O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste

O objetivo geral da Análise de Setores Somáticos Induzidos é fornecer uma técnica de média a alta produtividade para a caracterização funcional de genes e construtos de promotor em tecido secundário do caule de árvores em prazos comparativamente curtos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre onde e quando os genes de perigo são expressos, bem como sobre seu papel em processos biologicamente importantes, como a formação da madeira e o desenvolvimento do caule secundário. A principal vantagem desta técnica é que ela é eficiente, simples e relativamente rápida, sendo aplicável a uma ampla gama de espécies arbóreas.

Para começar, prepare um tubo limpo de 50 mililitros com tampa rosqueada contendo 19 mililitros de meio LB fresco, a 28 graus Celsius, com os antibióticos apropriados para seleção bacteriana. Adicione um mililitro de cultura de A.tumefaciens e verifique a densidade óptica, ou DO, a 600 nanômetros. Se a DO estiver acima de 0,1, dilua mais com meio LB morno. Incube a cultura de A.tumefaciens em agitador até que a DO 600 esteja entre 0,4 e 0,6.

Uma vez atingido esse ponto, centrifugue as células por 15 minutos a quatro graus Celsius e 1.000 × g. Deite o líquido do tubo e re-suspenda imediatamente o pellet celular com um mililitro de meio MS resfriado. Transfira a suspensão para um microtubo limpo de dois mililitros e mantenha em gelo até o uso.

Inicie o experimento durante a primavera ou o início do verão e selecione plantas com câmbio ativo e de crescimento rápido. Isso é confirmado se o floema puder ser facilmente destacado do xilema. Identifique um trecho reto do caule próximo à base da planta e remova todas as folhas ou ramos.

Usando um bisturi afiado, corte uma janela cambial de um centímetro quadrado criando dois cortes paralelos de 20 milímetros através do floema, separados por cinco milímetros, e, em seguida, um único corte horizontal que bisecciona os dois cortes verticais na extremidade basal. Levante a tira de floema para expor o tecido xilema em desenvolvimento. Em seguida, usando uma pipeta, adicione meio de inoculação suficiente para umedecer completamente a superfície do xilema exposto.

Imediatamente, reinsira a tira de floema no caule e fixe-a firmemente com parafilm. Repita essas etapas de inoculação para todos os genes ou promotores de interesse, criando novas janelas cambiais pelo menos um centímetro acima ou abaixo das janelas existentes e com um deslocamento de 90 graus. Além disso, inocule as janelas com os vetores de controle positivo e negativo no mesmo caule ou caules, juntamente com as inoculações experimentais.

Monitore periodicamente o crescimento do caule e, assim que for observado um crescimento radial de pelo menos cinco milímetros, colete o tecido para um ensaio de beta-glicosidase, ou ensaio GUS. Para coletar o material-teste, remova primeiro a janela cambial do caule, eliminando qualquer tecido que não faça parte do novo crescimento. Para estudos relacionados à morfologia de células ou tecidos de xilema e floema maduros, separe o floema do xilema.

Alternativamente, para investigações que exijam a manutenção da zona cambial intacta ou a avaliação de padrões de expressão de promotor, corte a janela cambial transversalmente usando uma lâmina de barbear para criar discos com espessura entre 0,5 e um milímetro. Coloque os tecidos da janela cambial coletados em tubos individuais de fundo redondo de 14 mililitros e lave duas vezes em tampão fosfato 0,1 molar, pH 7, durante cinco minutos cada vez, garantindo que o tecido fique completamente submerso. Ao final da segunda lavagem, tenha cuidado para remover toda a solução em excesso.

Em seguida, adicione cinco mililitros do reagente GUS a cada tubo. Se isso não cobrir completamente a amostra de tecido, adicione mais reagente. Incube os tubos por dez minutos a 55 graus Celsius no escuro.

Em seguida, incubar os tubos por mais 12 a 16 horas em agitador a 37 graus Celsius, no escuro, com agitação suave. Após a retirada do incubador, coletar um subconjunto aleatório dos tubos e verificar o pH do reagente GUS utilizando papel de tornassol com faixa de pH de zero a sete. Se algum deles apresentar pH inferior a seis, rotulá-los e verificar o restante dos tubos.

Rotule e exclua todos os tubos com pH inferior a seis. Decante o reagente GUS dos tubos e substitua por etanol a 70 por cento em quantidade suficiente para cobrir o tecido. Armazene as amostras a quatro graus Celsius até o momento de uso.

Usando um par limpo de pinças, remova todo o tecido da janela cambial de um tubo de amostra e coloque-o em uma bandeja pequena ou em uma placa de Petri para visualização microscópica. Coloque a amostra sob a lente de um microscópio estereoscópico com ampliação entre 1X e 4X e identifique e conte o número de células ou tecidos que exibem coloração azul intensa. Em exemplos nos quais o floema foi removido, conte o número de setores no tecido cambial encontrados na superfície do xilema em desenvolvimento.

Para amostras cortadas em discos, conte o número de setores encontrados nos diferentes tipos celulares ou teciduais. Certifique-se de examinar ambos os lados do disco e de correlacionar os setores que ocorrem em dois discos diferentes, para garantir que os números não sejam superestimados. Coloque de volta no tubo contendo etanol a 70 por cento apenas o tecido que contém os setores e armazene até o momento de uso.

Repita a análise para todas as janelas cambiais adicionais coletadas, incluindo os controles positivo e negativo. Para auxiliar na identificação precisa na classificação dos setores, sugerimos que você se familiarize com a anatomia e o desenvolvimento do caule secundário, incluindo as respostas do caule a lesões. Esta figura mostra várias transformações bem-sucedidas observadas como regiões de coloração azul.

Um exemplo de janela de descascamento do floema exibe múltiplos setores transformados e discos coletados de duas espécies de árvores, mostrando setores de transformação e crescimento radial subsequente. A transformação em uma variedade de tipos de tecidos também pode ser observada. Aqui, setores do caule podem ser vistos no periderma, floema, parênquima de ferimento e várias outras regiões teciduais do álamo-branco.

Esta imagem mostra os resultados da expressão de promotores gênicos em derivados cambiais. Neste exemplo, observamos a proporção de coloração em cada tipo de tecido em um ensaio envolvendo uma variedade de promotores CesA de Eucalyptus grandis transformados em híbridos de eucalipto. A expressão no floema, no xilema em desenvolvimento e no xilema desenvolvido é representada em porcentagem.

O número médio de eventos de transformação por centímetro de câmbio inoculado também pode ser calculado para cada promotor ou gene de interesse. Esta tabela mostra os dados para setores típicos identificados em eucalipto e álamo transformados com um controle positivo ou promotor de interesse, analisados utilizando o método de colheita em disco. Uma vez dominada, esta técnica pode fornecer um método rápido, eficiente e amplamente aplicável para dissecar a natureza complexa da diferenciação cambial com formação no desenvolvimento secundário do caule.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar plantas e bactérias, como transformar, cultivar e colher caules, bem como como identificar e classificar tecidos transgênicos para avaliação fenotípica.