Medição de In Vitro Actividade integração do HIV-1 de pré-integração Complexos

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade de integração in vitro de complexos de pré-integração, ou PICs, isolados de células SupT1 infectadas pelo HIV-1. Este método responderá a algumas das questões-chave na biologia do HIV, especificamente como certos fatores do hospedeiro e fatores virais, por exemplo, capsídeo viral, desempenham um papel na integração do DNA do HIV-1, e isso nos ajudará a projetar ou identificar novos alvos para a terapia antirretroviral. A principal vantagem deste método é que ele requer uma quantidade relativamente pequena do complexo de pré-integração, ou PIC, preparação para medir a atividade de integração in vitro.

As implicações dessa técnica podem se estender ao diagnóstico e à terapia do HIV-1 AIDS, e isso ocorre porque as versões anteriores dessa técnica foram críticas na descoberta dos inibidores da integrase do HIV-1, que são um dos principais medicamentos anti-HIV em uso clínico hoje, portanto, esse método pode não ser usado apenas para entender a integração do HIV-1, mas também pode ser aplicado para estudar outros retrovírus, como RSV e MLV. Demonstrando este protocolo estará o Dr. Muthukumar Balasubramaniam, que é pós-doutorando no laboratório. Para infectar SupT1 com HIV-1, em um laboratório BSL-2, mantenha as células SupT1 entre uma e duas vezes 10 elevado a sexta células por mililitro em Roswell Park Memorial Institute ou meio RPMI suplementado com 10% de FBS e Pen-Strep.

Depois de gerar altos títulos de HIV-1 infeccioso de acordo com o protocolo de texto, agrupe as células SupT1 dos frascos de cultura, misture bem por pipetagem e use a coloração de exclusão com azul de tripano em um hemocitômetro para determinar a contagem de células viáveis. Alíquota oito vezes 106 células por infecção viral em tubos de centrífuga cônicos de 50 mililitros e, em seguida, centrifugue as células em um rotor de balde oscilante a 500 vezes g e 25 graus Celsius por cinco minutos. Sem remover o meio de cultura de células, transfira os tubos contendo células peletizadas para o laboratório BSL-3 para processamento posterior e, em seguida, aspire cuidadosamente o meio do tubo sem perturbar o pellet.

Em seguida, adicione 30 mililitros de inóculo do vírus tratado com DNase I às células e misture pipetando suavemente, depois distribua a mistura uniformemente entre duas placas de cultura de tecidos de seis poços. Para a inoculação, coloque as placas de cultura em porta-placas e centrifugue em um rotor de balde oscilante a 480 vezes g e 25 graus Celsius por duas horas, depois incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Para colher e lisar as células infectadas, agrupe as células correspondentes a cada infecção em um tubo de centrífuga cônico de 50 mililitros.

Centrifugue as células a 300 vezes g e 25 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, aspire ou pipete cuidadosamente o sobrenadante. Para remover quaisquer partículas residuais de vírus, lave cada pellet adicionando dois mililitros de tampão K menos menos e gire a amostra novamente, em seguida, sem perturbar o pellet, remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração ou com uma pipeta antes de repetir a lavagem mais uma vez. Depois de remover cuidadosamente qualquer tampão residual com uma micropipeta, use o tampão de lise gelada K plus plus plus para ressuspender suavemente cada pellet e transferir para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Para preparar complexos de pré-integração citoplasmática, ou PICs, agite a amostra à temperatura ambiente por 10 minutos, depois coloque os tubos em um rotor pré-resfriado a quatro graus Celsius e centrifugue a 1.500 vezes g e quatro graus Celsius por quatro minutos. Sem perturbar o pellet, transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga e centrifugar a 16 000 vezes g e quatro graus Celsius durante um minuto. Transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga, adicionar a RNase A a uma concentração final de 20 microgramas por mililitro e incubar o conteúdo à temperatura ambiente sem balançar durante 30 minutos.

Adicione sacarose a uma concentração final de 7% e misture bem pipetando suavemente e, em seguida, prepare alíquotas dos PICs em tubos de microcentrífuga. Congele rapidamente em nitrogênio líquido e coloque em um freezer negativo de 80 graus Celsius para armazenamento de longo prazo. Para preparar o DNA alvo usado na integração in vitro ou no ensaio IVI, monte as misturas de PCR para amplificar uma região de 2,0 quilobases do DNA do plasmídeo phiX174 usando os primers personalizados phiX174-Forward e phiX174-Reverse, e realize a PCR usando o programa de acordo com o protocolo de texto.

Após a purificação do gel e aliquotação da amostra, adicione 600 nanogramas de DNA alvo a 200 microlitros de PICs. Misture bem e incube a 37 graus Celsius por 45 minutos. Pare a reação IVI adicionando SDS, EDTA e proteinase K, depois misture bem o conteúdo da reação e incube a 56 graus Celsius durante a noite.

No dia seguinte, para purificar o DNA total da reação IVI, adicione um volume igual de fenol à amostra desproteinizada. Misturar vigorosamente por vórtice e centrifugar durante dois minutos. Remova cuidadosamente a fase aquosa superior e transfira-a para um tubo novo antes de repetir a extração de fenol, em seguida, adicione um volume igual de um para um clorofórmio de fenol.

Misturar a amostra por vórtice e centrifugar o tubo durante dois minutos, depois transferir a fase aquosa superior para um novo tubo. Após a extração com clorofórmio de acordo com o protocolo de texto, precipite o DNA da fase aquosa adicionando 0,1 microgramas por microlitro de glicogênio, acetato de sódio 0,3 molar e 2,5 volumes de etanol 100% gelado. Coloque o tubo a 80 graus Celsius negativos durante a noite.

No dia seguinte, centrifugar a amostra a 16 000 vezes g e a quatro graus Celsius durante 30 minutos e, em seguida, remover cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Para realizar a PCR para quantificar a atividade do PIC, comece com a primeira rodada de PCR convencional usando primers direcionados ao LTR viral e ao DNA phiX174 para amplificar as junções do DNA integrado do HIV-1. Monte a mistura principal menos o DNA molde conforme descrito aqui, depois dispense alíquotas de 45 microlitros em tubos de PCR separados e adicione cinco microlitros de DNA molde ou água livre de nuclease como controle.

Execute a reação em um termociclador usando o programa descrito no protocolo de texto, depois faça uma segunda rodada de PCR quantitativo e analise os dados de acordo com o protocolo de texto. Neste ensaio de IVI, SupT1 foi espinoculado com DNAse I tratada com HIV-1 e a ausência ou presença do inibidor da integrase do HIV-1, Raltegravir. Após a incubação, os PICs foram isolados e o DNA purificado foi analisado para a integração do DNA viral.

Como mostrado aqui, os PICs do HIV-1 integram de forma robusta o DNA viral associado ao DNA alvo e a eficiência do IVI dos PICs foi bastante reduzida nas reações suplementadas com Raltegravir, o que implica fortemente a atividade de integração medida neste ensaio à integrase do HIV-1. As reações de controle não mostraram nenhuma atividade de integração. Além disso, o controle que excluiu a Taq polimerase na primeira rodada de PCR não amplificou os produtos de integração.

Notavelmente, os dados do controle PICs sozinho indicaram que a estratégia de qPCR aninhada mediu especificamente o DNA viral integrado, mas não o DNA viral associado ao PIC. Coletivamente, esses dados demonstram a atividade de integração associada ao PIC. Uma vez dominados, a preparação do vírus e os ensaios de PCR para quantificar a atividade do PIC podem ser concluídos em uma semana.

A infecção das células SupT1 e o isolamento dos PICs das células infectadas podem ser feitos em um dia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar PICs do HIV-1 e medir a atividade de integração in vitro. Não se esqueça de que trabalhar com altos títulos de HIV-1 infeccioso pode ser extremamente perigoso e as precauções apropriadas, incluindo roupas de proteção, como aventais e aventais, luvas duplas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.