Exibição Inner-membrana bacteriana para o rastreio de uma biblioteca de anticorpo Fragments

O objetivo geral deste procedimento é aproveitar o controle de qualidade de dobramento da via de translocação de arginina dupla para projetar a ligação de fragmentos de anticorpos e dobramento intracelular em uma única etapa que terá aplicações na engenharia de anticorpos para funcionar intracelularmente. Este método pode ajudar a superar os principais desafios no campo da engenharia de anticorpos, como superar a dificuldade de projetar anticorpos para dobrar e funcionar adequadamente no ambiente citoplasmático redutor. Apenas os anticorpos que se dobram bem no citoplasma são exibidos e testados para ligação.

Proporcionando uma vantagem sobre a exibição de leveduras e fagos, que dependem de vias secretoras para exibição. As implicações dessa técnica se estendem à nossa terapia de doenças neurodegenerativas, câncer e infecções virais, porque essas doenças envolvem patogênese intracelular que pode ser alvo de anticorpos. A demonstração do Visal desse método é fundamental porque entender como gerar e trabalhar com esferoplastos é um desafio.

Depois de fundir a biblioteca scFv à sequência de sinal ssTorA e aumentá-la a 37 graus Celsius com agitação por três horas, permita a expressão da biblioteca scFv a 20 graus Celsius e 225 rpm durante a noite por 15 a 22 horas. Após a incubação, use um espectrofotômetro para medir a densidade óptica em 600 nanômetros. Em seguida, centrifugue o volume calculado de cultura induzida em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro a 12.000 vezes g e temperatura ambiente por cinco minutos.

Remova o sobrenadante e use 100 microlitros de tampão de fracionamento gelado ou fB para ressuspender os pellets. Em seguida, centrifugue as amostras a 12 000 vezes g e à temperatura ambiente durante um minuto. Depois de remover o sobrenadante, use 350 microlitros de fB gelado suplementado com 3,5 microlitros de 10 miligramas por mililitro de lisozima para ressuspender os pellets.

Em seguida, enquanto vórtice lentamente os tubos, adicione 700 microlitros gota a gota de EDTA 1 milimolar e, em seguida, incube os tubos em um rotador de tubo em temperatura ambiente por 20 minutos para misturar as amostras. Remova os tubos do rotador. Adicione 50 microlitros de MgCl2 de cinco molares gelados a cada tubo e incube-os no gelo por 10 minutos.

Em seguida, centrifugue as amostras a 11.000 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Agora, com uma micropipeta e uma ponta de um mililitro, puxe lentamente uma parte do pellet. Em seguida, enquanto segura o tubo, em um ângulo com a abertura diretamente acima de um novo tubo de 1,5 mililitro, levante lentamente a ponta da pipeta para fora do sobrenadante e deslize o pellet para dentro do novo tubo.

Depois de remover o excesso de sobrenadante, use um mililitro de PBS gelado para ressuspender os esferoplastos. Os esferoplastos devem ser completamente ressuspensos antes da panorâmica porque os scFvs não vinculativos presentes nos agregados levarão a falsos positivos da panorâmica. Depois de biotinilar o antígeno alvo de acordo com o protocolo de texto, ressuspenda as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina em seu frasco original.

Em seguida, transfira sete a 10 vezes 10 para as 9ª contas para um tubo de 1,5 mililitro. Coloque o tubo de contas no suporte magnético por dois minutos para coletar as contas na lateral do tubo e pipete para remover cuidadosamente o sobrenadante. Remova o tubo do ímã e use PBS para ressuspender as contas sem gerar bolhas.

Em seguida, retorne o tubo ao ímã e remova o tampão antes de lavar as contas mais duas vezes com PBS. Adicione um mililitro de lisado contendo o antígeno biotinilado às esferas e incube em temperatura ambiente por 30 minutos, girando suavemente. Após a incubação, use PBS com 1% BSA para lavar as contas cinco vezes.

Em seguida, use PBS com 1% BSA para ressuspender as contas. Para filtrar a biblioteca scFv, comece adicionando quatro vezes 10 aos 9º esferoplastos e oito vezes 10 às 8ª contas a um tubo estéril de 15 mililitros. Adicione um x PBS com 1% BSA para trazer o volume total para quatro mililitros.

Em seguida, alíquota da solução em quatro tubos de 1,5 mililitro de um mililitro cada e incube as reações a quatro graus Celsius girando suavemente por cinco horas. Para preparar os esferoplastos ligados ao grânulo para PCR, coloque os tubos de reação panorâmica no ímã por três minutos. Remova o sobrenadante e lave as esferas com um x PBS com 1% BSA quatro vezes como antes.

Em seguida, use 25 microlitros de ddH20 por tubo para ressuspender as contas. Conforme descrito no protocolo de texto, execute a PCR de plasmídeo completo para amplificar os genes para scFvs ligados a esferas e, em seguida, recircularizar o plasmídeo do produto de PCR. Transforme toda a reação em células equalizadas MC4100 de acordo com o protocolo de texto.

Para identificar clones usando ELISA, descongele um tubo da subbiblioteca e placa em placas de ágar LB. Adicione 200 microlitros de LB com 20 microgramas por mililitro de cloranfenicol em cada poço de uma placa de cultura de fundo redondo de 96 poços. Com uma ponta de pipeta, escolha uma colônia individual da placa de ágar.

Em seguida, coloque a ponta no primeiro poço da placa de 96 poços e mexa delicadamente para inocular. Continue a inocular uma colônia em cada poço. Incubar a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas em um agitador de microplacas.

Depois de preparar uma solução de revestimento de antígeno alvo de acordo com o protocolo de texto, adicione 50 microlitros da solução a cada poço de uma placa ELISA de poliestireno transparente de alta ligação de 96 poços. Incube as placas a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, replique as colônias das 96 placas de cultura de poços em placas de ágar de acordo com o protocolo de texto.

Em seguida, esvazie a solução de revestimento das placas ELISA e adicione 100 microlitros de solução de bloqueio preparada de acordo com o protocolo de texto para cada poço. Incube em temperatura ambiente por pelo menos duas horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Adicione 20 microlitros de um detergente concentrado de lise celular a cada poço da placa de cultura de fundo redondo e incube a placa de cultura em um agitador de microplacas em temperatura ambiente por 15 a 20 minutos.

Esvazie a solução de bloqueio das placas ELISA e lave os poços quatro vezes com 200 microlitros de tampão de lavagem preparado de acordo com o protocolo de texto. Após remover a lavagem final, transfira 50 microlitros de cada poço da placa de lise celular para o poço correspondente da placa ELISA. Incube as placas em temperatura ambiente por uma a duas horas.

Proceda ao esvaziamento das amostras da placa ELISA e lave os alvéolos quatro vezes. Em seguida, prepare a solução de anticorpos para detectar scFvs de acordo com o protocolo de texto. Adicione 50 microlitros do anticorpo a cada poço e incube por uma a duas horas em temperatura ambiente.

Lave as placas ELISA quatro vezes com tampão de lavagem antes de adicionar 200 microlitros por poço de substrato HRP preparado de acordo com o protocolo do fabricante. Incube as placas no escuro em temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Para extinguir a reação, adicione 50 microlitros de H2SO4 de três molares a cada poço e pipete suavemente para misturar a solução.

Finalmente, meça a absorbância usando uma leitura de placa a 492 nanômetros. Neste experimento, os anticorpos scFv scFv13 e scFv13. R4 foram fundidos à sequência nativa de ssTorA ou a um ssTorA modificado que não é reconhecido pela via de translocação de arginina gêmea, também chamada de via Tat.

R4 se dobra bem e é expresso na membrana interna quando infundido em ssTorA nativo. O ScFv13 não se dobra bem e não é exibido na membrana interna, independentemente do peptídeo sinal Tat ao qual está fundido. Esses resultados demonstram que apenas as proteínas que contêm o peptídeo sinal Tat e estão corretamente dobradas no citoplasma são exibidas na membrana interna, permitindo que a via Tat funcione como uma tela para o dobramento intracelular.

Neste experimento, uma biblioteca de PCR propensa a erros baseada em scFv13, que tem um baixo nível de afinidade de ligação para beta-galactosidase, foi comparada com beta-gal. ScFv 1-4 foi isolado e exibiu uma maior afinidade de ligação ao beta-gal do que scFv13, bem como um maior nível de solubilidade citoplasmática. Usando scFv 1-4 como concorrente contra a biblioteca scFv 1-4 de segunda geração, scFv 2-1 e 2-3 foram isolados e demonstraram afinidades de ligação ainda maiores para beta-gal do que scFv13 1-4, destacando a engenharia simultânea de solubilidade e ligação de antígeno.

Seguindo este procedimento, outros métodos como o ELISA usando lisado purificado podem ser realizados para verificar a especificidade do antígeno e determinar a afinidade de ligação de clones isolados. Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como rastrear um anticorpo para operar a ligação a um antígeno de interesse usando a via Tat para exibir essa biblioteca e panorâmica de esferas magnéticas para enriquecer e isolar aglutinantes de antígenos. Não se esqueça de que trabalhar com ácido sulfúrico pode ser extremamente perigoso e é necessário usar um equipamento de proteção individual adequado.