Name: Preparação de CD4 + As células T para Análise de GD3 e GD2 gangliï¿½idos Membrane Expressão por microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a preparar células T CD4+ para análise de gangliosídeos GD3 e GD2 por microscopia. Este método permite visualizar a expressão de glicolipídios de membrana em pequenas populações celulares, com aplicações em pesquisa de leucemia.

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Agradecemos ao Dr. José Luis Daniotti pelos comentários. Agradecemos a assistência ao Dr. J. Arturo Pimentel e ao Laboratório Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM para aquisição de imagens confocais. I.M.-D. e T.M.V.C. foram apoiados por doações 157634 e 253596 do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. é bolsista (245192) da CONACYT. Agradecemos também o apoio da Red Temática Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

O sangue periférico de doadores saudáveis ​​do sexo masculino foi obtido com o consentimento informado e aprovação do Comitê de Bioética do Centro de Investigación en Dinámica Celular- Universidad Autónoma del Estado de Morelos. 1. Isolamento e Activação de células humanas T CD4 + Naive <ol><li> Recolhe 2 ml de sangue periférico obtido a partir de dadores humanos saudáveis ​​por meio do consentimento informado e dilui-se com 2 ml de PBS estéril com EDTA (1x Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS), EDTA 2 mM, pH 7,4). Adicionar lentamente o sangue diluído em cima de 3 mL de solução de sacarose com 1,077 densidade como anteriormente descrito 8. Nota: a migração durante a centrifugação diferencial provocada por diferenças na densidade fará com que os eritrócitos sedimentar completamente e uma camada de células mononucleares menos densas irão formar acima. 2 ml de sangue periférico irá processar cerca de 0,5 X 10 6 células T CD4 + naive após a purificatiem etapas. </li><li> Centrifugar 30 min a 250 xg a 21 ° C (rotor utilização para tubos de fundo redondo com ângulo fixo de 30 mm), sem ruptura para gerar o gradiente de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Após centrifugação, o PBMC pode ser claramente observado como um anel branco. Recolher as PBMC com uma pipeta e transferir para tubo estéril para lavar roupa. </li><li> Após três lavagens com solução de PBS-EDTA a 250 xg durante 10 min para efectuar a purificação de células T CD4 + naive. métodos de triagem ou vários tipos de kits de purificação estão disponíveis para esta finalidade. De preferência, utilizar&gt; 1 x 10 7 PBMC para a purificação. <ol><li> Purifica-se células T CD4 + naive por selecção negativa com esferas magnéticas. Efectuar a selecção negativa com anticorpos anti CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, anti-TCRγ / δ, anti-HLA-DR, e CD235a (glicoforina A). Avaliar a porcentagem de pureza, determinando células CD4 + CD45RA + através de fbaixo citometria. Nota: Opcionalmente, proceder a incubação de PBMC durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2 com uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em 10 ml de meio de cultura suplementado para promover a aderência de monócitos e continuar com a purificação de células CD4 + T naive. A recuperação eficiente de células T CD4 + naive a partir de sangue periférico depende em grande parte do sistema de purificação. </li></ol></li><li> Prepare a placas de 24 cavidades de cultura de células por adição de 250 ul por poço de PBS com anticorpo 5 ug / ml de anti-CD3 monoclonal e incubar durante pelo menos 2 horas a 37 ° C. Nota: As placas com 96 poços pode ser usado quando um número menor de células T CD4 + naive são utilizados (por exemplo, 2 x 10 4 x 10 -1 5). </li><li> Remover o anticorpo anti CD3 diluição do bem ou 24 placas de 96 poços e lava-se as placas duas vezes com PBS estéril 1x. </li><li> Dilui-se as células T CD4 + naive com&gt; 95% de pureza (CD4 +CD45RA +) a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em avançado meio RPMI 1640 suplementado com 3% de soro fetal de bovino (ou RPMI suplementado com 10% de soro), glutamina 2 mM e antibióticos (1 U / ml de penicilina, 1 ug / ml de estreptomicina). Nota: Se for necessário localização gangliósido em PBMCs, seguem o mesmo protocolo para a diluição e de estimulação, como descrito abaixo. </li><li> Adicionar 500 ul da diluição de células a poços revestidos com anti-CD3 e a poços não revestidos (células de controlo) na placa de 24 poços. Alternativamente, adicionar 100 ul da diluição de células para os poços da placa de 96 poços. </li><li> Conclua as condições de estimulação de células T CD4 + naive em anti CD3 poços revestidos por adição de 1 ug / ml de anticorpo anti CD28. </li><li> Manter as restantes células T CD4 + como de controlo nos poços não-revestidos sem adição de anticorpos anti-CD28. Incubar o repouso e activados de células CD4 + T para 0-72 horas, sob condições padrão de 37 °C e 5% de CO 2. </li><li> Para verificar uma activação adequada avaliar por citometria de fluxo da expressão do CD69 de activação precoce marcador (16 horas pós-activação) ou CD25 marcador de activação tardia (48 h pós-activação) em repouso e activados células ingénuas CD4 + T incubado a 37 ° C e 5% de CO2, na ausência ou na presença de anticorpos anti-CD3 / CD28 9,10. </li></ol> 2. A adesão de repouso e activados células naive CD4 + T <ol><li> Esterilizar 12 mm lamínulas redondas por autoclavagem e exposição à luz UV durante pelo menos 15 min. </li><li> lamelas lugar em placas de cultura celular de 24 poços estéreis. Nota: Para as culturas com menos de 1 x 10 5 células, é preferível utilizar câmaras de deslizamento com pequenas cavidades adaptadas para impedir a dispersão de células da lamela. </li><li> lamelas de revestimento (ou câmara de slides) com 200 ul de poli-L-lisina (PM de 150-300 kDa) 0,1% (w / v) de solução e incubar durante 5 min a rtemperatura oom (RT), eliminar e seco durante pelo menos 1 h à TA. </li><li> Misturar cuidadosamente e recolher o repouso e de células T CD4 + naive activados a partir das placas de 24 poços. Contar as células e se necessário, ajustar com meio suplementado fresco para transferir 1 x 10 5 células para as lamelas revestidas com poli-L-lisina. Incubam-se as células por um período mínimo de 6 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li></ol> 3. Recolha e Fixação de repouso e activados células naive CD4 + T <ol><li> Remova cuidadosamente o meio de descanso culta e células T CD4 + naïve ativadas. </li><li> Adicionar 500 ul de PBS estéril RT lentamente. Nota: adição cuidadosa e remoção de soluções a partir de poços impede o desprendimento de células a partir da lamela. </li><li> Descartar o PBS e adicionar mais 500 mL PBS para remover completamente os meios de cultura. </li><li> Fixar as células por adição de 500 ul filtrada paraformaldeído a 4% (FILTração remove micropartículas que podem interferir com a análise de microscopia) e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (de preferência) ou durante a noite a 4 ° C. Atenção: O paraformaldeído é um composto tóxico e volátil. Ele é conhecido por ser um carcinogéneo humano. Use com cuidado e com um protocolo de segurança adequado. </li><li> Remover o fixador e lava-se, pelo menos, duas vezes com PBS à temperatura ambiente. </li><li> Avance para o próximo passo ou manter os poços da placa com 500 ul de PBS a 4 ° C durante vários dias até que a coloração. Nota: A esterilidade durante este processo ajuda a evitar o crescimento de microorganismos. </li></ol> 4. Coloração, Montagem e visualização por microscopia confocal <ol><li> Remover o PBS dos poços. Adicionar 500 ul de tampão de bloqueio a frio (1x PBS, 0,5% de albumina de soro de bovino de grau padrão, 1% de soro fetal de bovino a pH 7,4). Incubar durante 20 min em gelo. </li><li> Retire o tampão de bloqueio com cuidado e adicionar os anticorpos primários (anti gangliósidos GD3 clone R24, GD2 clone 14G2a),Conjugado com PE anti-CD25 e APC conjugada anti TCR e isotipos controlos diluídos em tampão de bloqueio a 2,5 ug / ml. </li><li> Incubar 2 hr em gelo ou durante a noite a 4 ° C. Nota: agitação orbital lenta é preferível. </li><li> Remover o anticorpo cuidadosamente e lentamente adicionar 500 ul de PBS. Repita duas vezes. </li><li> Adicionar os anticorpos secundários (conjugado com FITC anti IgG3 para R24 anti GD3, Alexa Fluor 488 conjugado com Alexa Fluor 647 ou conjugado anti-IgG2a para anti GD2 14G2a) diluído em tampão de bloqueio a 0,1 ug / ml. </li><li> Incubar durante 1 hora em gelo no escuro, sem tremer. </li><li> Lavar três vezes em PBS como descrito em 4.4). Manter os poços com PBS suficiente para evitar a desidratação de amostras. </li><li> Adicionar Hoechst 333258 mancha diluída em PBS a 0,1 ug / ml. </li><li> Incubar 15 minutos à temperatura ambiente e remover. Lavar três vezes em PBS. </li><li> Colocar as lâminas numa toalha de papel e adicionar 20 ul de solução de montagem (50% de glicerol em PBS) ou solução de montagem comercials para evitar o desbotamento e extinguindo a partir de amostras. </li><li> Com cuidado, pegue a lamela com uma pinça fina e colocá-lo na solução de montagem. Assegurar que o lado da lamela em que as células estão ligados é, em contacto com a solução. Selar as lamelas com unha polonês e analisar usando fluorescência ou microscopia confocal. </li></ol> 5. Isolamento de ARN <ol><li> Prepare anticorpo CD3 anti (5 ug / ml) revestidas placas de 96 poços. Incubar 4 x 10 4 células T CD4 + naive / poço em 100 ul de meio de cultura suplementado com anticorpo CD28 anti (1 ug / ml) para completar o estímulo. Incubar a 37 ° C e 5% de CO2 durante 0-72 horas. </li><li> Após diferentes tempos de pós-activação colocar as células para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Adicionar 500 ul de PBS e centrifugar a 250 xg durante 5 min à TA. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 1 ml de reagente Trizol. </li><li> Incubar durante 5 min à temperatura ambiente e manter a amostra a -8076; C durante pelo menos 24 h. Prosseguir com o isolamento do RNA quando necessário. Nota: Partindo da amostra a -80 ° C durante pelo menos 24 horas melhora o rendimento de ARN. Além disso, o uso de luvas de mão é essencial para evitar a degradação do ARN por RNases. </li><li> Descongelar a amostra por incubação a 37 ° C durante 2 minutos num banho de água. </li><li> Adicionar 200 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente à mão durante 30 segundos (para evitar a mistura agressiva de RNA em vórtice). Incubar 5 min à TA. </li><li> Centrifugar 15 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Recuperar a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifugação. </li><li> Adicionar 500 uL de isopropanol e inverter o tubo três vezes. </li><li> Incubar 10 minutos à temperatura ambiente e centrifugação durante 10 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante por inversão. </li><li> Adicionar 1 ml de etanol arrefecido em gelo a 75% e centrifugar 10 min a 12000 xg, a 4 ° C. </li><li> Completamente descartar o sobrenadante e o sedimento de ARN secar, deixando a tampa do tubo aberto. NãoE: Neste ponto o sedimento não é claramente visível. Continuar mesmo assim. </li><li> Ressuspender o sedimento em 20 mL de água de grau molecular. Calcula-se a concentração e pureza dos ácidos nucleicos medindo a 260 nm e 280 nm de absorvância utilizando NanoDrop. </li><li> Proceder com cuidado para síntese de ADNc utilizando o kit da transcriptase reversa qualquer convencional e seguindo o protocolo MANUFACTURER&#39;S. Nota: Aproximadamente 0,5-2 ug de ARN é obtido a partir de 4 x 10 4 células T CD4 + naive. ADNc pode ser sintetizado a partir de 100 ng de ARN e utilizados em reacções de PCR em tempo real sem a necessidade de jogos de entrada de ARN de baixo. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo descrito pode ser usado para localizar gangliósidos ou proteínas em suspensões de células de células T CD4 + ou de outras células imunitárias (por exemplo, PMBC, figura 5) a partir de um pequeno número de células. Devido ao tamanho pequeno de células T e as propriedades não-aderentes, a aquisição de imagens microscópicas de fluorescência resulta em informação deficiente ou baixa qualidade, se as células não são correctamente aderida. Este prot...

As células T CD4 + orquestrar a resposta imune através das suas funções efectoras após activação por apresentação de antigénio de células 1. O estudo dos mecanismos celulares que são modulados durante a activação permite uma visão sobre um processo básico da função imune. No entanto, o estudo de células T CD4 + naive pode ser complicado porque representam uma população muito pequena de células na periferia sangue 2. Por meio de microscopia de fluorescência vários relatórios estudaram a localização de diferentes moléculas envolvidas na activação de células T CD4 +, principalmente proteínas associadas à membrana plasmática 3. Os gangliósidos são glicosfingolípidos que contém ácido siálico e embora tenham sido extensivamente estudados em células nervosas, onde eles são abundantes, outras células, tais como células do sistema imunológico, também expressam gangliosidos com funções biologicamente relevantes 4,5. Nós relatado anteriormente thaT durante a activação de células T CD4 + naive humanas existe uma regulação positiva do α2,8 sialiltransferase ST8Sia 1 (GD3-sintase) e a sintase GM2 / GD2, que induzem a neoexpression superfície significativa de GD2 e a regulação positiva de gangliósido GD3 6. Um estudo mais aprofundado de GD3, GD2 e outros gangliósidos em células do sistema imunológico é necessária para complementar uma vista parcial à base de proteína de função imunológica. Geralmente, o estudo da expressão de gangliósido é baseado em técnicas tais como cromatografia em camada fina (TLC) 7, mas esta técnica não permite que a localização espacial de gangliósidos na membrana plasmática ou em compartimentos subcelulares, limitando análise biológica. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para a identificação de anticorpos e mediada por localização de GD3 e GD2 gangliósidos em células T CD4 + naive humanas PBMC e depois com anti-CD3 / anti-CD28 de activação. Com este protocolo que ié também possível analisar o gene e a expressão de gangliósidos molecular num baixo número de células em suspensão, com a aquisição de imagens de alta qualidade 6, considerando o tamanho pequeno dos linfócitos (9 jiM).

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 avançado&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>Suplementado com 3% FBS</td></tr><tr><td>camundongo anti anti humano CD3</td><td>anticorpo eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 clone</td></tr><tr><td>de camundongo anti humano CD28 anticorpo</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 clone</td></tr><tr><td>de camundongo anti humano GD3&nbsp; anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 clone</td></tr><tr><td>de camundongo anti humano GD2 anticorpo</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-53831</td><td>14G2a clone</td></tr><tr><td>anti-camundongo conjugado com FITC IgG3 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugado anti-camundongo</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a anticorpo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 conjugado antimouse</td><td>Thermo Fisher Scieni&iexcl; anticorpo</td><td></td> A-21241 <td></td></tr><tr><td>IgG2a</td> Hoechst 333258 Sigma-Aldrich 861405&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&nbsp;</td><td></td></tr> Kit de Isolamento de Células T CD4+ Naive <tr><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td> <td>Reagent</td></tr><tr><td>Invitrogen II,</td><td>humano MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Sorting&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de lâminas de câmara Nunc Lab-tek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal a Laser Olympus FV 1000 (Olympus)&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Upright BX61WI e IX81&nbsp;</td></tr><tr><td>Primer de sequência direta GD3 sintase</td><td>5&agudo;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&agudo;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Primer de sequência reversa GD3 sintase</td><td>5&agudo;-CCTGTGGGAAGAGAGTAAG-3&agudo;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Primário de sequência direta GM2/GD2 sintase</td><td>5&agudo;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&agudo;</td><td></td><td>Ref. 7</td></tr><tr><td>Primer de sequência reversa GM2 / GD2 sintase</td><td>5&agudo;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&agudo;</td><td></td><td>Referência 7</td></tr></tbody></table>

preparação de cd4<sup&gt; +</sup&gt; as células t para análise de gd3 e gd2 gangliï¿½idos membrane expressão por microscopia

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Os métodos aqui descritos para a activação de células T CD4 + naive em suspensão e a sua aderência em lamelas para análise por microscopia confocal de permitir que a localização espacial e a visualização de gangliósidos envolvidos na activação de células T CD4 +, que a expressão do complemento profiling experiências, tais como citometria de fluxo, Western borrar ou PCR em tempo real. A quantificação da expressão gangliósido através de citometria de fluxo e a sua localização celular através de microscopia pode ser obtido através da utilização de anticorpos anti-gangliósidos com elevada afinidade e especificidade. No entanto, um tratamento adequado de células em suspensão envolve o tratamento de placas de cultura para promover a adesão necessária exigida para a fluorescência ou a aquisição de microscopia confocal. Neste trabalho, nós descrevemos um protocolo para determinar GD3 e GD2 expressão gangliósido e co-localização com a TCR durante a ativação de células CD4 + T naïve. Além disso, real-time experiências de PCR utilizando &lt;40.000 células são descritos para a determinação da GD3 e genes da sintase de GM2 / GD2, demonstrando que as experiências de análise genética pode ser realizada com um baixo número de células e, sem a necessidade de kits adicionais baixos de ARN de entrada.

O protocolo descrito neste manuscrito torna uma boa qualidade de cultura e de repouso e aderiu células naive humanas activadas T CD4 + (Figura 1). As células T CD4 + activadas mostram o perfil característico proliferativa (Figura 1B), em comparação à condição de repouso (Figura 1A). O marcador de activação CD25 tarde é útil para avaliar a activação eficiente a 72 h observado por microscopia confocal (Figura ...

Descreve-se um protocolo de coloração de anticorpo padrão para utilização em microscopia para determinar a expressão e localização da membrana de gangliósidos em repouso e as células naive humanas activadas T CD4 +. Também estão descritos em tempo real utilizando experiências de PCR &lt;40.000 células que não requerem kits adicionais baixos de ARN de entrada.

Preparação de CD4<sup&gt; +</sup&gt; As células T para Análise de GD3 e GD2 gangliï¿½idos Membrane Expressão por microscopia

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar o preparo de uma suspensão de células T CD4+ para coloração, com o fim de visualizar a localização dos gangliosídeos GD3 e GD2 na superfície celular utilizando um pequeno número de células. Este método permite a visualização de glicolipídios de membrana em um baixo número de pequenas células em suspensão, como é o caso das células mononucleares. A principal vantagem desta técnica é que ela permite avaliar a expressão e a localização de gangliosídeos em pequenas quantidades de células T CD4+, otimizando o uso da amostra.As implicações dessa técnica podem se estender para a pesquisa e o diagnóstico de alguns tipos de leucemia de células T. Como descobrimos, algumas linhagens celulares de leucemia aumentam a expressão dos gangliosídeos GD3 e GD2. Comece diluindo dois mililitros de sangue periférico de doadores humanos saudáveis com dois mililitros de PBS EDTA estéril.Dispense lentamente o sangue diluído sobre três mililitros de solução de sacarose com densidade 1,077. Em seguida, centrifugue por 30 minutos a 250 vezes G a 21 graus Celsius sem frenagem para gerar o gradiente de células mononucleares do sangue periférico. Após a centrifugação, as PBMCs podem ser claramente observadas como um anel branco.Colete os PBMCs com uma pipeta e transfira para um tubo estéril para lavagem. Após lavar as células com PBS contendo EDTA, purifique os linfócitos T CD4+ ingênuos por seleção negativa com microesferas magnéticas utilizando um kit comercialmente disponível. Assim que uma população com pureza superior a 95% de linfócitos T CD4+ for obtida, prepare placas de cultura celular de 24 poços adicionando 250 microlitros de anticorpo monoclonal anti-CD3 a cinco microgramas por mililitro em PBS a cada poço.Incube a placa a 37 graus Celsius por pelo menos duas horas. Após a incubação, remova a diluição do anticorpo anti-CD3 das placas e lave duas vezes utilizando PBS 1x estéril. Em seguida, dilua as células T CD4+ naïve com meio RPMI 1640 avançado suplementado até uma densidade de um vezes 10 à sexta células por mililitro.Em seguida, adicione 500 microlitros de células diluídas aos poços revestidos com anti-CD3 da placa de 24 poços. Em seguida, complete a estimulação de células T CD4+ ingênuas nos poços revestidos com anti-CD3 adicionando um micrograma por mililitro de anticorpo anti-CD28. Incube as células T CD4+ em repouso e ativadas por zero a 72 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após o tempo de incubação previsto ter decorrido, colete as células T CD4+ naïve em repouso e ativadas das placas de 24 poços. Realize uma contagem celular e, se necessário, dilua as células com meio suplementado fresco até uma concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro. Semee 500 microlitros das células diluídas nos poços de uma placa de 24 poços contendo lamínulas revestidas com poli-L-lisina ou uma câmara de lâmina e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por um mínimo de seis horas.Após a incubação, as células T CD4+ estarão aderidas aos lamínulas. Remova cuidadosamente o meio dos poços e, em seguida, adicione lentamente 500 microlitros de PBS estéril. A adição de PBS durante a lavagem deve ser feita com muita cautela, especialmente ao preparar câmaras de lâmina com menos de 50.000 células por poço.Aspire o PBS e adicione outros 500 microlitros de PBS aos poços para remover completamente o meio de cultura. Após a remoção de todo o PBS, adicione 500 microlitros de paraformaldeído filtrado a 4% e incube por 30 minutos à temperatura ambiente para fixar as células. Após a fixação, remova o fixador e lave com PBS pelo menos duas vezes.Se desejar, a placa pode ser armazenada com 500 microlitros de PBS em cada poço por vários dias a quatro graus Celsius. Primeiro, remova o PBS das células fixadas e adicione 500 microlitros de tampão bloqueador frio. Incube por 20 minutos no gelo.Durante a incubação, é fundamental não agitar vigorosamente a placa, pois a agitação removerá as células. Aspire cuidadosamente o tampão de bloqueio e adicione tampão de bloqueio contendo 2,5 microgramas por mililitro de um dos anticorpos primários ou anti-CD25 conjugado com PE, anti-TCR conjugado com APC ou um controle isotípico. Incube por duas horas no gelo, protegido da luz, ou durante a noite a quatro graus Celsius.Após a incubação, remova cuidadosamente a solução de anticorpo e adicione lentamente 500 microlitros de PBS. Em seguida, adicione os anticorpos secundários apropriados diluídos no tampão de bloqueio até 0,1 micrograma por mililitro. Proteja da luz e incube por uma hora no gelo, tomando cuidado para evitar agitação.Após lavar três vezes em PBS como anteriormente, adicione a coloração com Hoechst diluída em PBS até 0,1 micrograma por mililitro e incube protegido da luz por 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, coloque as lâminas lavadas sobre uma toalha de papel e adicione 20 microlitros de solução de montagem ou solução de montagem comercial para prevenir o desbotamento e o apagamento da fluorescência. Por fim, pegue um lamínula com pinças finas, vire-o com a face voltada para baixo e coloque-o sobre a solução de montagem, de modo que o lado do lamínula onde as células estão aderidas entre em contato com a solução.Selar as lamínulas com esmalte e analisar utilizando microscopia de fluorescência ou confocal. Esta imagem mostra a visualização em campo claro de células T CD4+ fixadas 72 horas após a ativação. A validação da ativação eficiente após coloração é avaliada utilizando anticorpo anti-CD25 mostrado em vermelho.O gangliosídeo GD3 está localizado no interior das células e na superfície celular de linfócitos T CD4+ ativados, conforme avaliado por marcação com anticorpo anti-GD3 mostrado em verde. O GD3, novamente mostrado em verde, não apresenta co-localização com o TCR, mostrado novamente em vermelho, conforme avaliado por marcação com anticorpos anti-GD3 e anti-TCR. No entanto, o gangliosídeo GD2 co-localiza com o TCR e com linfócitos T CD4+, conforme avaliado por marcação com anticorpo anti-GD2, mostrado em verde, e marcação com anticorpo anti-TCR, mostrado em vermelho.A coloração para o gangliosídeo GD3 mostra a localização intracelular e na superfície celular em um subconjunto de PBMCs ativados. Enquanto a coloração para o gangliosídeo GD2 mostra a localização intracelular e na superfície celular em todos os PBMCs ativados. Após este procedimento de aderência e manipulação das células T CD4+, outros métodos, como a coloração de compartimentos intracelulares, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a localização ou processamento intracelular específico dos gangliosídeos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manipular e fixar um baixo número de células T CD4+ para obter imagens de microscopia fluorescente de alta qualidade, a fim de analisar a expressão de gangliosídeos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este procedimento demonstra a purificação e expansão in vitro de células CD4 + antígeno específico das células T do sangue periférico todo e sua visualização usando tetrâmeros de MHC classe II. Tetrâmeros permitir a visualização direta das células T com uma especificidade antígeno único e definido MHC classe II restrição.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Este vídeo demonstra a diferenciação in vitro do fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos ou células T auxiliares produtoras de GM-CSF (THGM). As células T virgens isoladas são estimuladas para diferenciação em THGM, o que é confirmado pela detecção de alta produção intracelular de GM-CSF e uma baixa expressão de outras citocinas específicas de células T auxiliares.

Uma técnica in vitro para diferenciar células T auxiliares produtoras de GM-CSF de células T virgens

Este vídeo demonstra a triagem de compostos imunomoduladores por meio de ensaio baseado em fluorescência. Linfócitos T derivados de camundongos transgênicos com de expressão de proteína fluorescente verde são tratados com esses compostos. Os sinais GFP aprimorados e reduzidos permitem a identificação dos efeitos estimulatórios e inibitórios dos compostos, respectivamente.

Um ensaio baseado em fluorescência usando linfócitos projetados para triagem de compostos imunomoduladores

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Um ensaio para análise do ciclo celular de células T CD8+ específicas do antígeno

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Preparação de CD4

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