In Vitro A gravação de mesentérica aferentes a atividade do nervo no mouse jejuno e segmentos do cólon

O objetivo geral desta técnica é registrar a atividade nervosa aferente esplâncnica in vitro a partir de um único feixe nervoso jejunal ou colônico em resposta a distensões progressivas e à aplicação de compostos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de neurociência, como por exemplo se os nervos aferentes que suprem o trato gastrointestinal estão hipersensibilizados ou dessensibilizados durante diversos estados patológicos. As principais vantagens desta técnica são a possibilidade de registrar a descarga nervosa in vitro e a capacidade de quantificar a atividade nervosa sem modulação ou influência do sistema nervoso central.

A implicação desta técnica estende-se à terapia ou ao diagnóstico de várias síndromes dolorosas, como a síndrome do intestino irritável, uma vez que a sensibilização nervosa desempenha um papel importante na patogênese. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades, pois a dissecação de feixes nervosos e a análise de unidade única do sinal registrado exigirão uma quantidade considerável de treinamento. Para iniciar este procedimento, posicione o camundongo sacrificado em posição supina.

Realize uma incisão mediana abdominal através da pele e da camada muscular abdominal usando um bisturi, estendendo-a desde o processo xifoide até o osso púbico. Em seguida, lave a cavidade abdominal com solução de Krebs fria para evitar o ressecamento dos tecidos intra-abdominais. Então, resseque rapidamente todo o jejuno usando tesoura afiada, removendo aproximadamente 20 centímetros do intestino delgado, começando imediatamente na flexura duodenojejunal.

Tenha cuidado para não danificar as estruturas circundantes e mantenha intacto o mesentério do intestino, que contém os vasos sanguíneos jejunais e os nervos aferentes. Em seguida, coloque o jejuno ressecado em solução de Krebs fria sobre gelo, oxigenando-o continuamente com Carbigen. Depois, corte o jejuno em alças de aproximadamente três centímetros de comprimento.

Localize o feixe mesentérico contendo os vasos e o nervo esplâncnico próximo ao centro da alça respectiva para facilitar a montagem da alça na câmara de registro. Em seguida, lave cada segmento com solução de Krebs utilizando uma cânula romba para remover o conteúdo luminar e o quimo, pois eles contêm enzimas digestivas que acelerarão a deterioração da amostra tecidual in vitro. Após isso, selecione um segmento para medir a atividade nervosa aferente e coloque-o na câmara de registro codificada com uma camada de elastômero de silicone.

Mantenha a temperatura de Krebs na câmara de registro a 34 graus Celsius. Em seguida, monte o segmento jejunal no banho de órgãos, de modo que a extremidade oral esteja conectada ao driver da seringa que fornece o fluxo luminar e a extremidade aboral esteja conectada à saída. Estique levemente o segmento, mas tenha cuidado para não exercer tensão excessiva.

Fixe firmemente ambas as extremidades com ligaduras de seda aos orifícios de entrada e saída. Em seguida, acople o driver da seringa à extremidade oral e perfunda o segmento jejunal intraluminalmente com solução de Krebs a 10 mililitros por hora. Fixe a mesentérica do segmento intestinal montado, achatando-a contra a camada inferior de elastômero de silicone.

Em seguida, estique o mesentério para otimizar a visualização do feixe mesentérico. A seguir, realize um teste de distensão em rampa fechando o porto de saída até que a pressão intraluminal do segmento intestinal atinja 60 milímetros de mercúrio, a fim de verificar se não há vazamento de solução de Krebs intraluminal do segmento montado. Observe um aumento suave da pressão intraluminal sem interrupções.

Espera-se pequenas contrações do segmento durante a fase inicial de distensão. Se necessário, bloquee a atividade peristáltica adicionando um micromol do bloqueador do canal de cálcio tipo L nifedipina à solução de Krebs. Sob um microscópio estereoscópico, comece suavemente a remover o tecido adiposo do mesentério puxando-o cuidadosamente com duas pinças pequenas, tomando cuidado para não danificar os vasos e o nervo aferente que estão enterrados no tecido adiposo.

Comece a remover o tecido adiposo a uma distância do jejuno para expor ambos os vasos sanguíneos no interior do feixe mesentérico. Identifique o nervo jejunal aferente entre os dois vasos como um filamento branco fino encapsulado no tecido adiposo. Em seguida, dissecar mais proximalmente em direção ao jejuno, removendo cuidadosamente o tecido adiposo com pinça.

Em seguida, dissecar o nervo mesentérico jejunal do segmento removendo o tecido adiposo aderente ao nervo. Seccionar o nervo utilizando tesoura cirúrgica afiada. Se necessário, remover cuidadosamente o tecido adiposo e conjuntivo remanescente, bem como a bainha epineural, puxando-o suavemente.

Neste procedimento, utilizando um micromanipulador, abaixe a ponta do eletrodo de sucção dentro do banho orgânico. Em seguida, aspire suavemente um pouco da solução de Krebs do banho orgânico, de modo que a ponta do eletrodo fique submersa na solução de Krebs. Certifique-se de que a solução de Krebs cubra o eletrodo de fio no interior do eletrodo de sucção.

Em seguida, posicione a ponta do eletrodo de sucção imediatamente ao lado do filete nervoso aferente seccionado e aspire o filete nervoso para dentro da capilar ao longo de todo o seu comprimento. Posicione a ponta do eletrodo em direção ao tecido adiposo e aspire-o para dentro da pipeta de vidro com o êmbolo, selando mecanicamente o nervo na capilar em relação ao conteúdo do banho orgânico. O selamento adequado da pipeta de vidro em relação à câmara de registro, mediante a aspiração de algum tecido adiposo circundante para dentro da capilar, é fundamental para minimizar o ruído de fundo excessivo que acabará por prejudicar a análise final.

Para verificar a gravação da atividade nervosa aferente, realize um aumento na descarga aferente induzido por distensão em rampa, fechando o porto de saída para provocar uma elevação gradual da pressão no segmento intestinal. Execute o protocolo experimental desejado somente quando três distensões em rampa consecutivas produzirem uma descarga multissensorial reprodutível. Após o isolamento do nervo, estabilize o preparo por 15 minutos para obter uma atividade nervosa aferente espontânea constante antes de realizar os experimentos propriamente ditos.

É mostrada aqui uma representação esquemática de diferentes unidades de fibras aferentes com base em seus perfis mecanossensitivos. As fibras de limiar baixo exibem predominantemente um aumento na atividade nervosa em pressões de distensão baixas, resultando em uma porcentagem de LT superior a 55%. As unidades de limiar alto, ao contrário, apenas exibem um aumento na frequência de disparos em pressões nociceptivas. As fibras de faixa dinâmica ampla exibem um aumento gradual na atividade nervosa durante toda a distensão, enquanto as fibras mecanicamente insensíveis não respondem ao aumento das pressões de distensão.

Esta figura mostra a descarga do nervo aferente mesentérico em camundongos selvagens durante a distensão progressiva. Observe que, no perfil de distensão bifásica, o aumento inicial na descarga nervosa é devido às fibras de baixo limiar e faixa dinâmica ampla, enquanto as fibras de alto limiar e faixa dinâmica ampla contribuem para o segundo aumento na descarga. Uma vez dominada, a isolamento do nervo jejunal e o registro inicial da linha de base podem ser realizados em menos de uma hora, se feitos corretamente.

É necessário mais tempo ao estudar o efeito de compostos administrados no banho de órgão. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter uma abordagem bem padronizada, como identificar consistentemente o mesmo segmento em todos os experimentos. Após este procedimento, outros métodos, como o isolamento de gânglios da raiz dorsal seguido de imagem de cálcio, podem ser realizados para avaliar quais estações de retransmissão no sistema nervoso gastrointestinal estão envolvidas na patogênese de várias doenças.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que pesquisadores da área de neurociência explorassem a patogênese de várias síndromes dolorosas na pesquisa gastrointestinal. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar nervos aferentes jejunais do trato gastrointestinal de camundongos e registrar a atividade proveniente deles durante distensões progressivas.