Name: Medição de In Vitro Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprenda a medir a atividade de integração de complexos de pré-integração do HIV-1 in vitro usando células SupT1 infectadas. Este método auxilia na identificação de alvos para terapia antirretroviral.

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Este trabalho é parcialmente apoiada por doações DA024558, DA30896, DA033892 e DA021471 do NIDA / NIH para CD. Reconhecemos também o G12MD007586 concessão RCMI, o Vanderbilt CTSA conceder UL1RR024975, o Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA U54 concessão RR026140 do NCRR / NIH, o MD007593 concessão U54 do NIMHD / NIH, eo Tennessee CFAR P30 concessão AI110527.

Produção 1. Vírus NOTA: Para gerar títulos elevados de VIH-1 infeccioso, transfectar a linha celular de rim embrionário humano (HEK) 293T com um clone molecular infeccioso do HIV-1 usando um reagente de transfecção à base de dendrímero activado. Tem sido observado que o método de transfecção com fosfato de cálcio produz resultados comparáveis. <ol><li> Em um laboratório de Segurança Biológica Nível 2 (BSL2), semente de 3 x 10 6 293T células por placa de 10 cm em 8 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), penicilina e estreptomicina. Cultura das células numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 O / N. </li><li> No dia seguinte, as células para transfecção em cada placa de 10 cm, dilui-se 8 ug de DNA do plasmídeo pNL4-3 (ver Materiais Tabela) a um volume final de 300 ul de DMEM sem soro e antibióticos. Adicionar 80 ul de reagente de transfecção, misturar bem por pipetagem, e incubar à TA durante5 - 10 min para a formação do complexo de transfecção. </li><li> Remover o meio das placas por aspiração e adiciona 7 ml por placa de meio DMEM fresco contendo soro e antibióticos. </li><li> Adicionar 1 ml de DMEM contendo soro e antibióticos para o complexo de transfecção, misturar por pipetagem, e adicionar esta mistura para as células. Agite suavemente o prato para facilitar a distribuição uniforme dos complexos de transfecção. </li><li> Imediatamente transferir as células para o laboratório BSL3, lugar numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2, e a cultura das células durante 48 h. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante da cultura de tecido contendo vírus, utilizando uma pipeta e, em seguida, transferi-lo para um tubo de centrífuga. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min para sedimentar as células e detritos, e, em seguida, filtrar o sobrenadante através de um filtro de seringa de 0,45 um tamanho de poro. </li><li> Para eliminar qualquer ADN plasmídico transição nesta preparação de vírus livre de células, trata-se com ADNase 1 (20 ug / ml) a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Para quantificar aHIV-1 título, utilizar o enzyme-linked Immunosorbent Assay específicos de p24 (ELISA), como é um método rápido e propícios para uso rotineiro 22. NOTA: Deve-se notar que o ensaio ELISA de p24 mede o título física (número de partículas de vírus). Alternativamente, a medição da actividade associada ao vírus RT (ensaio de RT exógeno) ou de infecciosidade do vírus (ensaios de infecciosidade baseados em linha de célula indicadora TZM-bl) irá fornecer leitura exclusiva de partículas de vírus infecciosas. </li></ol> 2. Infecção do vírus de células Sup-T1 (BSL3 Lab) <ol><li> Num laboratório BSL2, manter as células SUP-T1 entre 1,0 x 10 6 e 2,0 x 10 6 células / ml em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio suplementado com 10% de FBS inactivado pelo calor, penicilina e estreptomicina (razão de divisão de 1 : 2 a cada 2-3 d). Reunir as células SUP-T1 a partir dos frascos de cultura, misturar bem por pipetagem, e determinar a contagem de células viáveis ​​utilizando um hemacitómetro e a exclusão de azul de tripano rMétodo aining. <ol><li> Prepara-se o número necessário de partes alíquotas de 80 x 10 6 células (por infecção pelo vírus) em 50 ml de tubos de centrífuga cónico. </li><li> Centrifugar as células em um rotor de balde a 500 xg e 25 ° C durante 5 min. Sem remover o meio de cultura celular, transferir os tubos contendo as células peletizadas para o laboratório BSL3 para processamento adicional. Aspirar cuidadosamente o meio de cultura de células a partir do tubo, sem perturbar o sedimento celular. </li></ol></li><li> Adicionar uma quantidade apropriada de inoculo de vírus tratada com ADNase I para as células no tubo e misturar bem por pipetagem suave. Durante 80 x 10 6 células, utilizar 30 ml de vírus tratada com ADNase I (50 ug de p24-vírus equivalente). NOTA: Isolamento de PICs funcional requer infectar as células-alvo com muito altas multiplicidades de infecção (MOI). </li><li> Distribua a mistura uniformemente entre duas placas de cultura de tecidos de 6 poços (ou seja, 12 alíquotas x 2,5 ml; usar 2 placas por infectaríon). </li><li> Para spinoculation, colocar as placas de cultura em suportes de pratos, e centrífuga utilizando um rotor basculante a 480 xg e 25 ° C durante 2 h. </li><li> Incubar as células a 37 spinoculated ° C e 5% de CO 2 durante 5 h. </li></ol> 3. colheita e lise de células infectadas (laboratório BSL3) <ol><li> Reunir as células correspondentes a cada infecção a partir das placas de cultura para um tubo de 50 mL cónico de centrifugação (~ 30 mL no total). </li><li> Colher as células por centrifugação a 300 xg e 25 ° C durante 10 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante do tubo (em alternativa, usar uma pipeta). </li><li> Para remover todas as partículas virais residuais, lavar cada pelete de células por adição de 2 ml de tampão de K - / - (KCl 150 mM, HEPES 20 mM, pH 7,6, 5 mM de MgCl2) e centrifugando a amostra a 300 xg e 25 ° C durante 10 min. Em seguida, sem perturbar o sedimento, remover cuidadosamente o sobrenadante por aspiração ou usando uma pipeta. </li><li> REPEAt passo 3.3. </li><li> Cuidadosamente remover qualquer tampão residual, utilizando uma micropipeta. Ressuspender cada pelete de células em 2 ml de gelo-frio de tampão de lise de K + / + (tampão de K - / - suplementado com 0,025% de digitonina, DTT 1 mM, 20 ug / ml de aprotinina), misturar o conteúdo por pipetagem suave, e transferir para um 2 mL tubo de microcentrífuga. </li></ol> 4. Preparação de PICs Citoplasmáticas (laboratório BSL3) <ol><li> Balançar as amostras num agitador rotativo à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Centrifugar as amostras, com o rotor pré-arref ecido a 4 ° C, a 1.500 xg e 4 ° C durante 4 min. </li><li> Sem perturbar o sedimento, transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco e centrifuga-se a 16.000 xg e 4 ° C durante 1 min. </li><li> Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo de microcentrifugação fresco. Adicionar RNase A (20 mg / ml) para uma concentração final de 20 ug / mL (2 mL para 2 mL de PICs) e incuba-se o conteúdo à TA durante 30 minutos (sem balanço). &lt;/ Li&gt; <li> Adicionar sacarose (60% w / v em tampão de K - / -) para uma concentração final de 7% e misturar bem por pipetagem suave. Preparar alíquotas (por exemplo, 200? L) de PICs em tubos de microcentrífuga, de flash por congelação em azoto líquido, e colocar num congelador de -80 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 5. In Vitro Integração (IVI) Ensaios Usando HIV-1 PICs <ol><li> Prepara-se o ADN alvo utilizado no ensaio IVI por amplificação de uma região de 2,0 kb do DNA de plasmídeo com phiX174 PCR utilizando iniciadores feitos por medida, phiX174-F e phiX174-R. <ol><li> Montar a mistura de PCR como descrito na Tabela 1. Executar PCR num termociclador utilizando as condições de ciclos térmicos recomendadas na Tabela 2. Gel-purificar o produto de PCR utilizando um kit de purificação em gel (seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante), e armazenar o ADN alvo purificado como alíquotas a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol></li><li> Adicionar 600 ng de ADN alvo de 200 - &amp; #181; L alíquota de PICs, misturar bem e incubar a 37 ° C durante 45 min. Nota: As reacções IVI omitindo ADN alvo ou incluindo um inibidor de integrase (por exemplo, raltegravir) são recomendados reacções de controlo. </li><li> Parar a reacção por adição de IVI de SDS, EDTA e proteinase K para concentrações finais de 0,5%, 8 mM e 0,5 mg / mL, respectivamente. Misturar os conteúdos da reacção bem e incubar durante a noite a 56 ° C. </li><li> No dia seguinte, purificar o ADN total a partir da reacção IVI por extracção com fenol / clorofórmio e precipitação com etanol. Realizar todas as etapas de centrifugação a 16.000 xg e RT. </li><li> Adicionar um volume igual de fenol com a amostra desproteinizado, mistura-se vigorosamente por vortex e centrifugação durante 2 min. Cuidadosamente remover a fase aquosa superior e transferi-lo para um tubo fresco. </li><li> Repita o passo 5.5. Transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco. </li><li> Adicionar um volume igual de 1: 1 fenol: mistura de clorofórmio, mistura-se vigorosamente por vortex, centrifugação e foR 2 min. Transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco. </li><li> Adicionar um volume igual de clorofórmio, mistura-se vigorosamente em vortex, e centrifuga-se durante 2 min. Transferir a fase aquosa superior para um tubo fresco. </li><li> Para precipitar o DNA, adicionar glicogénio a uma concentração final de 0,1 mg / mL, 3 M de acetato de sódio a uma concentração final de 0,3 M e 2,5 volumes de etanol a 100% (arrefecido com gelo). Vortex para misturar, brevemente centrífuga para recolher o conteúdo, e colocar o tubo à temperatura de -80 ° CO / N. </li><li> No dia seguinte, centrifugar a amostra durante 30 min a 16000 xg e 4 ° C durante 30 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. </li><li> Adicionar 500 ul de etanol a 80% (arrefecido com gelo) ao sedimento e centrifuga-se a 16.000 xg e 4 ° C durante 10 min. Secar o sedimento de DNA à TA e ressuspender completamente em 50 ul de água isenta de nuclease. Armazenar as amostras de ADN a -20 ° C. </li></ol> 6. Os ensaios de PCR para quantificar PIC Atividade <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; NOTA: O número de cópias de ADN de HIV-1 integrado no ADN alvo é quantificada por uma estratégia de PCR aninhada que emprega 2 conjuntos de iniciadores e 2 rondas sequenciais de PCR. <ol><li> Realizar a primeira ronda de PCR convencional utilizando iniciadores de segmentação da LTR viral e o ADN phiX174 (iniciadores LTR e phiX174, respectivamente) para amplificar as junções do ADN integrado de HIV-1. <ol><li> Monte da mistura de PCR da primeira rodada tal como descrito na Tabela 3. Montar uma mistura principal de todos os componentes, excluindo o ADN molde, dispensar-se alíquotas de 45 uL para dentro de tubos de PCR separadas, e adicionam-se 5 ul de DNA molde ou água livre de nuclease (controlo). </li><li> Executar PCR num termociclador utilizando as condições de ciclos térmicos recomendadas na Tabela 4. </li></ol></li><li> Realizar a segunda rodada qPCR utilizando iniciadores que ladeiam uma pequena região do LTR viral (LTR-R e primers LTR-U) para amplificar seletivamente as sequências vDNA integrados do primeiro-round produtos de PCR. Para determinar os números de cópias integradas vDNA, gerar uma curva padrão, utilizando 10x diluições em série de números de cópias conhecidos (por exemplo, 10 0 - 10 8) do clone molecular de VIH-1. <ol><li> Montar a mistura qPCR segunda rodada, conforme descrito na Tabela 5. Montar uma mistura principal de todos os componentes, excluindo o ADN molde, cuidadosamente dispensar 25 mL alíquotas para um número adequado de poços em um de 96 poços de PCR placa de reacção, e, em seguida, adicionam-se 5 mL da primeira ronda não purificada produtos de PCR ou água livre de nuclease (ao controle). Executar todas as reações de qPCR em triplicado. </li><li> Carregar a placa de PCR para o equipamento de PCR em tempo real e efectuar qPCR utilizando as condições de ciclização recomendadas na Tabela 6. </li><li> Analisar os dados utilizando um software adequado. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não competindo interesses financeiros e não financeiros.

análises bioquímicas de PICs retrovirais têm proporcionado uma visão crítica sobre o mecanismo de integração do DNA retroviral. Medição da actividade de integração de PICs retrovirais pode ser conseguida por ensaio de placas de formação, a análise de mancha de Southern, e nested qPCR. A estratégia experimental do ensaio de placa é trabalhoso e utiliza um método indirecto para medir a integração 6, 7, 18. Integração ensaios medi...

Replicação de HIV-1 na célula alvo envolve vários passos, agrupadas em duas fases: eventos precoces e tardias. Os eventos iniciais começam quando o HIV-1 liga-se a sequência do receptor de superfície da célula alvo CD4 e um dos dois co-receptores (CCR5 ou CXCR4) 1. Por conseguinte, o fusível membranas de células com vírus, e a cápside virai (CA) do núcleo é libertado para o citoplasma 2. O núcleo CA contenha o ARN virai genómico de cadeia simples (ssRNA) e várias proteínas, tanto virais e celulares na origem. As proteínas virais associadas-CA incluem Transcriptase Reversa (RT) e da integrase (IN), duas enzimas que medeiam passos críticos durante eventos precoces da replicação viral. A RT e IN função no contexto de complexos nucleoproteicos, nomeadamente a transcrição reversa Complexo (RTC) e o complexo de pré-integração (PIC), respectivamente 3, 4, 5 &lt;sup&gt;, 6. As extremidades do genoma viral ssRNA terminal do porto de repetição (R) elementos adjacentes às sequências U5 única (na extremidade 5 &#39;) e U3 (na extremidade 3&#39;). O RTC converte o genoma viral num ssRNA (DS) de cópia de ADN de cadeia dupla (vDNA). Este processo de transcrição reversa também resulta na duplicação das sequências U5 e U3, gerando, assim, repetições terminais longas (LTR) em ambas as extremidades do vDNA 7, 8. Subsequentemente, o EM-associado PIC catalisa duas reacções bioquímicas sequenciais que permitem a integração do vDNA no cromossoma do hospedeiro 9, 10, 11. Em primeiro lugar, no citoplasma, EM multímeros envolver ambas as LTRs 12 e clivar um dinucleótido de cada uma das extremidades 3 &#39;-terminal. Este processamento de extremidade 3 &#39;gera um grupo hidroxilo em cada extremidade 3&#39; (CA OH) do vDNA.Em seguida, o PIC trafica para o núcleo, em que utiliza o vDNA CA OH como um nucleófilo para cortar ambas as cadeias do ADN cromossómico de forma escalonada. Simultaneamente, EM coordenadamente emendas de ambas as extremidades do vDNA para as ligações fosfodiéster que resultam em cadeias opostas do ADN cromossómico. Após este passo de transferência de cadeia, a maquinaria da célula hospedeira remove os dois nucleótidos desemparelhados nas extremidades 5 &#39;do vDNA e repara as consequentes lacunas de cadeia simples na junção do local de integração. Os eventos iniciais, assim, culminar com a criação de uma cópia de DNA integrado (provírus) do HIV-1 genoma. O provírus proporciona um ambiente apropriado para a expressão do gene virai eficiente, o que inicia os eventos posteriores, incluindo a expressão das proteínas codificadas por vírus; montagem do vírus imaturo; e brotação, release, e maturação em viriões infecciosos 13. Purificada IN retroviral recombinante é competente pararealizar, in vitro, ambas as atividades de processamento e transferência de cadeia 3&#39;-end em exogenamente fornecido DNA substrato LTR-like. Os estudos bioquímicos usando tais IN recombinante purificada revelaram aspectos críticos da integração vDNA 14, 15, 16, 17. No entanto, ao contrário da infecção natural, esta reacção bioquímica in vitro não suporta integração combinada de ambas as extremidades do ADN substrato para a DNA-alvo. Em contraste, os PICs retrovirais isolados a partir de células infectadas de forma aguda concertadamente integrar ambas as extremidades do vDNA endógena no ADN alvo heterólogo. Isto levou à adopção generalizada e refinamentos subsequentes de ensaios in vitro Integração (IVI) I n usando PICs nativas isoladas. No primeiro ensaio relatado retroviral IVI, extractos citoplasmáticos de células infectadas com um recombinante de murinoVírus da Leucemia (MLV) que alberga o gene de E. coli supF na sua LTR serviu como fonte de actividade em, e o ADN de um fago lambda mutante defeituoso no crescimento lítico foi fornecido exogenamente como o ADN alvo. A integração bem sucedida do ADN recombinante MLV copiar para o ADN de fago e a expressão consequente supF levou a restauração da capacidade de formação de placas de fagos recombinantes. No entanto, esta estratégia experimental é a integração trabalhoso e medidas de forma indireta. Para lidar com estas advertências, um ensaio de marcação terminal indirecta à base de Southern blot, que quantifica a actividade associada IVI-PIC como uma medida da vDNA endógena exógeno integrado no bacteriófago linearizado phiX174 ADN, foi desenvolvido 6, 7, 18. Embora este método proporciona uma medida directa de eventos de integração, quantidades relativamente elevadas de preparação PIC são necessários, o que continua a ser um desafio técnicoesforço. Para contornar isso, aninhados ensaios baseados em PCR que exigem apenas quantidades modestas de PICs foram desenvolvidos 4, 5, 19. Neste relatório, nós descrevemos uma versão atualizada de um nested PCR baseado no método in vitro concebido para recapitular a atividade de integração do HIV-1 PIC-mediada que ocorrem durante a infecção natural. Este método utiliza os extractos citoplasmáticos de células alvo de HIV-1-infectadas como uma fonte de actividade PIC endógena, que é medido com um tempo real Polimerase Chain Reaction quantitativa (qPCR). Os procedimentos para isolar PICs e medir suas atividades de integração são adaptados, com modificações, a partir de protocolos publicados pelo laboratório Engelman 20. Neste método, a actividade de integração associada-PIC é iniciado, fornecendo um ADN alvo exógeno linear 21, e os produtos de DNA resultantesesta reacção integração são purificados e utilizados como material de partida para a quantificação baseado no PCR subsequente. Na primeira ronda de PCR convencional, as junções de ADN viral-alvo são amplificados utilizando iniciadores apropriados. Na segunda rodada qPCR, primers específicos de LTR são usadas para enriquecer especificamente a população vDNA do primeiro turno produtos de PCR. Por favor, consulte a seção de protocolo para uma descrição detalhada deste método. Estudos in vitro com PICs retrovirais têm conduzido a avanços significativos na compreensão do mecanismo de integração de ADN retroviral e no desenvolvimento de inibidores de NOS. Com base na recente foco maior sobre mapeamento de HIV-1 sites de integração, determinar o papel dos fatores virais e do hospedeiro na HIV-1 integração e desenvolvimento de novas drogas antivirais para o combate à resistência aos medicamentos, prevemos um aumento do interesse e uso generalizado de ensaios IVI , como o descrito no presente relatório. Este, por sua vez, levará afuturos aperfeiçoamentos no método, diversificando assim o alcance de suas aplicações.

<table><tbody><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Inativado por Calor (Hi-FBS)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 10438-026 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM) </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 meio </td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 20012-027 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,25%) </td><td> GIBCO/Invitrogen < </td><td> p>25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-Estreptomicina solução (100x) </td><td> Cellgro/Mediatech </td><td> 30-002-CI </td><td></td></tr><tr><td> HEK293T células (293T) </td><td> Coleção Americana de Cultura de Tipo (ATCC) </td><td> CRL-3216 </td><td></td></tr><tr><td> HIV-1 clone molecular proviral pNL4-3 </td><td> NIH Programa de Pesquisa e Reagente de Referência em AIDS </td><td> 114 </td><td></td></tr><tr><td> Reagente de transfecção PolyFect </td><td> Qiagen </td><td> 301107 </td><td></td></tr><tr><td>DNase 1 </td><td> Calbiochem/Merckmillipore </td><td> 260913 </td><td></td></tr><tr><td>Células Sup-T1</td><td> American Type Culture Collection (ATCC) </td><td> CRL-1942 </td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,2 - 7,5 (solução pronta para uso)</td><td> GIBCO/Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de cloreto de potássio (KCl) </td><td> Sigma-Aldrich< </td><td> p>60142 </td><td></td></tr><tr><td> ><solução de cloreto de magnésio (MgCl2<> </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1028 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitol (DTT) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 43815 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinina </td><td> Sigma-Ald<rich /p> </td><td> A6106 </td><td></td></tr><tr><td> Digitonin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D141 </td><td></td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Invitrogen </td><td> 12091-021 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> phiX174 DNA da Forma Replicativa 1 </td><td> Promega </td><td> D1531 </td><td></td></tr><tr><td> < > PhiX174-F primer: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen e/ou IDT-DNA </td><td> </td><td></td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> Go Taq DNA Polimerase </td><td> Promega </td><td> M3005 </td><td></td></tr><tr><td> Qiaquick kit de extração de gel </td><td> Qiagen </td><td> 28706 </td><td></td></tr><tr><td> Água destilada ultrapura </td><td> Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td>tampão Tris-EDTA (TE) (100x)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Dodecil de Sódio (SDS)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico (EDTA), 0,5 M, pH 8,0 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K (20 mg/mL de solução pronta para uso)</td><td> Qiagen </td><td> 19131 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol (equilibrado com 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0 e 1&nbsp; mM EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4557 </td><td></td></tr><tr><td> Clorofórmio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 288306 </td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio (solução de 5 mg/mL)</td><td> Ambion/Invitrogen </td><td> AM9510 </td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio (3 M, pH 5,2)</td><td> Sigma-Aldrich </td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td><td></td></tr><tr><td>Primeira rodada LTR primer: 5'-GTGCGCGCTTCTCAGCAAGCAAG-3' Primeira rodada phiX174 primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3' </td><td> Invitrogen e/ou IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td>Segunda rodada LTR-R primer: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Segunda rodada LTR-U primer: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' Segunda rodada de investigação Taqman: &nbsp; 5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3' </td><td> Invitrogen e/ou IDT-DNA </td><td> --- </td><td></td></tr><tr><td> iQ Supermix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td></td></tr></tbody></table>

medição de in vitro actividade integração do hiv-1 de pré-integração complexos

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

proteínas de HIV-1 envelope envolver receptores cognatos na superfície da célula-alvo, o que leva a fusão da membrana da célula virai seguida pela libertação do núcleo da cápside virai (CA) para o citoplasma. Subsequentemente, a transcriptase reversa virai (RT), como parte de um complexo homónimo nucleoproteína denominado o complexo Transcrição Reversa (RTC), converte o genoma de ARN viral de cadeia simples em uma cópia de ADN de cadeia dupla (vDNA). Isto leva a biogénese de outro complexo de nucleoproteínas, denominado o complexo de pré-integração (PIC), composto do vDNA e proteínas de vírus associados e factores do hospedeiro. A integrase viral associada-PIC (EM) orquestra a integração do vDNA no ADN cromossómico do hospedeiro em um processo de duas etapas espacialmente e temporalmente regulado. Em primeiro lugar, o nos processos de extremidades 3 &#39;do vDNA no citoplasma e, em segundo lugar, após o PIC trafica para o núcleo, que medeia a integração do vDNA processado no ADN cromossómico. Os PICs isoladoa partir de células-alvo infectados de forma aguda com HIV-1 são funcionais in vitro, uma vez que são competentes para integrar o vDNA associado num ADN alvo heterólogo adicionado exogenamente. Tal-PIC com base em ensaios in vitro de integração têm contribuído significativamente para delinear os detalhes mecanicistas de integração retroviral e descobrindo em inibidores. Neste relatório, nós elaboramos sobre um ensaio PIC HIV-1 actualizado que emprega uma estratégia baseada aninhada em tempo real Polymerase Chain Reaction quantitativa (qPCR) para medir a atividade de integração in vitro de PICs nativas isoladas.

O isolamento do VIH-1 PICs Um esquema do protocolo usado para o isolamento de PICs do VIH-1 a partir de células SUP-T1 infectados de forma aguda é representada na Figura 1. Este protocolo é derivado a partir dos métodos descritos por Engelman et ai. 19, 20. PICs do VIH-1 são complexos nucleoproteicos que são montados em célula...

Este relatório descreve um ensaio in vitro para medir a atividade de integração associada ao complexo de pré-integração (PIC) do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) nos extratos citoplasmáticos de células agudamente infectadas. A integração do DNA do HIV-1 associado a PIC no DNA alvo heterólogo é quantificada usando uma estratégia de reação em cadeia da polimerase em tempo real aninhada.

Medição de In Vitro Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade de integração in vitro de complexos de pré-integração, ou PICs, isolados de células SupT1 infectadas pelo HIV-1. Este método responderá a algumas das questões-chave na biologia do HIV, especificamente como certos fatores do hospedeiro e fatores virais, por exemplo, capsídeo viral, desempenham um papel na integração do DNA do HIV-1, e isso nos ajudará a projetar ou identificar novos alvos para a terapia antirretroviral. A principal vantagem deste método é que ele requer uma quantidade relativamente pequena do complexo de pré-integração, ou PIC, preparação para medir a atividade de integração in vitro.As implicações dessa técnica podem se estender ao diagnóstico e à terapia do HIV-1 AIDS, e isso ocorre porque as versões anteriores dessa técnica foram críticas na descoberta dos inibidores da integrase do HIV-1, que são um dos principais medicamentos anti-HIV em uso clínico hoje, portanto, esse método pode não ser usado apenas para entender a integração do HIV-1, mas também pode ser aplicado para estudar outros retrovírus, como RSV e MLV. Demonstrando este protocolo estará o Dr. Muthukumar Balasubramaniam, que é pós-doutorando no laboratório. Para infectar SupT1 com HIV-1, em um laboratório BSL-2, mantenha as células SupT1 entre uma e duas vezes 10 elevado a sexta células por mililitro em Roswell Park Memorial Institute ou meio RPMI suplementado com 10% de FBS e Pen-Strep.Depois de gerar altos títulos de HIV-1 infeccioso de acordo com o protocolo de texto, agrupe as células SupT1 dos frascos de cultura, misture bem por pipetagem e use a coloração de exclusão com azul de tripano em um hemocitômetro para determinar a contagem de células viáveis. Alíquota oito vezes 106 células por infecção viral em tubos de centrífuga cônicos de 50 mililitros e, em seguida, centrifugue as células em um rotor de balde oscilante a 500 vezes g e 25 graus Celsius por cinco minutos. Sem remover o meio de cultura de células, transfira os tubos contendo células peletizadas para o laboratório BSL-3 para processamento posterior e, em seguida, aspire cuidadosamente o meio do tubo sem perturbar o pellet.Em seguida, adicione 30 mililitros de inóculo do vírus tratado com DNase I às células e misture pipetando suavemente, depois distribua a mistura uniformemente entre duas placas de cultura de tecidos de seis poços. Para a inoculação, coloque as placas de cultura em porta-placas e centrifugue em um rotor de balde oscilante a 480 vezes g e 25 graus Celsius por duas horas, depois incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Para colher e lisar as células infectadas, agrupe as células correspondentes a cada infecção em um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros.Centrifugue as células a 300 vezes g e 25 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, aspire ou pipete cuidadosamente o sobrenadante. Para remover quaisquer partículas residuais de vírus, lave cada pellet adicionando dois mililitros de tampão K menos menos e gire a amostra novamente, em seguida, sem perturbar o pellet, remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração ou com uma pipeta antes de repetir a lavagem mais uma vez. Depois de remover cuidadosamente qualquer tampão residual com uma micropipeta, use o tampão de lise gelada K plus plus plus para ressuspender suavemente cada pellet e transferir para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.Para preparar complexos de pré-integração citoplasmática, ou PICs, agite a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos, depois coloque os tubos em um rotor pré-resfriado a quatro graus Celsius e centrifugue a 1.500 vezes g e quatro graus Celsius por quatro minutos. Sem perturbar o pellet, transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e centrifugar a 16 000 vezes g e quatro graus Celsius durante um minuto. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga, adicionar a RNase A a uma concentração final de 20 microgramas por mililitro e incubar o conteúdo à temperatura ambiente sem balançar durante 30 minutos.Adicione sacarose a uma concentração final de 7% e misture bem pipetando suavemente e, em seguida, prepare alíquotas dos PICs em tubos de microcentrífuga. Congele rapidamente em nitrogênio líquido e coloque em um freezer negativo de 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Para preparar o DNA alvo usado na integração in vitro ou no ensaio IVI, monte as misturas de PCR para amplificar uma região de 2,0 quilobases do DNA do plasmídeo phiX174 usando os primers personalizados phiX174-Forward e phiX174-Reverse, e realize a PCR usando o programa de acordo com o protocolo de texto.Após a purificação do gel e aliquotação da amostra, adicione 600 nanogramas de DNA alvo a 200 microlitros de PICs. Misture bem e incube a 37 graus Celsius por 45 minutos. Pare a reação IVI adicionando SDS, EDTA e proteinase K, depois misture bem o conteúdo da reação e incube a 56 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, para purificar o DNA total da reação IVI, adicione um volume igual de fenol à amostra desproteinizada. Misturar vigorosamente por vórtice e centrifugar durante dois minutos. Remova cuidadosamente a fase aquosa superior e transfira-a para um tubo novo antes de repetir a extração de fenol, em seguida, adicione um volume igual de um para um clorofórmio de fenol.Misturar a amostra por vórtice e centrifugar o tubo durante dois minutos, depois transferir a fase aquosa superior para um novo tubo. Após a extração com clorofórmio de acordo com o protocolo de texto, precipite o DNA da fase aquosa adicionando 0,1 microgramas por microlitro de glicogênio, acetato de sódio 0,3 molar e 2,5 volumes de etanol 100% gelado. Coloque o tubo a 80 graus Celsius negativos durante a noite.No dia seguinte, centrifugar a amostra a 16 000 vezes g e a quatro graus Celsius durante 30 minutos e, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Para realizar a PCR para quantificar a atividade do PIC, comece com a primeira rodada de PCR convencional usando primers direcionados ao LTR viral e ao DNA phiX174 para amplificar as junções do DNA integrado do HIV-1. Monte a mistura principal menos o DNA molde conforme descrito aqui, depois dispense alíquotas de 45 microlitros em tubos de PCR separados e adicione cinco microlitros de DNA molde ou água livre de nuclease como controle.Execute a reação em um termociclador usando o programa descrito no protocolo de texto, depois faça uma segunda rodada de PCR quantitativo e analise os dados de acordo com o protocolo de texto. Neste ensaio de IVI, SupT1 foi espinoculado com DNAse I tratada com HIV-1 e a ausência ou presença do inibidor da integrase do HIV-1, Raltegravir. Após a incubação, os PICs foram isolados e o DNA purificado foi analisado para a integração do DNA viral.Como mostrado aqui, os PICs do HIV-1 integram de forma robusta o DNA viral associado ao DNA alvo e a eficiência do IVI dos PICs foi bastante reduzida nas reações suplementadas com Raltegravir, o que implica fortemente a atividade de integração medida neste ensaio à integrase do HIV-1. As reações de controle não mostraram nenhuma atividade de integração. Além disso, o controle que excluiu a Taq polimerase na primeira rodada de PCR não amplificou os produtos de integração.Notavelmente, os dados do controle PICs sozinho indicaram que a estratégia de qPCR aninhada mediu especificamente o DNA viral integrado, mas não o DNA viral associado ao PIC. Coletivamente, esses dados demonstram a atividade de integração associada ao PIC. Uma vez dominados, a preparação do vírus e os ensaios de PCR para quantificar a atividade do PIC podem ser concluídos em uma semana.A infecção das células SupT1 e o isolamento dos PICs das células infectadas podem ser feitos em um dia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar PICs do HIV-1 e medir a atividade de integração in vitro. Não se esqueça de que trabalhar com altos títulos de HIV-1 infeccioso pode ser extremamente perigoso e as precauções apropriadas, incluindo roupas de proteção, como aventais e aventais, luvas duplas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Desencapsulamento é um passo essencial na fase inicial do ciclo de vida do HIV-1 e é definido como a desmontagem do shell capsídeo ea liberação do complexo de ribonucleoproteína viral (vRNP). Aqui, nós demonstrar técnicas para isolar núcleos intactos de HIV-1 virions e para quantificar a sua...

Em desencapsulamento vitro do HIV-1 Cores

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Este vídeo demonstra o ensaio de fosfatase alcalina embrionária secretada usando células repórter HEK-Blue interferon-α/β para quantificar os interferons tipo I (IFNs) liberados após a estimulação de células dendríticas plasmocitoides por células T CD4+ infectadas pelo HIV-1.

Quantificação de interferons bioativos tipo I usando um ensaio repórter de fosfatase alcalina embrionária secretada

Compreender as conformações dos antígenos de superfície viral é necessário para avaliar a neutralização de anticorpos e orientar o projeto de imunógenos vacinais eficazes. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite o estudo do reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 expresso na superfície das células transfectadas por anticorpos anti-Env específicos.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

Técnicas que descrevem um procedimento de gradiente para separar exossomos de partículas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) são descritas. Este procedimento foi usado para isolar exossomos de partículas de HIV no plasma humano de indivíduos infectados pelo HIV. Os exossomos isolados foram analisados quanto ao conteúdo de citocinas/quimiocinas.

Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Métodos para avaliar a eficácia e toxicidade de moléculas de RNA visando etapas pós-integração do ciclo de replicação do HIV-1 são descritos. Esses métodos são úteis para rastrear novas moléculas e otimizar o formato das existentes.

Avaliação da eficácia e toxicidade de RNAs Segmentação HIV-1 Produção para uso em Gene ou Quimioterapia

Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados ​​para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Infecção de tecidos humanos com vírus de imunodeficiência humana (HIV) ex vivo fornece um valioso modelo 3D da patogênese do vírus. Aqui, descrevemos um protocolo para processar e infectar amostras de tecido da amígdalas humanas e mucosa genital feminina com HIV-1 e mantê-las em cultura em uma interface líquido-ar.

Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

Aqui, descrevemos alguns métodos estabelecidos para determinar o estresse do retículo endoplasmático (ER) e a ativação da resposta proteica desdobrada (UPR), com ênfase particular na infecção pelo HIV-1. Este artigo também descreve um conjunto de protocolos para investigar o efeito do estresse do RE/UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion.

Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

Aprenda a medir a atividade de integração de complexos de pré-integração do HIV-1 in vitro usando células SupT1 infectadas. Este método auxilia na identificação de alvos para terapia antirretroviral.

Medição de In Vitro Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

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