O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

O objetivo geral desta metodologia ELISpot é permitir a quantificação de células B secretoras de anticorpos humanos do sangue. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo biomédico sobre a imunologia das células B e a pesquisa de vacinas. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a detecção e medição de células B secretoras de anticorpos no nível de uma única célula.

Demonstrando o procedimento estará Tsung-Chih Tseng, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Imediatamente após obter uma amostra de sangue de 10 ml da veia cubital mediana em um tubo de 15 ml contendo EDTA suplementado com potássio, inverta o tubo várias vezes para evitar a formação de coágulos. Em seguida, adicione 35 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos autoclavado às células para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente.

Quando a luz puder ser observada através do tubo, centrifugue o sangue e confirme a presença de um pellet branco. Remova o tampão de lise residual com 10 ml de PBS autoclavado e ressuspenda o pellet em 10 ml de meio RPMI 1640. Coloque as células em uma placa de cultura de 10 cm para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono.

Em seguida, gire suavemente a placa de cultura algumas vezes e transfira as células flutuantes para um tubo cônico de plástico de 15 ml. Após duas lavagens por centrifugação, ressuspender o pellet a cinco a 10 vezes o décimo da concentração de seis células por ml em 200 microlitros de tampão PBS frio e adicionar 5 micro litros de coquetel de anticorpos anti-humanos biotinilados específicos para células sanguíneas por um décimo das sextas células. Após uma incubação de 30 minutos no gelo, lave as células em um volume 10 vezes maior de PBS estéril e ressuspenda o pellet em cinco microlitros de microesferas conjugadas com estreptavidina por uma vez o décimo das seis células para uma incubação de 30 minutos no gelo.

No final da incubação, adicione dois ml de tampão PBS às células e coloque o tubo em um suporte magnético por oito minutos em temperatura ambiente. Quando as microesferas estiverem presas à parede do tubo, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo cônico e adicione mais 2 ml de tampão PBS às células. Após a segunda colheita de sobrenadantes, recolher as células agrupadas por centrifugação e transferi-las para um tubo de poliestireno de cinco ml e tampão PBS fresco a uma concentração de um décimo de sete células por ml.

Depois de realizar o bloqueio não específico, adicione um micrograma de cada anticorpo de seleção por um décimo de cada das seis células ao tubo com mistura suave por 30 minutos de incubação no gelo. Durante os últimos cinco minutos da incubação, adicione cinco microlitros de 7-AAD às células. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS fresco às células e ao vórtice antes de centrifugar.

Ressuspenda o pellet em um tampão de classificação fresco a uma concentração de uma a cinco vezes o décimo das sete células por mililitro e filtre as células através de um filtro de células de 40 mícrons em um novo tubo de poliestireno de cinco mililitros. Em seguida, classifique as células por citometria de fluxo em três tubos de 15 ml contendo 5 ml de meio RPI fresco para coletar as células B virgens, células B de memória e plasmócitos plasmablastos. Quando todas as células tiverem sido colhidas, semeie os subconjuntos em poços individuais de uma placa de cultura de células de 12 poços a uma concentração de uma a dez vezes o décimo da quinta célula por mililitro em meio RPMI fresco.

Em seguida, ative as células B com cinco microgramas de CPG ODN 2006 por um décimo das sextas células por mililitro por poço na incubadora de cultura de células por cinco dias. Ao final da ativação, adicione 30 microlitros de etanol a 35% e água destilada a cada poço das placas ELISpot por 30 segundos. Em seguida, substitua o etanol em cada poço por 150 microlitros de água bidestilada autoclavada e incube as placas em temperatura ambiente por cinco minutos para remover o etanol residual.

Realize uma lavagem com PBS seguida da adição de 50 microlitros do fragmento policlonal FAB2 de IG anti-humano em cada poço. Lave as placas duas vezes com PBS, conforme demonstrado. Bloqueie a ligação não específica em cada poço com 200 microlitros de PBS fresco com BSA por duas horas em temperatura ambiente.

Após outra série de lavagem PBS, incube os poços em 100 microlitros de meio RPMI 1640 fresco a 37 graus Celsius. Em seguida, substitua o meio em cada ELISpot pelo número apropriado de células B ativadas. Traga o volume final de cada poço para 150 microlitros com meio RPMI fresco e, em seguida, retorne a placa ELISpot para a incubadora de cultura de células por oito a 14 horas.

No final do período de incubação, descarte o meio e lave os poços com 200 micro litros de PBS mais tween20 por cinco lavagens de três minutos. Após a última lavagem, adicionar os anticorpos de detecção apropriados aos seus alvéolos correspondentes e incubar as placas durante duas horas no escuro. Após outra série de lavagem PBS, adicione 50 micro litros de substrato BCIPMBT a cada poço por cinco a 15 minutos em temperatura ambiente.

Quando aparecerem manchas roxas, pare a reação com 100 microlitros de água bidestilada por poço e enxágue a placa com água corrente da torneira. Em seguida, seque ao ar livre a membrana ELISpot protegida da luz. Nesta amostra de PBMC do doador, após a lise dos glóbulos vermelhos e a depleção das células aderentes, cerca de 10% dos linfócitos eram células B CD19 positivas.

No compartimento de células B, cerca de 50% das células eram células B virgens CD27 negativas e 50% eram células B de memória que expressam CD27. O tratamento CPG de células B humanas purificadas e CD19 + CD27 + por cinco dias, como acabamos de demonstrar, normalmente resulta na geração de 50 a 200 IgM e 10 a 50 células secretoras de anticorpos IgG de uma vez dez à quarta células B ativadas. Uma vez dominada, esta técnica ELISpot pode ser concluída em três horas se for executada corretamente.

Antes de iniciar este procedimento, é importante lembrar de codificar o local com reagentes de captura apropriados para detectar as células secretoras de anticorpos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da vacinologia explorarem a eficácia da vacina em ensaios em larga escala e acompanhamentos longitudinais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar as células B humanas do sangue.

Separe as células B ingênuas e de memória para sua diferenciação e realize um ensaio ELISpot para qualificar as células secretoras de anticorpos. Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano pode ser perigoso e que precauções como o uso de luvas devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.