Adenofection: Um método para estudar o papel de chaperones moleculares em Cellular Morfodinâmica por experimentos depleção de resgate

O objetivo geral deste método é permitir que experimentos de resgate de depleção sejam realizados em condições que preservem a integridade celular e a homeostase proteica. Para análises funcionais de processos biológicos no nível de uma única célula. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre as funções das proteínas e os requisitos de estrutura na dinâmica celular, como mitose e diferenciação celular.

A principal vantagem desta técnica é esgotar uma proteína de interesse e reintroduzir ao mesmo tempo variante desta proteína a nível neofisiológico numa medição de uma população celular. Comece revestindo pratos de fundo de vidro com fribronectina. Para fazer isso, dilua um miligrama por mililitro de firbronectina a 100 com PBS estéril.

Adicione um mililitro a cada prato de 35 mililitros para cobrir toda a superfície. Incube por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Durante a incubação, o alfa MEM pré-aquecido é suplementado com 10% de FBS e uma alíquota de 0,05% de tripsina EDTA a 37 graus Celsius.

Após 45 minutos de incubação, comece a preparar a solução celular. Aspire o meio de uma placa de 10 centímetros de células HeLa RFP H2B. E enxágue suavemente duas vezes com 1,5 mililitros de 0,05% de tripsina EDTA.

Deixe 0,5 mililitros de tripsina EDTA na placa após a última aspiração. E incube as células por dois a três minutos a 37 graus Celsius. E 5% de dióxido de carbono.

Bata suavemente no prato. E observe a camada de células sob o microscópio para verificar se todas as células foram separadas. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio e pipete suavemente várias vezes para separar as células e transfira a suspensão celular em um tubo de 15 mililitros.

Conte uma amostra de 10 microlitros da suspensão celular usando um hemocitômetro. Em seguida, aspire a solução de fibronectina dos pratos com fundo de vidro. Não permita que a fibronectina seque antes do revestimento celular.

Prepare uma solução de suspensão celular para colocar 1,5 vezes dez elevado à quinta célula por prato de 35 milímetros em dois mililitros de meio. Placa um, placa de 35 milímetros, adicional ao número de condições, a fim de contar o número de células antes da transdução do vírus. Incube por 30 a 45 minutos.

Após o tempo de incubação, verifique as células ao microscópio para garantir que as células estejam bem separadas. Como visto aqui. Devolva as placas à incubadora e cultive as células até o dia seguinte.

No dia seguinte ao plaqueamento, certifique-se de que as células atingiram a densidade de pelo menos 50%Uma densidade celular inferior a 50%resulta em diminuição da eficiência da transdução do vírus. Aumento da variação da expressão de proteínas por célula e aumento da toxicidade celular. Em seguida, colha as células do prato adicional como antes.

E conte o número de células. Calcule o volume de vírus necessário para a transdução eficiente das células. Rotule um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada condição.

E adicione 400 microlitros de alfa MEM quente menos. Depois de descongelar lentamente as alíquotas dos vírus no gelo, adicione o volume necessário de cada vírus aos tubos e misture delicadamente pipetando. Em seguida, depois de aspirar o meio das células, adicione suavemente a mistura de vírus gota a gota.

Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. A cada 15 minutos, por um período de uma hora, agite as placas cuidadosamente sob o capuz estéril para cobrir as células com vírus. O uso de uma pequena quantidade de meio facilita o contato do vírus com as células.

Após a incubação, pipetar suavemente 1,6 mililitros de alfa MEM menos para cada placa para obter um volume total de dois mililitros. Em seguida, inicie a sincronização celular adicionando dois milimolares de timidina antes de incubar as células por mais duas horas. Enquanto isso, prepare a mistura de transfecção de siRNA adicionando em um microtubo 139 microlitros de água estéril, 50 microlitros de cloreto de cálcio de um molar e 11 microlitros de siRNA 20 micromolares.

Se nenhum siRNA for necessário, substitua a quantidade de siRNA por água estéril para realizar uma transfecção vazia. Adicione a solução HBSS2X gota a gota lentamente à mistura de siRNA de cloreto de cálcio. Misture delicadamente duas vezes por injeção de ar usando uma pipeta de 200 microlitros.

Como precipitados menores, resultam em melhor eficiência de transfecção. Em seguida, incube a mistura por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, adicione lentamente 200 microlitros gota a gota a cada placa e agite para misturar.

Incube as placas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 16 horas. No dia seguinte, retire os pratos da incubadora e transporte-os para uma coifa de cultura de tecidos. Depois de enxaguar as células duas vezes com dois mililitros de hipis quentes, adicione dois mililitros de alfa MEM menos antes de retornar à incubadora.

Sete horas depois, adicione dois milimolares de timidina às placas antes de devolvê-las à incubadora. Trabalhe com no máximo quatro placas celulares por vez, pois as variações de temperatura afetam a duração do ciclo celular. No dia seguinte, 48 horas após a transfecção de siRNA e infecção pelo vírus, enxágue as células duas vezes com dois mililitros de PBS quente e adicione dois mililitros de alfa MEM sem vermelho de fenol para imagens de células vivas.

Incubar por sete horas. Realize experimentos de imagem de células vivas de curto prazo em células mitóticas com um microscópio invertido equipado com uma câmara termorregulada de dióxido de carbono a 5% umidificada. Antes da aquisição, verifique se a câmara atingiu a temperatura apropriada de 37 graus Celsius.

Coloque as placas cultivadas na câmara do microscópio uma hora antes da aquisição para permitir o equilíbrio adequado do meio e evitar o desvio do foco devido a mudanças de temperatura. Examine o estado mitótico das células. Neste ponto.

10 a 15% das células devem estar nos estágios iniciais da mitose. Durante o tempo de equilíbrio, configure os parâmetros de aquisição conforme determinado em experimentos anteriores. É importante obter uma resolução adequada sem branqueamento fotográfico.

Como isso causa dano celular e perturba a progressão mitótica. Escolha vários campos contendo células que estão na entrada mitótica por condição para obter um número significativo de células para analisar sem exceder o intervalo de aquisição. Depois que todos os campos forem escolhidos, redefina o foco e inicie a aquisição o mais rápido possível.

Usando um disco giratório pode focar o sistema. Uma configuração típica incluiria quatro condições diferentes. Sete campos por placa.

E dois canais de cores com um intervalo de 1,5 a dois minutos durante um período de 75 minutos. Determinar critérios bem definidos para analisar os fenótipos mitóticos nas células, que dependerão dos marcadores fluorescentes que estão sendo usados. Em contraste com a transfecção de BAG3 GFP, o DNA plasmático, como visto à esquerda, a adenofecção com adenovírus recompetentes mostrada aqui à direita permite uma expressão mais homogênea e eficiente de BAG3 GFP.

Na maioria da população de células com baixa multiplicidade de infecção. Este western blot representativo mostra que a adenofecção com siRNAs específicos de BAG3 e adenovírus recompotente BAG3 GFP permite a depleção eficiente de BAG3 endógeno e a reintrodução da proteína BAG3 GFP em níveis endógenos próximos. Como mostrado aqui, a adenofecção pode preservar a homeostase proteica, uma vez que não há aumento detectável nos níveis das proteínas de choque térmico induzidas pelo estresse nas células HeLa que foram adenofecadas.

Em contraste com as células HeLa tratadas com o indutor de estresse proteotóxico, MG132. Aqui vemos que a progressão das células através da mitose não é significativamente perturbada pela adenofecção, como mostrado por essas imagens de lapso de tempo confocal de células HeLa adenofecadas com siRNA de controle e BacMam GFP alfa Tubulina. e BacMam FRP Actin.

O gráfico indica a proporção de células com mitose anormal. As células adenofecadas com siRNA específico de BAG3 isoladamente exibiram um aumento aproximado de duas vezes no nível de defeitos mitóticos. Como representado pela barra vermelha.

Que foi restaurado para perto do nível da célula de controle pela reintrodução de BAG3 GFP mostrado pela barra preta. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como realizar experimentos de resgate de depleção usando adenofecção. Este método fornece um sistema rápido e simples para criar knock downs hipomórficos para análise da função da estrutura em vários fundos celulares.

Seguindo este método, os principais requisitos estruturais da proteína de interesse para uma determinada função podem ser identificados. Outras abordagens de edição do genoma podem ser usadas para aprofundar a mecânica envolvida.