Determinação do Potencial Zeta de nanopartículas de translocação através de velocidades por meio de um Tunable Nanopore: Utilizando partículas modificadas-ADN como um Exemplo

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar a química da superfície de nanopartículas usando pós-detecção resistente ajustável, ou TRPS, e determinar o potencial zeta do material. Isso está demonstrando caracterizando nanopartículas modificadas por DNA. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na caracterização de nanomateriais e no desenvolvimento de bioensaios.

A principal vantagem dessa técnica é que você pode concluir a análise partícula por partícula. Cada sinal de partícula de DNA é traduzido em uma medição de potencial zeta, fornecendo uma imagem completa da amostra que está sendo analisada. O método mais antigo poderia fornecer informações sobre a caracterização de materiais.

Também pode ser aplicado a outras aplicações, como o desenvolvimento de bioensaio para a detecção de células, vírus, DNA e proteínas. Geralmente, o indivíduo novo neste método terá dificuldades porque não é uma simples injeção do samp e depois esperar pela resposta. Há alguma contribuição do cientista necessária.

Para iniciar este procedimento, retirar-se as partículas revestidas com estreptavidina em vórtice durante 30 segundos antes da sonicação durante dois minutos a 80 watts para garantir a monodispersão. Diluir as partículas revestidas de estreptavidina uma em cem no tampão PBST para obter uma concentração resultante de uma vez dez elevado a nove partículas por mililitro. Em seguida, vórtice as partículas por 30 segundos.

Com base em uma capacidade de ligação de 4.352 picomoles por miligrama na concentração apropriada de DNA às partículas para concentrações resultantes de 10, 20, 30, 40, 47, 95, 140 e 210 nanomolares. Depois de agitar as amostras por 10 segundos, coloque-as em uma roda rotativa em temperatura ambiente por 30 minutos para permitir que o DNA se ligue às superfícies das partículas por meio de uma interação estreptavidina-biotina. Uma vez que o DNA capturado tenha sido adicionado e incubado com as partículas, remova o excesso de DNA e solução por separação magnética, colocando as amostras em um rack magnético por 30 minutos.

Em seguida, remova o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o aglomerado de partículas recém-formado, mais próximo do ímã. Em seguida, substitua o sobrenadante pelo mesmo volume de tampão PBST fresco. Agora adicione a quantidade necessária de DNA alvo a cada amostra para garantir que a ligação máxima possível ao alvo seja alcançada.

Vortex as amostras por 10 segundos. E coloque-os na roda rotativa em temperatura ambiente por 30 minutos. Quando a hibridização estiver concluída, remova o excesso de DNA alvo por meio de separação magnética, colocando as amostras no rack magnético por 30 minutos.

Em seguida, remova o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o aglomerado de partículas recém-formado, mais próximo do ímã. Em seguida, substitua o sobrenadante pelo mesmo volume de tampão PBST fresco. Depois de repetir as etapas anteriores para amostras duplicadas, coloque as amostras na roda rotativa em temperatura ambiente por 16 horas para investigar os tempos de hibridização do DNA.

Neste ponto, conecte um instrumento TRPS a um sistema de computador com software instalado. Usando paquímetros, meça a distância entre a parte externa de duas mandíbulas paralelas. Digite a distância no campo de alongamento na guia de configurações do instrumento e clique em calibrar alongamento abaixo da guia.

Em seguida, encaixe lateralmente uma membrana de nanoporos de poliuretano de tamanho apropriado para análise nas mandíbulas com o número de identificação do nanoporo voltado para cima. Em seguida, estique as garras até o alongamento necessário para análise usando a alça de ajuste de estiramento na lateral do instrumento. Coloque 80 microlitros de tampão PBST na célula de fluido inferior abaixo do nanoporo, garantindo que não haja bolhas presentes que possam afetar a medição.

Agora encaixe a célula de fluido superior no lugar e adicione 40 microlitros de tampão, garantindo que não haja bolhas presentes. Em seguida, coloque uma gaiola de Faraday sobre o sistema e aplique uma pressão externa conforme descrito no protocolo de texto. Depois de colocar 40 microlitros das partículas de calibração na célula de fluido superior, conclua uma medição TRPS em três tensões aplicadas.

Altere a tensão clicando nos botões de mais e menos na escala de tensão na guia de configurações do instrumento no software. Verifique se as três tensões retornam as correntes de fundo apropriadas. E certifique-se de que, na média tensão, as partículas de calibração produzam uma magnitude média de bloqueio de pelo menos 0,3 nanoamperes.

Uma vez que as condições descritas no protocolo de texto tenham sido alcançadas, inicie a execução clicando em iniciar no software na guia de aquisição de dados. Para concluir a medição, clique em parar na guia de aquisição de dados e salve o arquivo de dados. Lave o sistema substituindo as partículas de calibração por 40 microlitros com tampão PBST nas células de fluido superiores várias vezes.

E aplicando várias pressões até que não haja mais eventos de bloqueio, garantindo que não haja partículas residuais e nenhuma contaminação cruzada. Depois que a corrente de linha de base apropriada for alcançada, substitua o eletrólito na célula de fluido superior por 40 microlitros de amostra. Inicie a execução de amostra clicando em iniciar na guia de aquisição de dados.

Registre um mínimo de 500 partículas e certifique-se de que o tempo de execução seja de no mínimo 30 segundos. Para concluir a medição, clique em parar na guia de aquisição de dados e salve o arquivo de dados. Um exemplo de análise de tamanho e potencial zeta de partículas revestidas com estreptavidina sem modificações e partículas revestidas com estreptavidina saturadas com DNA de fita simples na superfície é mostrado aqui.

Embora ambas as amostras fossem de tamanho semelhante, o potencial zeta era significativamente diferente e muito maior quando o DNA foi funcionalizado na superfície da partícula. Os dados de tamanho e potencial zeta exibidos para amostras com as menores e mais altas concentrações de DNA hibridizado com as partículas revestidas com estreptavidina são exibidos aqui. Um valor potencial zeta maior é registrado para partículas hibridizadas com uma concentração mais alta de DNA.

A mudança no potencial zeta medido apenas para DNA sondado por captura, um alvo de DNA totalmente complementar, um alvo de DNA de ligação média, um alvo de DNA de ligação final e um alvo de DNA pendente é mostrado aqui. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 20 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de lavar bem um nanopole entre cada calibração e amostra para garantir que não haja contaminação cruzada entre as amostras e evitar qualquer bloqueio de nanopole.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de biossentidos explorarem as interações proteína-proteína e proteína-DNA em ensaios multiplex. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter o potencial zeta usando TRPS e preparar partículas modificadas de DNA para bioensaios.