-atividade usadas para identificação de chumbo e fases de otimização de chumbo da descoberta de medicamentos. Aqui são descritos métodos para diluição serial acústica automatizada sem contato de amostras de peptídeos.

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

O objetivo geral deste protocolo automatizado para diluição seriada de amostras de peptídeos é minimizar a absorção de peptídeos em material plástico, permitindo a determinação precisa da potência em descoberta de fármacos. Este método pode aumentar a qualidade e a reprodutibilidade dos dados, e a remoção de pipetagem baseada em ponteiras também elimina a transferência cruzada de amostras, de modo que erros não sejam propagados ao longo de toda a diluição seriada. A principal vantagem desta técnica é que ela aumenta a qualidade dos dados ao minimizar a absorção de peptídeos em material plástico.Isso é particularmente importante para conduzir uma campanha de identificação de compostos ativos ou de relação estrutura-atividade no descobrimento de fármacos. Após preparar o tampão do ensaio e criar um programa de dispensação para um dispensador em massa de acordo com o protocolo descrito, mergulhe a tubulação da cassete de dispensação no tampão do ensaio e realize a purgação com o líquido. Coloque uma placa de ensaio de baixo volume com 384 poços sobre um suporte de placas.Em seguida, pressione iniciar. Dispense 25 microlitros de estoques de peptídeos 100 vezes nas colunas um a cinco de uma placa microplaca de polipropileno plana de 384 poços qualificada acusticamente, que será designada como placa-fonte A. Dispense 25 microlitros de controle de referência 100 vezes nos poços A23 e A24. Em seguida, dispense 10 microlitros de tampão de ensaio nas colunas 11 a 15 e 30 microlitros de tampão de ensaio nas colunas 21 a 22.Em seguida, distribua 10 microlitros de tampão de ensaio nas colunas seis a dez e dezesseis a vinte de uma segunda microplaca de polipropileno acusticamente qualificada com 384 poços, designada placa-fonte B. Centrifugue as placas-fonte A e B a 300 vezes g por um minuto. Em seguida, carregue as placas-fonte e as placas de ensaio na seção do hotel de placas da robótica.Em seguida, executando o software de robótica conforme o protocolo descrito, utilize dispensadores acústicos de fluido integrados ao sistema para preparar três diluições intermediárias sequenciais de um em 100. Inicie transferindo das colunas um a cinco da placa-fonte A para as colunas seis a 10 da placa-fonte B. Após preparar a primeira diluição de um em 100, permita que a automação transfira a placa-fonte B para uma centrífuga integrada e gire a 300 vezes g por um minuto antes de devolver a placa ao dispensador acústico de fluido. Em seguida, após transferir a solução da placa-fonte B para a placa-fonte A para a segunda diluição de um em 100, a automação transferirá a placa-fonte A para a centrífuga e realizará a centrifugação antes de devolver a placa ao dispensador de fluido.Por fim, após a automação transferir a solução da placa A para a B na terceira diluição em 100, a placa B é novamente centrifugada. Essas diluições de peptídeos nas placas-fonte A e B são então utilizadas para preparar curvas completas de resposta à concentração no ensaio, conforme descrito no protocolo textual. Este passo é crítico, pois uma metodologia comparativa baseada em ponteiras causa uma perda acentuada na potência da amostra devido à absorção do peptídeo ao material plástico.Descongele rapidamente células CHO criopreservadas que expressam o receptor de GLP1 de camundongo alvo em banho-maria a 37 graus e utilize 20 mililitros de tampão de ensaio para ressuspendê-las. Centrifugue a suspensão celular a 200 × g e temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e utilize 10 mililitros de tampão de ensaio para ressuspendê-lo o pellet celular.Com o Azul de Tripano, dilua o estoque de células na proporção de um para um e utilize um contador automático de células para determinar a densidade de células viáveis. Em seguida, utilize o tampão do ensaio para ressuspender as células numa concentração de 1,6 milhão de células por mililitro. Usando um dispensador de reagentes em massa, adicione cinco microlitros da suspensão celular a cada poço da placa do ensaio contendo os peptídeos diluídos em série e incube à temperatura ambiente por 30 minutos.Para realizar o ensaio de detecção de AMP cíclico, use o tampão de lise para preparar diluições de um em vinte de cada reagente de fluorescência temporalmente resolvida homogênea ou HTRF. Use um dispensador de reagentes em massa para adicionar cinco microlitros do reagente criptato a todas as cavidades das placas de ensaio. Em seguida, adicione cinco microlitros do reagente D2 às colunas um até 22 da placa.Em seguida, adicione cinco microlitros do reagente D2 nos poços E23 a P24. Imediatamente, use uma pipeta manual para adicionar cinco microlitros de tampão de lise nos poços A23 a D24, que serão utilizados como poços controle de ligação inespecífica. Centrifugue as placas do ensaio a 200 × g e temperatura ambiente por um minuto para misturar os conteúdos dos poços.Em seguida, cubra as placas e incube por uma hora. Após a incubação, utilize um leitor de placas para medir o sinal de fret com excitação em 320 nanômetros e emissão em 620 e 665 nanômetros. Analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto.O primeiro passo na transferência acústica para o ensaio de detecção de AMP cíclico é criar quatro diluições intermediárias de peptídeos estoque em duas placas fonte, conforme mostrado aqui. No segundo passo, o dispensador acústico dilui ainda mais as soluções estoque das placas fonte A e B para criar uma faixa de concentração de 11 pontos para cada peptídeo em teste, em duplicata, para 16 peptídeos diferentes. É realizada a complementação com tampão do ensaio para garantir um volume constante por poço em toda a placa do ensaio.É apresentado aqui um mapa térmico de uma placa exemplo contendo 16 peptídeos em duplicata submetidos ao ensaio de acúmulo de AMP cíclico. Valores baixos mostrados em roxo representam alta concentração de AMP cíclico. Essas curvas de concentração-resposta ilustram a reprodutibilidade dos pontos em duplicata.A amostra um representa um controle positivo para o ensaio. As amostras dois, três e quatro foram inativas e são representadas pelas linhas planas no gráfico. As amostras de cinco a dezesseis representam peptídeos de ensaio ativos.O método apresentado aqui permite a geração de curvas completas de resposta à concentração em uma ampla faixa de potência. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em três horas, embora isso dependa do número de amostras que necessitam preparação. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os peptídeos são amostras biológicas e devem ser manipulados como tal.Para manter sua integridade, devem-se evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Esta técnica abrirá caminho para pesquisadores na área da descoberta de fármacos peptídicos e permitirá previsões precisas de potência necessárias para alimentar as relações estrutura-atividade. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão da dispensação acústica automatizada para a diluição serial de peptídeos, o que minimizará a perda de peptídeos por absorção e aumentará a precisão de suas medições.Não se esqueça de que trabalhar com peptídeos biologicamente ativos com potências no nível de picomolar pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, devem sempre ser adotadas.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Padrões de Isótopos estáveis ​​e Captura de Anticorpos Anti-Peptide (SISCAPA) casais enriquecimento afinidade de peptídeos com isótopos estáveis ​​de diluição espectrometria de massa (MRM-MS) para fornecer a medição quantitativa de peptídeos como substitutos para suas respectivas proteínas. Aqui nós descrevemos o protocolo usando partículas magnéticas em um formato parcialmente automatizados.

Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Ativação persistente de inibição G receptores acoplados à proteína resulta em sensibilização da adenilil ciclase sinalização. Para identificar as vias moleculares essenciais, abordagens nonbiased são necessárias, no entanto, esta estratégia requer o desenvolvimento de um ensaio escalável sensibilização AMPc baseado em células. Relata-se um ensaio de sensibilização para a pequena molécula e triagem siRNA.

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou design. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II dimensionado para placas de 384 poços é descrito. Este formato de baixo custo deve ser útil nos campos da deimmunization proteína e design e desenvolvimento de vacinas.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Descrevemos um ensaio digital de ponto final para quantificar ácidos nucléicos com uma leitura simplificada (analógica). Medimos a fluorescência em massa de ensaios digitais baseados em gotículas usando uma máquina de qPCR padrão em vez de instrumentação especializada e confirmamos nossos resultados por microscopia.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.

Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)

Este trabalho apresenta um método que envolve a síntese e caracterização de micelas de amphiphile peptídeo monócito-direcionamento e o correspondente ensaios para testar a capacidade do micelle para vincular a monócitos e biocompatibilidade.

Síntese de monócitos-direcionamento do Peptide Amphiphile micelas para a imagem latente da aterosclerose

Este protocolo demonstra o registro em tempo real de relações completas de resposta a dose para ativação gpcr induzida por agonista a partir de uma única camada celular cultivada em um único microeletrodo usando medidas de impedância sem rótulo. O novo esquema de dosagem aumenta significativamente o throughput sem perda na resolução de tempo.

Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Neste trabalho, um ensaio de fluorescência de cálcio intracelular de alto rendimento para placas de 384 poços para rastrear pequenas bibliotecas de moléculas em receptores acoplados à proteína G recombinante (GPCRs) é descrito. O alvo, o receptor de cinina do carrapato da febre do gado, Rhipicephalus microplus, é expresso em células CHO-K1. Este ensaio identifica agonistas e antagonistas usando as mesmas células em um ensaio de "adição dupla".

Um ensaio de fluorescência de cálcio de "dupla adição" para a triagem de alto rendimento de receptores acoplados à proteína G recombinante

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho proteômico para caracterização do proteoma da superfície celular de vários tipos de células. Esse fluxo de trabalho inclui enriquecimento de proteínas de superfície celular, preparação subsequente de amostras, análise usando uma plataforma LC-MS/MS e processamento de dados com software especializado.

Fluxo de trabalho de "captura de superfície celular" para quantificação sem rótulo do proteoma da superfície celular

Aprenda a diluição em série automatizada de peptídeos por dispensação acústica para determinação de potência em descoberta de fármacos. Este método minimiza a adsorção a plástico e elimina erros de carryover.

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

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