Métodos para o isolamento, Cultura e caracterização funcional de SINOATRIAL Nó miócitos de ratos adultos

O objetivo geral deste procedimento é isolar miócitos de nódulos sinoatriais espontaneamente ativos de camundongos para experimentos eletrofisiológicos ou de imagem de curto ou médio prazo. Os miócitos isolados do nó sinoatrial são importantes para o estudo dos mecanismos de marcapasso cardíaco, em particular o estudo de correntes iônicas específicas ou tempo de liberação de cálcio intracelular. Mas relativamente poucos laboratórios usam miócitos sinoatriais isolados de camundongos, em parte porque é muito difícil aprender o procedimento apenas com métodos escritos.

Depois de preparar todas as soluções necessárias para o isolamento, retire o pelo do peito do animal com uma tesoura. Em seguida, corte a caixa torácica para expor a cavidade torácica usando uma pinça de tecido externo e uma tesoura de dissecção. Enxágüe a cavidade torácica com dois mililitros de Tyrode completo aquecido com heparina.

Sob um microscópio de dissecação, remova cuidadosamente os pulmões e o timo usando uma tesoura interna e uma pinça de dissecação. Enquanto segura suavemente o ápice do coração, corte cuidadosamente a veia cava inferior e a aorta para remover o coração da cavidade torácica. Em seguida, transfira o coração para uma das placas de dissecação de silicone e enxágue-o com dois a quatro mililitros de Tyrode completo heparinizado aquecido.

Oriente o coração de forma que os vasos posteriores fiquem visíveis e voltados para cima. Em seguida, imobilize o coração prendendo-o através do ápice na placa de dissecação de silicone. Depois, localize o sulco entre os ventrículos e os átrios.

Usando a tesoura de dissecção interna, faça uma incisão no sulco, mantendo-o próximo aos ventrículos. Lave a ranhura e a incisão com Tyrode completo heparinizado aquecido adicional, conforme necessário, para permitir uma visão clara dos átrios e das válvulas. Em seguida, continue a cortar ao longo da ranhura para separar os átrios dos ventrículos.

Em seguida, transfira o tecido atrial para a segunda placa de dissecção de silicone e enxágue-a com três mililitros de Tyrode completo heparinizado aquecido. Depois, enquanto estica a preparação suavemente, prenda o tecido através da veia cava inferior. Em seguida, vire o tecido para que o átrio direito do animal esteja agora no lado esquerdo do experimentador e o átrio esquerdo esteja no lado direito do experimentador.

É muito importante obter e reconhecer a orientação para isolar o tecido correto. Prossiga para fixar o tecido através da veia cava superior e, em seguida, dos apêndices atriais direito e esquerdo. Remova qualquer gordura restante ou outro tecido para permitir uma visão clara da preparação.

Posteriormente, abra a parede anterior dos átrios cortando as veias cavas. Gire o prato conforme necessário para dissecar as veias cavas superior e inferior. Reposicione os pinos conforme necessário para visualizar o septo interatrial.

Em seguida, corte ao longo do septo interatrial para remover o átrio esquerdo. Fixe novamente a preparação, estique-a suavemente e remova a gordura de trás do nó sinoatrial. Depois disso, remova o apêndice atrial direito e libere o nó sinoatrial cortando ao longo da crista terminal, que aparece como uma faixa laranja escura que faz fronteira com o apêndice atrial.

Fixe ou solte o tecido nodal e corte-o lateralmente para produzir três tiras de tamanhos iguais. Neste procedimento, usando a pipeta estreita polida a fogo, transfira três tiras de tecido do nó sinoatrial para o primeiro dos três pequenos tubos de fundo redondo contendo 2,5 mililitros de Tyrode de baixo cálcio e magnésio e incube por cinco minutos. Após cinco minutos, transfira as tiras de tecido para o segundo pequeno tubo inferior redondo contendo 2,5 mililitros de Tyrode com baixo teor de cálcio e magnésio.

Lave as tiras de tecido girando suavemente o tubo ou pipetando suavemente com a pipeta estreita. Não inverta o tubo. Em seguida, transfira as tiras de tecido para o terceiro pequeno tubo inferior redondo contendo 2,5 mililitros de Tyrode de baixo teor de cálcio e magnésio e repita a etapa de lavagem.

Depois, transfira as tiras para o tubo inferior redondo grande contendo 2,5 mililitros de Tyrode de baixo cálcio e magnésio com enzimas. Misture a cada cinco minutos girando suavemente o tubo. Após a digestão enzimática, use uma pipeta estreita polida a fogo para transferir suavemente as tiras de tecido para o primeiro dos três pequenos tubos de fundo redondo contendo solução KB modificada.

Em seguida, transfira as tiras através do segundo e terceiro tubos inferiores redondos pequenos para lavar o tecido antes de transferir para o tubo inferior redondo grande que contém a solução KB. Usando a pipeta maior polida a fogo, dissocie as células no tubo inferior redondo grande por trituração constante, tomando cuidado para manter o tubo de dissociação submerso no banho-maria de 35 graus Celsius e para evitar a introdução de bolhas na solução. Descobrimos que uma expulsão forçada da solução a uma frequência de aproximadamente um por segundo ou um Hertz funciona melhor.

Agora adicione 75 microlitros de solução de adaptação de cloreto de cálcio cloreto de sódio aos tecidos. Agite suavemente para misturá-los e incubá-los por cinco minutos. Continue a adicionar cálcio em incrementos, conforme descrito no protocolo escrito.

Após a readaptação do cálcio, recolher os miócitos sinoatriais deixando-os repousar durante cerca de 10 minutos ou por centrifugação a 2 000 vezes g durante três minutos. Para células agudamente isoladas, remova e descarte suavemente cerca de cinco mililitros do sobrenadante usando uma pipeta de transferência. Em seguida, armazene as células em temperatura ambiente por até oito horas para experimentos de patch clamp.

Posteriormente, as avaliações funcionais dos miócitos sinoatriais isolados podem ser feitas usando registros de patch clamp para potenciais de ação espontâneos e correntes de membrana. Os miócitos sinoatriais espontaneamente ativos podem ser mantidos em cultura por até seis dias. As células cultivadas mantêm uma morfologia geral muito semelhante à dos miócitos sinoatriais agudamente isolados, sem alterações significativas no comprimento médio, largura, área da seção transversal ou capacitância da membrana das células cultivadas em comparação com as células agudamente isoladas.

As células são adequadas para uma variedade de estudos experimentais, como registros de pinças de corrente e tensão. Mostrados aqui como exemplos estão os potenciais de ação espontânea e a corrente engraçada. Uma vez dominado, a dissecação, isolamento e reintrodução do nó sinoatrial podem ser concluídos em cerca de duas horas para que você possa ter células prontas para seus experimentos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a orientação do tecido é fundamental para uma boa dissecção e que as etapas de dissociação enzimática e mecânica devem ser otimizadas conforme descrito no texto. Após este procedimento, os miócitos isolados do nó sinoatrial podem ser usados para uma variedade de experimentos, incluindo eletrofisiologia de célula única, imagem de cálcio e imunocitoquímica. As células também podem ser mantidas em cultura para experimentos que requerem manipulação de genes ou a expressão de moléculas repórteres.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar miócitos sinoatriais de camundongos adultos. Boa sorte com seus experimentos.