Name: O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Aprenda a técnica ISSA para caracterização funcional de genes e promotores no tecido secundário do caule de árvores. Este método eficiente e rápido facilita pesquisas sobre formação da madeira e desenvolvimento vegetal.

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Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro para aspectos do trabalho por meio de Linkage Grants LP0776563 (GB, AS) e LP0211919 (GB) e parceiros da indústria Sappi e Mondi, bem como Australian Postgraduate Award (EM) do Australian Research Council e Young Innovators and Scientist Award através do Departamento Australiano de Agricultura (LT). Também gostaríamos de agradecer a Zander Myburg, Qing Wang, Colleen MacMillan e Simon Southerton pelas muitas discussões e ideias que apresentaram durante o desenvolvimento deste protocolo e a Martin Ranik, Minique De Castro, Julio Najera, Valerie Frassiant, Angelique Manuel e Noemie Defaix pela assistência no trabalho relacionado ao laboratório.

<ol><li>Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+plant+and+plant+part+transgenic+approaches+in+the+study+of+wood+formation+-+benefits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22TPJ%22%5BJournal%5D)">Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations.</a> TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).</li>
<li>Chaffey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood+formation+in+forest+trees%3A+from+Arabidopsis+to+Zinnia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia.</a> Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).</li>
<li>Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation%2C+secondary+cell-wall+formation+and+transformation+of+callus+tissue+of+Pinus+radiata+D.+Don%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don.</a> Planta. 217 (5), 736-747 (2003).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+in+vitro+transformation+of+wood-producing+stem+segments+in+eucalypts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts.</a> Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).</li>
<li>Plasencia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eucalyptus+hairy+roots%2C+a+fast%2C+efficient+and+versatile+tool+to+explore+function+and+expression+of+genes+involved+in+wood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech+J%22%5BJournal%5D)">Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation.</a> Plant Biotech J. , (2015).</li>
<li>Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+cambial+tissue+in+vivo+provides+efficient+means+for+Induced+Somatic+Sector+Analysis+%28ISSA%29+and+gene+testing+in+stems+of+woody+plants+species%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species.</a> Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+dormant+lateral+buds+in+poplar+trees+reveals+developmental+patterns+in+secondary+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues.</a> Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).</li>
<li>Spokevicius, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-tubulin+affects+cellulose+microfibril+orientation+in+plant+secondary+fiber+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls.</a> Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).</li>
<li>MacMillan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fasciclin-like+arabinogalactan+protein+family+of+Eucalyptus+grandis+contains+members+that+impact+wood+biology+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics.</a> New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).</li>
<li>Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+somatic+sector+analysis+of+cellulose+synthase+%28CesA%29+promoter+regions+in+woody+stem+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues.</a> Planta. 237 (3), 799-812 (2013).</li>
<li>Hussey, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SND2%2C+a+NAC+transcription+factor+gene%2C+regulates+genes+involved+in+secondary+cell+wall+development+in+Arabidopsis+fibers+and+increases+fiber+cell+area+in+Eucalyptus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus.</a> BMC Plant Biology. 11, (2011).</li>
<li>Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+ARBORKNOX1+delays+the+differentiation+of+induced+somatic+sector+analysis+%28ISSA%29+derived+xylem+fiber+cells+in+poplar+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Genet.+Genomes%22%5BJournal%5D)">Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems.</a> Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).</li>
<li>Baldacci-Cresp, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PtaRHE1%2C+a+Populus+tremula+x+Populus+alba+RING-H2+protein+of+the+ATL+family%2C+has+a+regulatory+role+in+secondary+phloem+fiber+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development.</a> Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bio-assays+with+tobacco+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).</li>
<li>Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHawkins%2C+S+%22Wood+formation+in+trees%3A+Cell+and+Molecular+Biology+Techniques%22">Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques</a>. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).</li>
<li>Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+expression+and+specific+elimination+of+endogenous+beta-glucuronidase+activity+in+transgenic+and+nontransgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants.</a> Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).</li>
<li>Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+eliminating+endogenous+beta-glucuronidase+background+in+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley.</a> Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo ISSA é um método relativamente simples e eficiente para a criação de tecidos estaminais transgénicas em espécies de árvores, no espaço de alguns meses por análise de genes e promotores de interesse envolvido na madeira e haste formação. Pouco de esforço, além de manter as plantas vivas, é necessária a crescer tecido do caule transgênica após a inoculação, que está em contraste com métodos in vitro em que é necessária extensa cultura de manter tecido ou plantas, onde a produção de madeira pode levar ...

Árvore de caules compreendem uma quantidade significativa de biomassa planetas e são de grande importância biológica, cultural e comercial. Hastes secundárias criar habitat, fornecendo recursos e abrigo para muitas outras formas de vida. Eles oferecem muitos outros serviços aos ecossistemas que habitam e agem como um recurso renovável para a produção de madeira, papel e celulose e outros produtos madeireiros e não-madeireiros. desenvolvimento secundária da haste e, mais especificamente, a formação da madeira é regulada pelo sistema complexo molecular que regulam o desenvolvimento de tipos específicos de células, a composição bioquímica das suas paredes celulares e como eles estão dispostos para formar tecidos e órgãos. Dissecando a base molecular do desenvolvimento secundária da haste e formação da madeira é confundida por muitos fatores, incluindo a variabilidade das propriedades da madeira e tronco dentro e entre as hastes, longos tempos de geração, sistemas de Cruzamento de acasalamento, alta heterozigosidade, alta carga genética, dormência sazonal, a longo maduroperíodos estabelecimento traço e o tamanho físico absoluto de árvores maduras. Como resultado, a compreensão do desenvolvimento secundária da haste em relação ao conhecimento detalhado da maioria dos outros aspectos do controle molecular do desenvolvimento da planta, ainda está em sua infância. Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados para estudar o desenvolvimento e compreender secundária da haste, em especial de madeira e a formação da parede celular secundária. Esses protocolos envolvem a utilização de sistemas de parte de planta ou planta inteira, em que ou as plantas transgénicas são criadas ou células ou tecidos específicos secundários são transformados para o estudo de aspectos específicos de madeira e / ou desenvolvimento de uma haste secundária. As plantas transgénicas podem ser recuperados transformação pós genética a partir de uma ampla variedade de tecidos de plantas e tipos de células, no entanto, o progresso é lento, especialmente quando se analisa os traços de fibras de madeira devido à longa regeneração e haste tempos de maturação (na ordem de anos), alta técnica e Deman de trabalhods, baixa taxa de transferência de genes candidatos, bem como dificuldades na propagação de algumas espécies de plantas lenhosas. Técnicas similares têm sido desenvolvidos no sistema de modelo não-lenhoso, como Arabidopsis que com sucesso superar algumas destas limitações, mas nem todos os tipos de células-tronco secundárias um presente nestes caules e caracteres relacionados à sazonalidade ou a longevidade não pode ser estudada em tais espécies 2. Alternativamente, sistemas de parte da planta, tais como Pinu s radiata calos 3 reduzir os prazos associados. Estes métodos são, no entanto restringida ao estudo de um tipo de célula individual e sofrem restrições semelhantes como observado em experiências in vitro. Da mesma forma, as culturas-tronco apicais 4 envolvendo explantes-tronco inteiros mostraram-se promissores, mas ainda não foram aplicadas para o estudo de genes ou promotores de interesse específicos. Mais recentemente, um protocolo alternativo envolvendo culturas de raízes peludas tem sido desenvolvido para o eucalipto e tem sido êxitoaplicada 5, no entanto, este método ainda requer cultivo in vitro, envolve raízes secundárias em vez de hastes e até hoje ela é limitada a uma única espécie de árvore. Induzida análise do sector somáticas (ISSA), conforme descrito aqui, foi desenvolvido para superar alguns desses problemas fornecendo um meio de alto rendimento ferramenta de triagem funcional para genes e promotores com papéis suspeitos na formação da madeira e desenvolvimento do tecido secundária da haste. ISSA é uma transformação e rastreio sistema in vivo que foi desenvolvido para reduzir o tempo necessário para a produção de células transgénicas e o tecido de uma haste secundária intacta, enquanto a superação de trabalho, limitações técnicas e taxa de transferência de rotina usado em métodos in vitro. Os protocolos aqui descritos permitem a criação simultânea de centenas de sectores tecido transformado de forma independente e células em hastes secundárias dentro de um curto período de tempo, nas espécies de árvores e tecido de interesse sem gvariação enetic e / ou ambiental dentro de prazos relativamente curtos e de baixo custo de trabalho. ISSA em técnicas in vivo foram primeiramente descrita por secundária da haste 6 e botão 7 tecidos e desde então foi refinado no tecido secundária da haste através de estudos de genes e / ou promotores envolvidos na diferenciação cambial e incluem: tubulina (TUB) 8, a fasciclina-like arabinogalactan ( FLA) 9, sintase celulose (CESA) 10, célula domínio NAC associada a parede secundária (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e realmente proteína interessante novo gene (ANEL) H2 13. Estes estudos foram realizados no secundário caules de plantas de álamo e de eucalipto e fornecidos insights sobre a morfologia das células, química da parede celular e expressão gênica. Os protocolos descritos aqui têm a intenção de reunir a experiência de umnd conhecimento adquirido através do desenvolvimento e aplicação de ISSA de uma série de estudos publicados e não publicados durante a última década. Eles se concentram na transformação in vivo de tecidos secundária da haste 6 e concentrar-se em estudos envolvendo clone Populus alba &#39;pyramidalis&#39;, Eucalyptus globulus, bem como 11 Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento leva pesquisadores através do protocolo a partir do cultivo de plantas e bactérias, a transformação de tecidos do caule, crescimento e colheita de tecido, de identificação das células transgénicas e tecidos, de preparação para as avaliações fenotípicas e métodos para a recolha e análise de dados. Embora as técnicas de sucesso têm sido aplicados para medir a composição monosaccharide parede celular também 9,11, devido a limitações de espaço, este documento concentra-se em técnicas utilizadas para medir celular e morfologia do tecido e compreender os padrões de expressão de genes em r secundárioems somente. Assim, o protocolo como descrito é ideal para quem procura obter mais insights sobre o papel e / ou expressão de genes ligados ao secundário hastes usando um baixo custo, tecnicamente fácil, e médio e método de alto rendimento.

<table><tbody><tr><td>Plantas</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Consulte os fornecedores locais de viveiros para plantas, conforme necessário</td></tr><tr><td>Cepa de Agrobacterium</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Existem muitos caminhos possíveis para obter cepas de Agrobactrium. Sugerimos que você faça o acompanhamento em sua comunidade de pesquisa local, pois pode haver restrições na obtenção da bactéria em seu país e região.</td></tr><tr><td>Vetor binário (gene e promotor)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Desenvolvemos uma gama de vetores para atender ao protocolo ISSA usando um sistema Gateway Recombinase. Isso inclui superexpressão, nocautes de RNAi e vetores de fusão de promotores baseados em vetores pCAMBIA modificados e felizes em fornecer conforme necessário. Além disso, existem muitos vetores disponíveis para a comunidade de pesquisa.</td></tr><tr><td>Mídia LB</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>Mídia LB com ágar</td><td>Sigma</td><td>L2897</td><td>Um produto semelhante pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Sigma</td><td>NA</td><td>O número de catálogo dependerá do antibiótico que você precisa, pois uma variedade de antibióticos é usada para seleção bacteriana em vetores binários. Este produto pode ser proveniente de um&nbsp; gama de empresas</td></tr><tr><td>50 ml Tubos com tampa de rosca</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>2 ml Microtube</td><td>Watson Bio Lab</td><td>132-620C</td><td>O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>MS Media</td><td>Sigma</td><td>M9274</td><td>O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>Lâmina de bisturi nº 11</td><td>Sigma</td><td>S2771</td><td>O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td>Este é o melhor produto para usar para ligar a criação do poste da janela cambial&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de 14 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>150268</td><td>O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>X-Gluc</td><td>X-GLUC direto</td><td></td><td>Você precisará ir ao site para fazer o pedido - http://www.x-gluc.com/index.html</td></tr><tr><td>Ferricianeto de Potássio (III)</td> <td>Sigma</td><td>244023</td><td>O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>Ferrocianeto de Potássio (II)</td> <td>Sigma</td><td>P9387</td><td>O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>Papel de tornassol</td><td>Sigma</td><td>WHA10360300</td><td>O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de borda única</td><td>ProSciTech</td><td>L055</td><td>O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear de borda dupla</td><td>ProSciTech</td><td>L056</td><td>O mesmo produto pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>SEM Pin Stub</td><td>ProSciTech</td><td>GTP16111</td><td>O mesmo produto pode ser proveniente de outra empresa</td></tr><tr><td>Frasco de amostra com tampa de rosca</td><td>ProSciTech</td><td>L6204</td><td>O mesmo produto pode ser obtido de outra empresa</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>sigma</td><td>E7023</td><td>O mesmo produto pode ser proveniente de outra empresa</td></tr><tr><td>LR branco</td><td>ProSciTech</td><td>C025</td><td>O mesmo produto pode ser proveniente de outra empresa</td></tr><tr><td>Molde de Incorporação</td><td>ProSciTech</td><td>RL090</td><td>Recomendamos esta variedade, no entanto, há muitas opções disponíveis</td></tr><tr><td>Água Mídia de montagem Soulable</td><td>ProSciTech</td><td>IA019</td><td>Um exemplo de mídia de montagem que poderia ser usada, no entanto, existem outras opções e podem ser exploradas.</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>Um produto semelhante pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td>Um produto semelhante pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>ProSciTech</td><td>C138</td><td>Um produto semelhante pode ser adquirido de outra empresa</td></tr><tr><td>Quanta Environmental Scanning Electron Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td>Este é o instrumento usado em parte deste estudo, mas qualquer outro SEM que tenha um modo de baixo vácuo pode ser utilizado,</td></tr> o <tr>software <td></td><td></td> de<td>imagem ImageJ</td><td>pode ser obtido no seguinte URL http://rsbweb.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

o uso de induced somatic análise sector (issa) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e desenvolvimento secundária da haste

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

crescimento do caule secundário em árvores e formação da madeira associada são significativos tanto a partir de perspectivas biológicas e comerciais. No entanto, pouco se sabe sobre o controle molecular que regula o seu desenvolvimento. Isto é em parte devido à física, recursos e limitações de tempo, muitas vezes associada ao estudo dos processos de crescimento secundários. Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados envolvendo qualquer parte da planta ou planta inteira em sistema tanto espécies lenhosas e plantas não-lenhosas. No entanto, as perguntas sobre a sua aplicabilidade para o estudo dos processos de crescimento secundária da haste, a recalcitrância de determinadas espécies e intensidade de trabalho são muitas vezes proibitivos para médias e aplicações de alto débito. Além disso, quando se olha para a formação de desenvolvimento do caule e madeira secundário as características específicas sob investigação só poderia tornar-se mensurável no final do ciclo de vida de uma árvore depois de vários anos de crescimento. Em resposta a estes desafios alternativa in vivo protocols foram desenvolvidos, com o nome Induced Somatic Análise Sectorial, que envolvem a criação de setores de tecidos somáticos transgênicos diretamente no secundária da haste da planta. O objectivo do presente protocolo é o de proporcionar um meio eficiente, simples e relativamente rápido para a criação de tecido de planta transgénica secundário para o gene e o promotor de caracterização funcional que pode ser utilizado numa gama de espécies de árvores. Os resultados aqui apresentados mostram que os sectores secundária da haste transgénicas podem ser criados em todos os tecidos vivos e de tipos de células em hastes secundárias de uma variedade de espécies de árvores e que a madeira características morfológicas como também os padrões de expressão do promotor em hastes secundárias pode ser facilmente avaliada facilitar média a alta caracterização funcional de transferência.

Usando este protocolo todos os tipos de células estaminais e de tecidos vivos secundárias têm sido mostrados para ser susceptíveis a A. tumefaciens e transformações foram definidos em tipos sector com base no tipo de células inicialmente transformada e que o padrão de crescimento subsequente desenvolvimento. Tipos sector incluem periderme, floema, cambial, parênquima de feridas e tilose (Figura 1b, 1c, 1d) e podem ser encontrado...

Aqui apresentamos um protocolo que facilita a caracterização funcional de médio a alto rendimento de construções de genes e promotores em tecidos secundários de árvores em prazos comparativamente curtos. É eficiente, fácil de usar e amplamente aplicável a uma variedade de espécies de árvores.

O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

O objetivo geral da Análise de Setores Somáticos Induzidos é fornecer uma técnica de média a alta produtividade para a caracterização funcional de genes e construtos de promotor em tecido secundário do caule de árvores em prazos comparativamente curtos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre onde e quando os genes de perigo são expressos, bem como sobre seu papel em processos biologicamente importantes, como a formação da madeira e o desenvolvimento do caule secundário. A principal vantagem desta técnica é que ela é eficiente, simples e relativamente rápida, sendo aplicável a uma ampla gama de espécies arbóreas.Para começar, prepare um tubo limpo de 50 mililitros com tampa rosqueada contendo 19 mililitros de meio LB fresco, a 28 graus Celsius, com os antibióticos apropriados para seleção bacteriana. Adicione um mililitro de cultura de A.tumefaciens e verifique a densidade óptica, ou DO, a 600 nanômetros. Se a DO estiver acima de 0,1, dilua mais com meio LB morno. Incube a cultura de A.tumefaciens em agitador até que a DO 600 esteja entre 0,4 e 0,6.Uma vez atingido esse ponto, centrifugue as células por 15 minutos a quatro graus Celsius e 1.000 × g. Deite o líquido do tubo e re-suspenda imediatamente o pellet celular com um mililitro de meio MS resfriado. Transfira a suspensão para um microtubo limpo de dois mililitros e mantenha em gelo até o uso.Inicie o experimento durante a primavera ou o início do verão e selecione plantas com câmbio ativo e de crescimento rápido. Isso é confirmado se o floema puder ser facilmente destacado do xilema. Identifique um trecho reto do caule próximo à base da planta e remova todas as folhas ou ramos.Usando um bisturi afiado, corte uma janela cambial de um centímetro quadrado criando dois cortes paralelos de 20 milímetros através do floema, separados por cinco milímetros, e, em seguida, um único corte horizontal que bisecciona os dois cortes verticais na extremidade basal. Levante a tira de floema para expor o tecido xilema em desenvolvimento. Em seguida, usando uma pipeta, adicione meio de inoculação suficiente para umedecer completamente a superfície do xilema exposto.Imediatamente, reinsira a tira de floema no caule e fixe-a firmemente com parafilm. Repita essas etapas de inoculação para todos os genes ou promotores de interesse, criando novas janelas cambiais pelo menos um centímetro acima ou abaixo das janelas existentes e com um deslocamento de 90 graus. Além disso, inocule as janelas com os vetores de controle positivo e negativo no mesmo caule ou caules, juntamente com as inoculações experimentais.Monitore periodicamente o crescimento do caule e, assim que for observado um crescimento radial de pelo menos cinco milímetros, colete o tecido para um ensaio de beta-glicosidase, ou ensaio GUS. Para coletar o material-teste, remova primeiro a janela cambial do caule, eliminando qualquer tecido que não faça parte do novo crescimento. Para estudos relacionados à morfologia de células ou tecidos de xilema e floema maduros, separe o floema do xilema.Alternativamente, para investigações que exijam a manutenção da zona cambial intacta ou a avaliação de padrões de expressão de promotor, corte a janela cambial transversalmente usando uma lâmina de barbear para criar discos com espessura entre 0,5 e um milímetro. Coloque os tecidos da janela cambial coletados em tubos individuais de fundo redondo de 14 mililitros e lave duas vezes em tampão fosfato 0,1 molar, pH 7, durante cinco minutos cada vez, garantindo que o tecido fique completamente submerso. Ao final da segunda lavagem, tenha cuidado para remover toda a solução em excesso.Em seguida, adicione cinco mililitros do reagente GUS a cada tubo. Se isso não cobrir completamente a amostra de tecido, adicione mais reagente. Incube os tubos por dez minutos a 55 graus Celsius no escuro.Em seguida, incubar os tubos por mais 12 a 16 horas em agitador a 37 graus Celsius, no escuro, com agitação suave. Após a retirada do incubador, coletar um subconjunto aleatório dos tubos e verificar o pH do reagente GUS utilizando papel de tornassol com faixa de pH de zero a sete. Se algum deles apresentar pH inferior a seis, rotulá-los e verificar o restante dos tubos.Rotule e exclua todos os tubos com pH inferior a seis. Decante o reagente GUS dos tubos e substitua por etanol a 70 por cento em quantidade suficiente para cobrir o tecido. Armazene as amostras a quatro graus Celsius até o momento de uso.Usando um par limpo de pinças, remova todo o tecido da janela cambial de um tubo de amostra e coloque-o em uma bandeja pequena ou em uma placa de Petri para visualização microscópica. Coloque a amostra sob a lente de um microscópio estereoscópico com ampliação entre 1X e 4X e identifique e conte o número de células ou tecidos que exibem coloração azul intensa. Em exemplos nos quais o floema foi removido, conte o número de setores no tecido cambial encontrados na superfície do xilema em desenvolvimento.Para amostras cortadas em discos, conte o número de setores encontrados nos diferentes tipos celulares ou teciduais. Certifique-se de examinar ambos os lados do disco e de correlacionar os setores que ocorrem em dois discos diferentes, para garantir que os números não sejam superestimados. Coloque de volta no tubo contendo etanol a 70 por cento apenas o tecido que contém os setores e armazene até o momento de uso.Repita a análise para todas as janelas cambiais adicionais coletadas, incluindo os controles positivo e negativo. Para auxiliar na identificação precisa na classificação dos setores, sugerimos que você se familiarize com a anatomia e o desenvolvimento do caule secundário, incluindo as respostas do caule a lesões. Esta figura mostra várias transformações bem-sucedidas observadas como regiões de coloração azul.Um exemplo de janela de descascamento do floema exibe múltiplos setores transformados e discos coletados de duas espécies de árvores, mostrando setores de transformação e crescimento radial subsequente. A transformação em uma variedade de tipos de tecidos também pode ser observada. Aqui, setores do caule podem ser vistos no periderma, floema, parênquima de ferimento e várias outras regiões teciduais do álamo-branco.Esta imagem mostra os resultados da expressão de promotores gênicos em derivados cambiais. Neste exemplo, observamos a proporção de coloração em cada tipo de tecido em um ensaio envolvendo uma variedade de promotores CesA de Eucalyptus grandis transformados em híbridos de eucalipto. A expressão no floema, no xilema em desenvolvimento e no xilema desenvolvido é representada em porcentagem.O número médio de eventos de transformação por centímetro de câmbio inoculado também pode ser calculado para cada promotor ou gene de interesse. Esta tabela mostra os dados para setores típicos identificados em eucalipto e álamo transformados com um controle positivo ou promotor de interesse, analisados utilizando o método de colheita em disco. Uma vez dominada, esta técnica pode fornecer um método rápido, eficiente e amplamente aplicável para dissecar a natureza complexa da diferenciação cambial com formação no desenvolvimento secundário do caule.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar plantas e bactérias, como transformar, cultivar e colher caules, bem como como identificar e classificar tecidos transgênicos para avaliação fenotípica.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Um método baseado em microscopia confocal Raman é apresentado que proporciona rótulo sem visualização de lignina na parede celular das plantas e comparação de lignificação em diferentes tecidos, amostras ou espécies.

Label-free In situ Imaging de lignificação na parede celular das plantas

A composição da parede celular vegetal varia entre os tipos de tecido e pode incluir lignina, celulose, hemiceluloses e pectina. Várias técnicas de coloração foram desenvolvidas para visualizar as diferenças no nível do tipo de célula. Este artigo é uma compilação de técnicas de coloração da parede celular comumente usadas.

Coloração histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celular Secundária parede Elements

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo como amostrar amostras de madeira para a avaliação geral de suas estruturas de crescimento. São descritas as técnicas de preparação e visualização macro e microscópicas necessárias para gerar conjuntos de dados anatômicos e dendroecológicos de madeira bem replicados e altamente resolvidos.

Uma perspectiva técnica em Modern Tree-anel Research - Como superar dendroecologia e Madeira anatômicas Desafios

O Sistema Induzível de Raiz Lateral (LRIS) permite a indução síncrona de raízes laterais e é apresentado para Arabidopsis thaliana e milho.

Lateral Root Inducible sistema no<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E Milho

No nível subcelular, os eventos de sinalização são modulados dinamicamente por pistas ambientais e de desenvolvimento. Aqui descrevemos um protocolo que emprega o sistema de expressão transitória do tabaco para monitorar a interação dinâmica proteína-proteína e revelar a organização espacial da transdução de sinal em células vegetais.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Apresentamos aqui um protocolo para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas humanas em cada derivado do somite (Miótomo, sclerotome, dermátomo e syndetome) em condições quimicamente definidas, que tem aplicações em modelagem de doenças futuras e terapias baseadas em células em cirurgia ortopédica.

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

Aqui, descrevemos a geração e aplicação de um conjunto de transgénicos Arabidopsis thaliana linhas permitindo expressão inducible, tecido-específica nos três os meristemas principais, a meristema apical de atirar, a meristema apical de raiz e o cambium.

Inducible, expressão de tipo específico de célula em Arabidopsis thaliana mediada através de LhGR Trans-ativação

A viabilidade e a eficácia de métodos scRNA-seq de alto rendimento anunciam uma era de célula única na pesquisa de plantas. Apresentamos aqui um procedimento robusto e completo para o isolamento de tipos específicos de células de raízes de Arabidopsis thaliana e posterior construção e análise da biblioteca de transcriptomas.

Isolamento e Análise do Transcriptoma de Tipos Celulares Vegetais

Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

Aprenda a técnica ISSA para caracterização funcional de genes e promotores no tecido secundário do caule de árvores. Este método eficiente e rápido facilita pesquisas sobre formação da madeira e desenvolvimento vegetal.

O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste (Vídeo) | JoVE Journal

O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste

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