Name: O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a isolar, diferenciar e quantificar células B secretoras de anticorpos humanos do sangue usando o ensaio ELISpot. Este método permite detectar células produtoras de IgM e IgG em nível de célula única.

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Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Ministério da Ciência e Tecnologia do Yuan Executivo de Taiwan (NSC99-2320-B-002-011). Gostaria de reconhecer o excelente serviço prestado pelo Núcleo de Análise e Classificação por Citometria de Fluxo do Primeiro Laboratório Central da Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Taiwan.

sangue periférico humano deve ser obtido a partir de dadores saudáveis ​​sob consentimento informado, bem como a utilização de amostras de sangue devem estar em conformidade com as orientações aprovadas estabelecidas por conselhos de revisão institucionais individuais. Neste estudo, o protocolo de usar sangue humano em uma demonstração dos resultados de citometria de fluxo (Figura 1) e ensaios ELISPOT (Figura 3) foi aprovado pelo Conselho de Revisão Interna do National Taiwan University Hospital (número de protocolo 201307019RINB). 1. Isolamento e purificação de células B de sangue periférico humano <ol><li> Desenhar ~ 10 mL de sangue a partir da veia cubital mediana (no anterior fossa cubital ao cotovelo) para um tubo de 15 ml, contendo K 2 EDTA (1,5 a 2,0 mg / mL de sangue) e inverter imediatamente o tubo várias vezes para evitar coágulos formação. </li><li> Adicionar 35 mL de autoclavada (121 ° C, 15 min) de glóbulos vermelhos (RBC) de tampão de lise (150 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3, e EDTA 1 mM; pH 7,4) ao tubo que contém a amostra de sangue fresco (≥ 3: 1 v / v) e incuba-se à temperatura ambiente (TA) durante não mais do que 5 minutos. NOTA: O aparecimento de transmissão de luz através do tubo indica a conclusão de lise de RBC. </li><li> Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Certifique-se de que o sedimento é de cor branca. </li><li> Ressuspender o sedimento com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato autoclavado (PBS, 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 4,3 mM de Na 2 HPO 4, e 1,47 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) e centrifuga-se tal como no passo 1.3. </li><li> Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com 10 ml de meio RPMI 1640 (suplementos: 10% de soro fetal de vitelo, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 0,25 mg / mL de anfotericina B, e 2 mM de L-glutamina), e, em seguida, a chapa células em uma placa de cultura de 10 cm (10 ml de sangue por prato). Colocar a cápsula num incubador a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 30 min. </li><li> Agite suavemente o prato de cultura algumas vezes e colocar omeio de cultura (células de suspensão) em 15 mL tubos cónicos de plástico. Descartar as células aderentes (principalmente macrófagos) nas placas de cultura. </li><li> Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento com 1 ml de meio RPMI 1640. Contar o número de células com um hemocitómetro ou um contador de células automatizado. NOTA: A viabilidade de leucócitos isolados é normalmente superior a 90% por exclusão com azul de tripano. </li><li> Centrifugar como no passo 1.7 e ressuspender as células em ~ 200 uL de tampão de PBS frio (0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA) a uma concentração de 5-10 x 10 6 células / ml. </li><li> Adicionar 5 mL de cocktail de anticorpo anti-humano biotinilado específico para as células do sangue (para a selecção negativa das células B) por 10 6 células e incubar em gelo durante 30 min 21. NOTA: O cocktail Ab anti-humana deve incluir, pelo menos Abs específico para CD2 (ou CD3), CD14 e CD16. </li><li> Adicionar um excesso de volume de 10 vezesde PBS estéril para as células, centrifugar a 600 xg durante 5 min, e desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar quantidades iguais de microesferas de estreptavidina conjugada (5 mL por 10 6 células) para o pellet e misture bem. </li><li> Incubar em gelo durante 30 min num tubo cónico de 15 mL, em plástico. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão PBS para dentro do tubo. </li><li> Colocar o tubo em um suporte magnético e incubar à temperatura ambiente durante 8 min. As micropérolas Brown vai anexar gradualmente para a parede do tubo ao lado do íman 22. </li><li> Com o tubo restante no suporte magnético, transferir cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo estéril de 15-mL 22. </li><li> Repita os passos de 1,14-1,16, e combinar os dois sobrenadantes que contêm as células B intactas. Descartar as microesferas. </li><li> Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em meio RPMI 1640 para experiências a jusante. NOTA: Normalmente, 1 - 5 x 10 5 células B witha pureza superior a 95% a partir de 10 ml de sangue periférico pode ser isolado 23. </li></ol> 2. purificação e separação de Memória e Naïve B As células a partir de células B isoladas <ol><li> Use células purificadas a partir do passo 1 e determinar o número de células utilizando um hemocitómetro ou um contador de células automático. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul de tampão PBS frio depois da centrifugação a 600 xg e TA durante 5 min. </li><li> Adicionar 1 - 2 ug de mAb CD27 biotinilado por 10 6 células e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Adicionar 10 ml de tampão PBS ao tubo e centrifugar a 600 xg durante 5 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 50 ul de tampão PBS. </li><li> Adicionar a mesma quantidade de microesferas magnéticas de estreptavidina (1 - / 10 6 células 2 ug) às células num tubo cónico de plástico de 15 ml. </li><li> Com cuidado, misturar bem e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Adicionar 2 - 3 ml de tampão PBS ao tubo. </li><li> Coloque otubo num suporte magnético e incubar à temperatura ambiente durante 8 min para permitir que as microesferas castanhos para anexar ao lado mais próximo do íman. </li><li> Com o tubo no suporte magnético, transferir cuidadosamente a fracção de sobrenadante para um novo tubo de ensaio estéril. Esta fracção contém a CD27 enriquecido - células B virgens. </li><li> Adicionam-se 5 ml para o tubo contendo as micro-esferas e suavemente ressuspender as microesferas (isto é, a fracção enriquecida de células CD27 + de memória B) 24-25. </li><li> Centrifugar a 600 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Ressuspender as peletes com meio RPMI 1640 para os experimentos a jusante. NOTA: Tipicamente, ~ 30 - 60% de células B podem ser purificadas como células de memória CD27 + a partir das PBMC de um dador saudável 7, 25-26. </li></ol> 3. células de classificação para a coleta de células Naïve B, células B de memória, e PBS / PCs <ol><li> Usando as células purificadas a partir do passo 1, determinar o número de células utilizando um hemocytometer ou um contador de células automático. </li><li> Ressuspender as células em tampão de PBS frio a uma concentração de 10 7 por ml num tubo de polistireno de 5 ml. </li><li> Adicionar 1 - 2 ug de IgG humana por 10 6 células e incubar em gelo durante 10 min para o bloco de Fc. </li><li> Adicionar 1 ug de cada anti-CD19-APC (clone: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (clone: O323), e anti-CD38-PE (clone: HIT2) por 10 6 células; misturar bem e incubar em gelo durante 30 min 4, 27. </li><li> Na última 5 min na etapa 3.4, adicionar 5 mL do 7-D aminoactinomycin comercial (7-AAD). </li><li> Adicionar 2 ml de PBS ao tubo, vórtice, e centrifugar a 600 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em tampão de triagem (PBS estéril com 2% de BSA e EDTA a 2 mM) a uma concentração de 1 - 5 x 10 7 células por ml num tubo de 15 mL. </li><li> Filtrar as células através de um filtro de células de malha de nylon (40 um de tamanho de poro) para eliminar aglomerados de células. </li><li> Separaram-se as células com uma citometria de fluxo tipoer equipado com três lasers: violeta (405 nm), azul (488 nm) e vermelha (640 nm). NOTA: O laser azul por si só é suficiente para 3 cores citometria de fluxo 27-28. </li><li> Ordenar as células em três tubos de 15 ml (contendo 5 mL de meio RPMI) para a recolha simultânea de células B virgens (CD19 + CD27 -), células B de memória (CD19 + CD27 +), e PBS / PCS (CD19 + CD27 + / oi CD38 +) 3-4, 28. NOTA: Ordenar as células B naive e de memória podem ser cultivadas tal como descrito no passo 4. </li></ol> 4. Na diferenciação in vitro de células isoladas CD19 Humano + B, CD19 + CD27 + células B de memória, e CD19 + CD27 - células naive B <ol><li> Usando as células purificadas nos passos 1.19, 2.10, 2.11 e 3.10, determinar o número de células com um hemocitómetro ou um contador de células automático. </li><li> Ressuspender as células com meio RPMI 1640a uma concentração de 1 - 10 x 10 5 por ml e aliquotar-los para os poços de uma placa de 12 poços. </li><li> Adicionar CpG (ODN 2006) a 5 ug / 10 6 células / ml 18, 29. </li><li> Cultura das células em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 5 dias. </li><li> Colher as células de cada poço, colocá-los separadamente em tubos de 15 ml, adicionar 5 mL de PBS a cada tubo e centrifugar-los a 600 xg e RT durante 5 min. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro ou um contador de células automático. Ressuspender as células a uma concentração de 1 - 10 x 10 5 por ml com meio RPMI 1640. </li></ol> 5. ELISpot Assay <ol><li> Adicionar 30 uL de 35% de etanol em água destilada a cada poço das placas ELISpot durante 30 s. NOTA: Quando pipetagem, evitando tocar na membrana nas cavidades em todos os momentos. </li><li> Inverter as placas ELISpot para remover o etanol. </li><li> Colocar 150 mL de DDH autoclavados 2 O em cada poço e incubar-los à temperatura ambiente durante 5 minutos para lavar o etanol residual; seguir com uma lavagem de PBS estéril à temperatura ambiente durante 3 min. NOTA: As etapas 5.1 a 5.3 pode ser opcional, dependendo do fabrico das placas. </li><li> Coloque 50 uL de 5 ug / mL de anticorpo policlonal de F (ab &#39;) 2 de anti-Ig humana (IgG + IgM + IgA) (em PBS) a cada poço das placas ELISpot e incubar a 4 ° C durante a noite (preferida) ou 37 ° C durante 2 h 11. NOTA: Selar as bordas de placas com parafilme até à sua utilização. </li><li> Inverter as placas para remover Abs não ligado, adicionar 200 ul de PBS a cada poço e incubar duas vezes à temperatura ambiente durante 3 min de cada vez. </li><li> Adicionar 200? L de PBS com BSA a 5% (ou meio RPMI 1640) a cada poço para bloquear, e incubar à TA durante 2 h. </li><li> Inverter as placas para remover o tampão de bloqueio. Lavar cada poço duas vezes com 200 ul de PBS, tal como no passo 5.5. </li><li> Adicionar 100 uL de meio RPMI 1640 a cada poço e incubar a 37 ° C. </li><li> Quando estiver pronto para semear as células, inverter as placas para remover o meio RPMI 1640. </li><li> Semente de 100 uL (5 x 10 4), 50 mL (2,5 x 10 4), e 25 uL (1,25 x 10 4) das células (de passos 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, e 4.6) para os poços de uma placa ELISpot. Com meio RPMI 1640, perfazer o volume de 150 uL / ​​poço. NOTA: Um mínimo de uma ou duas diluições em série de 2 vezes para plaqueamento das células é recomendada. </li><li> Incubar as placas em uma incubadora a 37 ° C com CO2 a 5% durante 8-14 h 18. Evitar mover as placas durante a incubação. </li><li> Inverter as placas para remover as células e meio RPMI 1640. </li><li> Adicionar 200? L / cavidade de PBS-T (PBS com Tween 20 a 0,05%) e incuba-se-lhes 5 vezes à TA, cada vez durante 3 minutos. Inverta a placa para remover o tampão de lavagem entre cada um dos 5 lavagens. </li><li> Adicionar quer fosfatase alcalina de IgG de cabra-anti-humano (AP), Abs Fcy-específico (para a detecção de IgG, 1: 5000 em PBS-T) Ou de cabra anti-IgM humana-AP, Fcμ Abs específicos do fragmento (para a detecção de IgM, 1: 5000 em PBS-T) nas cavidades designadas e incubar à TA durante 2 h, no escuro. </li><li> Lavar cada poço duas vezes com 200 ul de PBS, tal como no passo 5.5. </li><li> Adicionar 50 / poço de solução de substrato de fosfato uL bromochloroindolyl-nitro azul de tetrazólio (BCIP / NBT). manchas de cor roxa normalmente aparecem em 5-15 min. </li><li> Adicionar 100 uL / poço de ddH2O para evitar o sobre-revelação de manchas. </li><li> Lavar as placas com água corrente da torneira após o desenvolvimento completo de todos os pontos. </li><li> Remover o underdrain das placas e permitir-lhes secar ao ar, no escuro. </li><li> Contar as manchas utilizando um leitor automático de placas com um aparelho de imagem aquisição / análise (por exemplo, um scanner automático ou manualmente por meio de um microscópio de dissecção). NOTA: As placas podem ser armazenadas à temperatura ambiente no escuro e analisadas mais tarde. </li></ol>

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O autor declara não haver interesses financeiros concorrentes.

Isolamento e Purificação de Células de Sangue Periférico Humano B Normalmente, os glóbulos vermelhos podem ser eficientemente rompido e afastada pelo tampão de lise (passo 1.2). É importante que não se incubar PBMCs com o tampão de lise dos glóbulos vermelhos mais do que 5 minutos, como a viabilidade das células pode ser afectada pelo cloreto de amónio. Alternativamente, os glóbulos vermelhos e as plaquetas podem ser removidos simultaneamente por o protocolo seguinte. <p class="jove_content...

As células B desempenham um papel central no desenvolvimento da imunidade humoral. Eles inicialmente se desenvolvem na medula óssea e entram na corrente sanguínea como células naive B, que podem migrar para os tecidos linfóides, tais como o baço, nódulos linfáticos, amígdalas, e para um maior desenvolvimento. Após a Ag encontro, algumas células B naïve migrar para folículos linfóides, onde as células de centro germinal B podem se diferenciar em células B de memória e plasmablasts (PBS) / células plasmáticas (PCs). Enquanto a maioria dos computadores PBS / egressos para a corrente sanguínea, alguns, eventualmente, residem na medula óssea a sofrer diferenciação terminal em PCs 1 de vida longa. As células B em circulação são heterogêneos, e no estado estacionário, PBS / PCs são raros no sangue periférico 2. Como resultado da disponibilidade de marcadores de superfície específicos da linhagem, citometria de fluxo tornou-se um método popular para a identificação e caracterização das subpopulações de células B no sangue periférico. Uma aplicação alargada dos cytometr fluxoy é a adição de uma função de separação de células, que permite a separação e isolamento de subconjuntos individuais de células B com elevada pureza. Com base na expressão de receptores de superfície específicos em diferentes fases de desenvolvimento, as células B circulantes humanos são geralmente classificados em três subpopulações principais: células B virgens (CD19 + CD27 - CD38 -), células B de memória (CD19 + CD27 + CD38 -), e PBS / PCS (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figura 1). células B virgens, por natureza, não encontrei Ags. No entanto, eles podem ser diferenciadas em células CD27 + IgM + B de memória. Embora as células B virgens são homogêneos em expressar receptor do antigénio das células B (BCR) moléculas -associated (por exemplo, CD19, CD20 e CD22) eles são heterogêneos em seu repertório imunoglobulina 5. A maioria das células CD27 + B de memória podem ser diferenciados em CD27+ / CD38 + oi PBS / PCs 6. Além disso, as células B de memória e PBS / PCs são policlonais e exibem desenvolvimento e funcionais heterogeneidade 4-7. PBS / PCs em circulação são normalmente de curta duração e não expressam CD138, mas aqueles feitos para se estabelecer na medula óssea irá terminal diferenciar e se tornar longa duração. Terminalmente PCs diferenciadas expressam CD138 e para baixo-regular moléculas CD27 em suas superfícies 8. Uma vez que tanto PBS e PCs são capazes de secretar Abs, em muitas ocasiões, eles são colectivamente denotado como ASC. Em contraste, nem as células B naive nem células B de memória pode produzir quantidades apreciáveis de Abs 9-10. No entanto, quando isolados, tanto em células B naive e de memória podem ser diferenciadas em ASC em 3 - 10 dias, quando colocado em condições de cultura adequadas 6, 11-15. Na verdade, ASC derivado in vitro compartilhar diferenciação expressões superficiais semelhantes de CD27 e CD38 com os fr diretamente isoladosangue periférico om 6. Além disso, as ASC diferenciadas in vitro expressam um baixo nível de superfície CD20, semelhante que circula de PBS / PCs 6. Embora as ASC derivado de cultura são todos de curta duração, podem secretar Abs, indicando que eles são funcionalmente competentes e capazes de contribuir para a imunidade humoral. Ambos ELISA e ELISpot são, de longe, os métodos mais geralmente aplicado com o qual para obter informação funcional sobre a resposta imunológica humoral. ELISA é um ensaio baseado em placa de 96 poços, e é frequentemente utilizado para medir os títulos de soro Abs Ag-specific e outros analitos (por exemplo, citocinas). É conveniente e escalável. ELISA foi concebido para utilizar um ensaio de enzima de fase sólida para detectar a presença de ABS ou de outras substâncias, tais como soro, numa amostra de líquido 16. As leituras de ELISA no soro têm sido amplamente utilizados para representar a resposta imune do corpo. Uma ferramenta necessária para a aquisição de readouts de ensaios de ELISA é um leitor de microplacas espectrofotométrico. O leitor pode determinar a densidade óptica (DO) dos produtos finais normalmente resultantes da reacção de peroxidase de rábano (HRP) Abs detecção -conjugated e seus substratos específicos 17. No que diz respeito a informações sobre a resposta imunológica humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA representam a colectiva, mas não indivíduo, o desempenho de ASC no corpo. Em adição, a ELISA não tem em conta a participação de células B de memória, que não secretam Abs. Tal como ELISA, ELISpot é um método amplamente utilizado para a detecção e monitorização da resposta imunitária em amostras de sangue periférico 17-18. ELISpot é uma técnica relacionada com um ELISA de tipo sanduíche. Nele, as células são colocadas dentro do difluoreto de polivinilideno (PVDF) poços apoiados por uma membrana de microplacas de 96 poços para uma cultura de curto prazo. O ensaio ELISpot é análoga à execução de uma transferência de Western em microplacas e developing as manchas na membrana de PVDF em cada poço. Um sistema de leitor de ELISpot automatizado ou um estereomicroscópio para contagem manual é necessária. A principal vantagem de ELISpot na detecção de uma resposta imunitária é a sua excelente sensibilidade na quantificação da ASC e células secretoras de citocinas. Ela reporta as suas actividades funcionais na imunidade humoral e celular, respectivamente. Na medição da função imune humoral, os níveis de soro AB determinado por ELISA e o número de ASC enumerados por ELISPOT são frequentemente correlacionados, mas as leituras de dados a partir destes dois ensaios têm algumas diferenças em implicações funcionais 19-20. A principal vantagem de ELISpot é a sua sensibilidade do método. O nível dos títulos de soro AB como relatado por ELISA apresenta-se semi-quantitativamente, como leituras de DO, que denota o nível de Ab relativa, ou mais quantitativamente, como leituras de concentração quando uma quantidade conhecida dos isotipos apropriados de Abs é incluída para referência. Em contraste, os resultados de ELISpot são Presented como o número absoluto de ASC em uma associação de células de interesse (por exemplo, células não fraccionadas mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células B purificadas a partir de PBMCs). ELISpot pode detectar um único ASC, mas ELISA requer quantidades ab a partir da ASC para atingir concentrações dependente de ensaio optimizadas antes da medição. Assim, é obviamente superior ELISpot para ELISA na sensibilidade da quantificação. Além disso, também ELISpot é adequada para a quantificação dos ASC diferenciadas in vitro a partir de células B de memória activadas. células B de memória não secretam Abs, mas podem se diferenciar em ASC sobre a ativação; Eles, portanto, não tem nenhuma contribuição para Abs de soro detectados por ELISA. Assim, ELISpot é o método de escolha para a medição da resposta imune de células de memória B em circulação após a activação em cultura. Ele permite o acompanhamento da manutenção da imunidade humoral a longo prazo.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer K2E</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td>tubo de 10 mL</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>solução livre de endotoxinas</td></tr><tr><td>Trypan blue 0,5%</td><td>Biological Industries</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de enriquecimento de linfócitos B humanos IMag</td><td>BD Biosciences</td><td>558007</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilated CD27 mAb</td><td>Biolegend</td><td>302804</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Microesferas magnéticas de estreptavidina</td><td>BD Biosciences 9000810</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td> BD <td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de malha de nylon azul, 40 &mu; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD19-APC</td><td>Biolegend</td><td>302212</td><td>clone HIB19</td></tr><tr><td>Anti-humano CD27-eFluor 450 eBioscience</td><td></td><td>48-0279-42</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>Anti-humano CD38-PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>303516</td><td>clone HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-humano CD38-PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>560677</td><td>clone HIT2&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-humano CD45-FITC</td><td>Biolegend</td><td>304006</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-humano CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td>clone HI30</td></tr><tr><td>Anti-camundongo/rato/humano CD27-PerCP Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>124213</td><td>clone LG.3A10</td></tr><tr><td>Anti-humano CD27-PerCP Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>65429</td><td>clone L128</td></tr><tr><td>Anti-humano CD19-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-064</td><td>clone LT19</td></tr><tr><td>Anti-humano CD19-FITC</td><td>GeneTex</td><td>clone GTX75599</td><td>LT19</td></tr><tr><td>Anti-humano CD20-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555622</td><td>clone 2H7</td></tr><tr><td>biotinilado anti-humano CD27</td><td>Biolegend</td><td>clone 302804</td><td>O323</td></tr><tr><td>biotinilado anti-humano CD27</td><td>eBioscience</td><td>13-0279-80</td><td>clone O323</td></tr><tr><td>7-aminoactinomicina D (7-AAD)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>CpG (ODN 2006)&nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-2006</td><td>tipo B CpG</td></tr><tr><td>IL-2 humana recombinante</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>IL-10 humana recombinante</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>IL-21 humana recombinante</td><td>PeproTech</td><td>200-21</td><td></td></tr> Proteína A humana <tr><td>recombinante de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. aureus Cowan (SAC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82526</td><td></td></tr><tr><td>Pokeweed mitogen (PWM)</td><td>Placas de filtro Sigma-Aldrich</td><td>L9379</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen, 0.45 &micro; tamanho dos poros m</td><td>Merck Millipore</td><td>MSIPS4510</td><td>placa filtrante transparente de 96 poços com membrana PVDF hidrofóbica</td></tr><tr><td>Solução BCIP/NBT</td><td>Reagente único Sigma-Aldrich</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT, substrato de fosfatase alcalina</td><td>Merck Millipore</td><td>ES006</td><td></td></tr><tr><td>IgG humana</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-003</td><td></td></tr><tr><td>IgG humana, fragmento Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 fragmento de Ig anti-humano de cabra (IgG + IgM + IgA)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-006-127</td><td></td></tr><tr><td>IgG-fosfatase alcalina anti-humana de cabra, Fc&gamma; específico do fragmento</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina IgM-humana de cabra, Fc&micro; específico do fragmento</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-055-043</td><td></td></tr><tr><td>IgG-peroxidase anti-humana de cabra, Fc&gamma; específico do fragmento</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-008</td><td></td></tr><tr><td>IgM-peroxidase anti-humana de cabra, Fc&micro; específico do fragmento</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-035-095</td><td></td></tr><tr><td>Kit de substrato BD ELISPOT AEC BD</td><td>Biosciences</td><td>551951</td><td></td></tr><tr><td>C.T.L. Analisador ImmunoSpot</td><td>C.T.L.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células b de sangue: elispot como uma leitura funcional de imunidade humoral

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

A marca da imunidade humoral é gerar ASC funcionais, que sintetizam e segregam Abs específica para um antigénio (Ag), tal como um agente patogénico, e são usados ​​para a defesa do hospedeiro. Para a determinação quantitativa do estado funcional da resposta imune humoral de um indivíduo, tanto Abs circulantes no soro e ASC são geralmente medidos como leituras funcionais. Nos seres humanos, o sangue periférico é a amostra mais conveniente e facilmente acessível e que pode ser utilizado para a determinação da resposta imune humoral induzida por células hospedeiras B. subconjuntos distintos de células B, incluindo ASC, podem ser isolados directamente a partir de sangue periférico por meio de selecção com micropérolas Ab-conjugados específicos de linhagem ou através de separação de células com citometria de fluxo. Além disso, as células B naive e de memória purificados podem ser activadas e diferenciadas em cultura em ASC. As actividades funcionais de ASC para contribuir para a secreção de Ab pode ser quantificada por ELISpot, que é um ensaio de enzima que convergeensaio -Conectado imunoabsorvência (ELISA) e tecnologias de transferência Western para permitir a enumeração de ASC individuais no nível de uma única célula. Na prática, o ensaio ELISpot tem sido cada vez mais utilizadas para avaliar a eficácia da vacina por causa da facilidade de manuseamento de um grande número de amostras de sangue. Os métodos de isolamento de células B humanas a partir de sangue periférico, a diferenciação de células B em ASC in vitro, e o emprego de ELISpot para a quantificação de um total de IgM e IgG-ASC serão descritos aqui.

PBMCs foram depletados de glóbulos vermelhos e células aderentes (passos 1.2 a 1.7). Uma alíquota (2 X 10 6) de células foram submetidos a uma análise por citometria de fluxo para ilustrar as populações de células B naive, as células B de memória, e PBS / PCs no sangue periférico (Figura 1). Em PBMCs de dadores este, cerca de 10% dos linfócitos foram células B CD19 +. No compartimento de células B, a percentagem de CD19 + CD27 -</sup...

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

O objetivo geral desta metodologia ELISpot é permitir a quantificação de células B secretoras de anticorpos humanos a partir do sangue. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área biomédica sobre a imunologia das células B e na pesquisa de vacinas. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a detecção e a medição de células B secretoras de anticorpos em nível individual de célula.Quem demonstrará o procedimento será Tsung-Chih Tseng, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Imediatamente após obter uma amostra de sangue de 10 ml da veia basílica em um tubo de 15 ml contendo EDTA suplementado com potássio, inverta o tubo várias vezes para prevenir a formação de coágulos. Em seguida, adicione 35 ml de tampão de lise de hemácias autoclavado às células para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente.Quando a luz puder ser observada através do tubo, centrifugue o sangue e confirme a presença de um pellet branco. Remova o tampão de lise residual com 10 ml de PBS autoclavado e re-suspenda o pellet em 10 ml de meio RPMI 1640. Plaque as células em uma placa de cultura de 10 cm para uma incubação de 30 minutos a 37 graus celsius e cinco por cento de dióxido de carbono.Em seguida, gire suavemente a placa de cultura algumas vezes e transfira as células em suspensão para um tubo cônico plástico de 15 ml. Após duas lavagens por centrifugação, re-suspenda o pellet em concentração de cinco a 10 vezes o décimo da sexta células por ml em 200 microlitros de tampão PBS frio e adicione 5 microlitros de coquetel de anticorpos anti-humano biotinilados específico para células sanguíneas por uma vez o décimo da sexta células. Após uma incubação de 30 minutos no gelo, lave as células em volume excessivo de 10 vezes em PBS estéril e re-suspenda o pellet em cinco microlitros de microesferas conjugadas com estreptavidina por uma vez o décimo da sexta células, para uma incubação de 30 minutos no gelo.No final da incubação, adicione dois ml de tampão PBS às células e coloque o tubo em um suporte magnético durante oito minutos à temperatura ambiente. Quando as microesferas tiverem se ligado à parede do tubo, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo cônico e adicione mais 2 ml de tampão PBS às células. Após a coleta do segundo sobrenadante, recolha as células agrupadas por centrifugação e transfira as células para um tubo de poliestireno de cinco ml com tampão PBS fresco, na concentração de um vezes décimo de sete células por ml.Após realizar o bloqueio não específico, adicione um micrograma de cada anticorpo de seleção por um décimo das seis células ao tubo, misturando suavemente, e incube por 30 minutos no gelo. Durante os últimos cinco minutos da incubação, adicione cinco microlitros de 7-AAD às células. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS fresco às células e vortexe antes de centrifugar.Re-suspenda o pellet em tampão de triagem fresco na concentração de um a cinco vezes dez elevado a sete células por mililitro e filtre as células através de um filtro celular de 40 mícrons para um novo tubo de poliestireno de cinco mililitros. Em seguida, separe as células por citometria de fluxo em três tubos de 15 ml contendo 5 ml de meio RPI fresco para coletar as células B ingênuas, células B de memória e plasmablastos/células plasmáticas. Quando todas as células tiverem sido colhidas, plaque os subconjuntos em poços individuais de uma placa de cultivo celular de 12 poços na concentração de um a dez vezes dez elevado a cinco células por mililitro em meio RPMI fresco.A seguir, ative os linfócitos B com cinco microgramas de CPG ODN 2006 por um vezes dez elevado à sexta células por mililitro por poço no incubador de cultura celular durante cinco dias. Ao final da ativação, adicione 30 microlitros de etanol a 35% e água destilada a cada poço das placas de ELISpot durante 30 segundos. Em seguida, substitua o etanol de cada poço por 150 microlitros de água destilada autoclavada e incube as placas à temperatura ambiente por cinco minutos para remover o etanol residual.Realize uma lavagem com PBS seguida pela adição de 50 microlitros do fragmento FAB2 policlonal anti-IgG humano em cada poço. Lave as placas duas vezes com PBS conforme acabou de ser demonstrado. Bloqueie a ligação não específica em cada poço com 200 microlitros de PBS fresco contendo BSA por duas horas à temperatura ambiente.Após outra série de lavagens com PBS, incubar os poços em 100 microlitros de meio RPMI 1640 fresco a 37 graus Celsius. Em seguida, substituir o meio em cada poço de ELISpot pelo número apropriado de linfócitos B ativados. Ajustar o volume final de cada poço para 150 microlitros com meio RPMI fresco e retornar a placa de ELISpot ao incubador de cultura celular por oito a 14 horas.Após o período de incubação, descarte o meio e lave as cavidades com 200 microlitros de PBS contendo Tween 20, realizando cinco lavagens de três minutos cada. Após a última lavagem, adicione os anticorpos de detecção apropriados às respectivas cavidades e incube as placas por duas horas no escuro. Após nova série de lavagens com PBS, adicione 50 microlitros de substrato BCIP/NBT a cada cavidade, mantendo por cinco a 15 minutos à temperatura ambiente.Quando surgirem manchas roxas, interrompa a reação com 100 microlitros de água duplamente destilada por poço e enxágue a placa com água corrente da torneira. Em seguida, seque a membrana do ELISpot ao ar, protegida da luz. Nesta amostra de PBMC do doador, após a lise de hemácias e esgotamento de células aderentes, cerca de 10 por cento dos linfócitos eram células B positivas para CD19.No compartimento de células B, cerca de 50 por cento das células eram células B ingênuas CD27 negativas e 50 por cento eram células B de memória que expressavam CD27. O tratamento com CPG de células B humanas purificadas e CD19+CD27+ por cinco dias, conforme acabou de ser demonstrado, geralmente resulta na geração de 50 a 200 células secretoras de anticorpos IgM e de 10 a 50 células secretoras de IgG a partir de um vezes dez à quarta células B ativadas. Uma vez dominada, essa técnica de ELISpot pode ser concluída em três horas, se realizada corretamente.Antes de iniciar este procedimento, é importante lembrar-se de codificar o local com reagentes de captura apropriados para detectar as células secretoras de anticorpos. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de vacinologia explorassem a eficácia de vacinas em ensaios em larga escala e acompanhamentos longitudinais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar células B humanas a partir do sangue.Sequencie células B naïve e de memória para sua diferenciação e realize um ensaio de ELISpot para quantificar células secretoras de anticorpos. Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano pode ser perigoso e que precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Identificação de alvos microbiana da imunidade adaptativa em doenças idiopática pode ser realizado através da utilização do ensaio immunospot enzyme-linked.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células B do sangue periférico humano usando anticorpos biotinilados específicos para células não B e microesferas magnéticas conjugadas com estreptavidina.

Isolamento e purificação de células B do sangue periférico humano

Neste vídeo, descrevemos um protocolo para a classificação baseada em citometria de fluxo de subpopulações de células B virgens, células B de memória e plasmablastos de plasmablastos de células B do sangue periférico humano. As diferentes subpopulações de células B podem ser distinguidas com base na ligação de anticorpos baseados em fluoróforo aos receptores CD19, CD27 e CD38 expressos nas superfícies das células B, seguida de classificação celular.

Classificação de células baseada em citometria de fluxo para diferentes populações de células B circulatórias

Este vídeo demonstra o uso do ensaio ELISpot para avaliar a função das células B secretoras de anticorpos, ASCs. Os anticorpos secretados pelas ASCs interagem com os fragmentos de anticorpos policlonais ligados à membrana, que são detectados pelos anticorpos IgG ou IgM conjugados com enzimas. A mancha colorida produzida em cada poço indica a presença do isotipo do anticorpo específico, que se correlaciona com a atividade secretora das células B.

Avaliação funcional de células B secretoras de anticorpos usando o ensaio ELISpot

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

Método de triagem de célula única para a seleção e recuperação de anticorpos com especificidades desejadas de populações de células B de memória humana enriquecida

Os imunoensaios baseados no sangue total fornecem uma ferramenta fácil e eficiente em termos de recursos para analisar a imunidade específica do antígeno para fins de diagnóstico e pesquisa. Este artigo fornece um protocolo otimizado baseado em sangue total com co-estimulação dupla para análise abrangente da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais, incluindo uma versão de baixo volume para pacientes pediátricos e pequenos animais.

Ensaio de sangue total com coestimulação dupla para análise específica do antígeno da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais

Aprenda a isolar, diferenciar e quantificar células B secretoras de anticorpos humanos do sangue usando o ensaio ELISpot. Este método permite detectar células produtoras de IgM e IgG em nível de célula única.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral (Vídeo) | JoVE Journal

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

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