Name: Exibição Inner-membrana bacteriana para o rastreio de uma biblioteca de anticorpo Fragments (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: Aprenda a rastrear fragmentos de anticorpos para afinidade e solubilidade usando a via de translocação twin-arginine em Escherichia coli. Este método permite a engenharia intracelular eficaz de anticorpos funcionais.

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Agradecemos a Tomer Zohar pelo trabalho nos ensaios de triagem e caracterização de scFv. Uma parte deste trabalho foi apoiada pelo prêmio número F32CA150622 do Instituto Nacional do Câncer (para AJK). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional do Câncer ou dos Institutos Nacionais de Saúde.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Engenharia anticorpos para a actividade citoplasmática é uma tarefa difícil, devido ao ambiente redutor do citoplasma, o que impede a formação de ligações dissulfureto de estabilização 6,7. Isto faz com que a maioria dos anticorpos a ser inactiva no citoplasma, a menos que são concebidos para a estabilidade e a solubilidade no citoplasma, para além de ser manipulado para a afinidade de ligação. Os métodos existentes de exibição de fagos, exibição de superfície bacteriana, e métodos de exposição de superfície de levedura todos utilizam a via secretora 14-16 para a exibição de anticorpos manipulados, mas estes métodos não têm meios para dobragem engenheiro intracelular. Os anticorpos manipulados utilizando visor interior da membrana citoplasmática melhoraram a estabilidade e solubilidade porque o controlo da via da Tat qualidade dobragem previne a translocação de anticorpos que são mal dobrados e instáveis ​​no citoplasma. Este método simplifica o processo iterativo de engenharia de anticorpos intracelulares para uma afinidadeND solubilidade, como as duas propriedades são concebidos em um passo. Embora este método foi concebido para engenharia de anticorpos com a solubilidade no ambiente intracelular de redução, também poderia ser aplicada para anticorpos de engenharia para funcionar em condições não redutoras, uma vez que as proteínas por engenharia utilizando este método de manter a sua dobragem no ambiente oxidante do periplasma. Embora esta técnica simplifica o processo de engenharia de anticorpos com elevada afinidade e alta solubilidade citoplasmática, várias limitações são importantes a considerar quando se usa este protocolo. Quando se analisam os sinais de ELISA ecrã secundário para identificar variantes de scFv promissor, o limiar para discernir entre as variantes potencialmente interessantes e aqueles que não podem apresentar adequada de ligação do antigénio não é provável que seja aparente até depois de vários clones foram ainda caracterizados. É importante olhar para a ligação melhorada ao longo do anticorpo parental; Contudo,um sinal anormalmente elevada pode ser um indicativo de avidez de 29 ou efeitos de agregação 30, um desafio que não é exclusivo para a abordagem de triagem visor interno da membrana. Uma limitação chave para recordar quando se usa este protocolo é a incapacidade de recuperar esferoplastos depois de percorrer, como eles são não viáveis ​​(dados não publicados). Isto necessita os passos de amplificação de ADN e transformação para recuperar os plasmídeos que codificam anticorpos. Vários passos críticos do protocolo permitir a engenharia simultânea de dobragem e de ligação de anticorpos. Para o rastreio para ser bem sucedido, a biblioteca de scFv serem projectados devem ser expressos como uma fusão com o péptido sinal ssTorA. Sem esta sequência, os anticorpos não irão ser dirigidos para a via de Tat e, portanto, não vai ser translocada para o periplasma 19. Além disso, é imperativo que uma etiqueta de epitopo no terminal C está fundido com os anticorpos para permitir a detecção dos anticorpos exibidos no escaninhoensaios de ding. Claramente, a E. estirpe de E. coli utilizada para expressar os scFvs também deve ter a maquinaria necessária via de Tat, mas isto é verdade para a E. utilizada estirpes de E. coli. Modificações a este protocolo é possível melhorar o seu potencial para isolar anticorpos com as características desejadas. Um passo panning subtrativo pode ser concluída antes do panning contra o antigénio alvo para esgotar a biblioteca scFv de constituintes não-desejada. Os esferoplastos de bibliotecas podem ser incubados com esferas magnéticas revestidas com BCCP sozinho ou revestido com uma proteína não desejada, e os esferoplastos que se ligam a essas esferas pode ser descartada antes de rastreio dos restantes esferoplastos não ligadas para a ligação ao alvo desejada. Como mencionado nos resultados representativos, um método para melhorar a afinidade de um scFv isolado é incluir um competidor solúvel na reacção de deslizamento para competir com os scFv exibidos sobre os esferoplastos. Porque a amostra solúveletitor é uma proteína purificada, sem ADN é amplificado a partir dele, de modo que apenas sequências dos scFv exibidos sobre os esferoplastos são recuperados na reacção de PCR. Além disso, este método pode ser alargado a outros tipos de engenharia de anticorpos ou a proteínas de ligação que não anticorpos. E. visor interior da membrana coli é uma plataforma poderosa para anticorpos de engenharia com afinidade elevada e elevados níveis de solubilidade intracelular. Este método é particularmente adequado para a engenharia eficiente de anticorpos concebidos para funcionar no ambiente intracelular. Estes anticorpos intracelulares já estão a ser explorados como potenciais terapêuticos em vários campos, incluindo doenças neurodegenerativas, câncer e infecções virais 31. Esta técnica permitirá uma utilização mais generalizada de anticorpos intracelulares como ferramentas de pesquisa e medicina nestes domínios e qualquer outro campo onde estudar é desejado um alvo proteínas in situ.

Os anticorpos capazes de se dobrar e funcionar no ambiente intracelular são ferramentas promissoras para pesquisa e aplicações terapêuticas. Eles têm a capacidade de modular a actividade da proteína de ligação a uma proteína alvo dentro de células para prevenir interacções proteína-proteína, romper interacções proteína-ácido nucleico, ou impedir o acesso do substrato para enzimas 1-5. Embora os anticorpos têm um grande potencial para aplicações intracelulares, engenharia-los para a dobragem correcta e a solubilidade no ambiente intracelular enquanto se mantém a capacidade de se ligar a um antigénio alvo é um desafio. O ambiente citoplasmático redução previne a formação das ligações dissulfureto normalmente necessários para a dobragem estável de anticorpos de comprimento completo e fragmentos de anticorpos, incluindo o anticorpo de cadeia única (scFv) Anticorpos 6,7. Um número de abordagens de evolução dirigida têm sido utilizados para conceber anticorpos com Hafinidades IGH para alvo antígenos 8-10. Estas abordagens geralmente usam exibição de fagos, display de superfície de levedura, ou a exposição da superfície bacteriana para rastrear grandes bibliotecas de anticorpos 11-13. Estes métodos são poderoso e eficaz para a identificação de anticorpos que se ligam a alvos, ainda que eles dependem da via de secreção para proteínas de transporte que vai ser exibido 14-16. A via secretora transloca proteínas desdobradas a partir do citoplasma para dentro do lúmen reduzindo retículo endoplasmático em levedura ou para o periplasma das bactérias. As proteínas, em seguida, dobrar sob condições de oxidação e são exibidas na superfície da célula ou empacotado em partículas fágicas para o rastreio de afinidade de ligação 17,18. Como resultado, os anticorpos isolados utilizando essas técnicas não irão necessariamente dobra bem no citoplasma, e a solubilidade intracelular deve muitas vezes ser manipuladas separadamente, se os anticorpos irão ser utilizados em aplicações intracelulares. Melhorara eficiência de anticorpos de engenharia que são bem dobradas no citoplasma, que previamente relatado o sucesso de MAD-Trap (visualização ancorado à membrana para reconhecimento baseado-Tat de proteínas associando), um método para o rastreio de uma biblioteca de anticorpos scFv utilizando Escherichia coli inner- visor membrana 19. Bacterianas apresentam-membrana interna baseia-se na via de duplo-arginina translocação (TAT) para o transporte de anticorpos exibidos, em contraste com outros métodos de apresentação comum que utilizam a via de secreção. A via de Tat contém um mecanismo de controlo de qualidade que só permite, proteínas correctamente dobradas solúveis a serem transportados a partir do E. coli citoplasma, através da membrana interior, e para o periplasma 20,21. Substratos sobre-expressa Tat (ie., As proteínas direccionadas para a via de Tat com uma fusão N-terminal com o péptido de sinal Tat ssTorA) que são bem dobrada no citoplasma formar uma translocação de longa duração com o intermediário N-terminal in o citoplasma e o C-terminal no periplasma 19. Isto permite a exibição de substratos Tat correctamente dobradas, incluindo fragmentos de anticorpo, sobre a face periplasmática da E. coli membrana interna. Após a remoção da membrana externa por digestão enzimática para gerar esferoplastos, os anticorpos são expostos para o espaço extracelular (Figura 1). Isto permite que os substratos Tat indicadas na membrana interna para ser rastreados para a ligação a um alvo específico. Importante, aproveitando a via de Tat para a exposição da superfície da célula assegura que apenas os anticorpos da biblioteca que são bem dobradas no citoplasma será interrogado para a ligação, o que permite a engenharia simultânea de afinidade e de dobragem de ligação intracelular. Neste protocolo, descrevemos como exibir uma biblioteca de scFv sobre a E. membrana interna coli, deslocar a biblioteca contra um antigénio alvo, e executar uma tela secundária para identificar os componentes mais promissores da biblioteca. Enquanto nos concentramos<html> o protocolo de scFvs, o método pode ser aplicado a engenharia de qualquer proteína cuja aplicação requer dobrar vinculativo e intracelular. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" /> Figura 1. Tela interna da membrana Tat. Em E. coli, anticorpos scFv, expressos como uma fusão com a sequência sinal ssTorA e correctamente dobradas no citoplasma são transportados através da membrana interna. Uma translocação formas intermédias, onde os scFvs são ancoradas na membrana interna com o terminal N no citoplasma e o C-terminal no periplasma. A E. membrana externa de E. coli é digerido enzimaticamente para formar esferoplastos, expondo assim os anticorpos ancorados para o espaço extracelular e torná-los disponíveis para a detecção utilizando um anticorpo que se liga ao marcador de epítopo C-terminal fundido no anticorpo exibido.carga / 54583 / 54583fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<table><tbody><tr><td>Biblioteca scFv</td><td>Varia</td><td></td><td>Uma biblioteca scFv adequada deve ser obtida de uma fonte comercial ou acadêmica.</td></tr><tr><td>Células MC4100 E. coli</td><td>Centro de Estoque Genético Coli</td><td>6152</td><td>As células precisam ser quimicamente competentes ou eletrocompetentes, dependendo do método de transformação selecionado.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco meio de cultura desidratado LB Caldo, Miller (Luria-Bertani)</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol (Cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio, dibásico (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio, monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 0,5 M</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix (detergente de lise celular)</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO, 3,000&nbsp; daltons</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>Antígeno alvo</td><td>varia</td><td>N/A</td><td>O antígeno-alvo purificado pode ser comprado ou produzido/purificado.</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Ímã Dynamag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubo</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>Primers de PCR</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>As sequências de primers são as descritas no protocolo.</td></tr><tr><td>10x tampão de reação de DNA ligase T4</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucelotide quinase (PNK)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>Certifique-se de que o tampão de ligase T4 usado na reação de fosforilação do primer contém 1 mM de ATP.&nbsp;</td></tr><tr><td>5x pacote tampão Phusion HF</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de solução de desoxinucleotídeo (dNTP), 10 mM cada dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>Outras polimerases de alta fidelidade podem ser usadas como alternativa, mas a temperatura de recozimento em <forte>Tabela 3</forte> deve ser ajustada.</td></tr><tr><td>Termociclador C1000 Touch com módulo duplo de reação rápida 48/48</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV gel e sistema de limpeza de PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Microdiálise filtro de membrana</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de fundo redondo de poliestireno de 96 poços</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Tampas de placas de ensaio de poliestireno geral Costar Corning</td><td></td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas de microtitulação</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 bem EIA / RIA Easy Wash transparente de fundo plano poliestireno microplaca de alta ligação</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-blotter policarbonato 96-well ferramenta replicante</td><td>Bel-Art Products</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado instantâneo</td><td>Qualidade Biológica</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 (polissorbato 20)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Reagente PopCulture (detergente concentrado de lise celular)</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal ANTI-FLAG M2-Peroxidase(HRP) produzido em camundongo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (H2SO4), 10&nbsp; N solução</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap folha de alumínio</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Epoch microfotômetro de microplacas</td><td>Fisher Scientific</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

exibição inner-membrana bacteriana para o rastreio de uma biblioteca de anticorpo fragments

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Os anticorpos projetados para a função intracelular não devem apenas ter afinidade com seu antígeno alvo, mas também devem ser solúveis e corretamente dobrados no citoplasma. Os métodos comumente usados para a exibição e triagem de bibliotecas de anticorpos recombinantes não incorporam o controle de qualidade do dobramento de proteínas intracelulares e, portanto, a capacidade de ligação ao antígeno e o dobramento citoplasmático e a solubilidade dos anticorpos projetados usando esses métodos geralmente devem ser projetados separadamente. Aqui, descrevemos um protocolo para rastrear uma biblioteca recombinante de anticorpos de fragmento variável de cadeia única (scFv) para ligação ao antígeno e dobramento citoplasmático adequado simultaneamente. O método aproveita o mecanismo intrínseco de controle de qualidade de dobramento intracelular da via de translocação de arginina gêmea (Tat) de Escherichia coli para exibir uma biblioteca scFv na membrana interna de E. coli. A via Tat garante que apenas proteínas solúveis e bem dobradas sejam transportadas para fora do citoplasma e exibidas na membrana interna, eliminando assim scFvs mal dobrados antes da interrogação para ligação ao antígeno. Após a remoção da membrana externa, os scFvs exibidos na membrana interna são comparados a um antígeno-alvo imobilizado em esferas magnéticas para isolar os scFvs que se ligam ao antígeno alvo. Uma triagem secundária baseada em ensaio imunoenzimático (ELISA) é usada para identificar os scFvs mais promissores para caracterização adicional. A ligação ao antígeno e a solubilidade citoplasmática podem ser melhoradas com rodadas subsequentes de mutagênese e triagem para projetar anticorpos com alta afinidade e alta solubilidade citoplasmática para aplicações intracelulares.

O mecanismo de controlo da qualidade da proteína intracelular dobragem da via Tat em E. coli limita o transporte através da membrana celular interna de proteínas que são bem dobradas no ambiente citoplasmático redutor. Por sobre-expressando uma fusão de um scFv com a sequência de sinal ssTorA (a sequência de sinal da proteína Tora, que é transportado naturalmente Tat pela via 20), a translocação está parado, o que resulta na exibição de scFv sobre a membrana interna 19. Após interrupção enzimática da membrana externa, os anticorpos exibidos são disponibilizados para o rastreio para a actividade de ligação ao antigénio. A capacidade para tirar vantagem da via de Tat para exibição de scFv foi demonstrada por Karlsson et al. 19 (Figura 6). Os anticorpos scFv scFv13 scFv13.R4 e foram fundidas com quer a sequência nativa ou uma ssTorA ssTorA modificado que carece do par de resíduos arginina-arginina reconhecido pelaa via de Tat. scFv13.R4 foi manipulado por Martineau et al., a partir de scFv13 através de quatro ciclos de evolução dirigida e é conhecido para dobrar bem no citoplasma 9. Este scFv foi apresentado na membrana interna, mas apenas quando expresso como uma fusão com a sequência sinal nativa ssTorA (Figura 6). Contrariamente, scFv13 não é bem dobrada citoplasmaticamente 9, de modo que não é apresentada também na membrana interna, independentemente de a sequência de sinal a qual se encontra fundido. Além disso, se os scFvs foram expressos em células que não tinham a proteína TATC, um componente vital da máquina Tat 20,28, display não foi observado, mostrando a importante ligação entre a tela do interior da membrana e da via Tat. Estes resultados demonstram que apenas as proteínas que contêm o péptido de sinal de Tat e que são correctamente dobrado no citoplasma são exibidas na membrana interna, permitindo o transporte através da via Tat para funcionar como uma tela para fol intracelularding. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" /> Figura 6. Detecção de scFv exibidos sobre a membrana interna. A citometria de fluxo foi realizada a análise para detectar a exposição de mal dobrado scFv13 e bem dobrada scFv13.R4 na membrana interna. Os scFv foram fundidos com ssTorA nativa ou ssTorA (KK), em que o par Arg-Arg na sequência ssTorA foi modificado para Lis-Lis. As etiquetas de epitopo FLAG C-terminal as scFv foram detectados com um isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo anti-FLAG. As células sem a proteína TATC (ΔtatC) e ssTorA-scFv13 sem o marcador FLAG foram testados como controlos. H indica o valor de fluorescência média. Reproduzido de referência 19 com permissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <p class="jove_content" fo: manter-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; exibição Inner-membrana com êxito pode isolar anticorpos scFv com altos níveis de afinidade para a proteína alvo e elevados níveis de solubilidade citoplasmática. Além disso, as rodadas subseqüentes de evolução dirigida usando o visor interno da membrana melhorar as características de anticorpos 19. Para demonstrar isto, uma biblioteca de PCR propensa a erro com base na scFv13, que tem um baixo grau de afinidade de ligação para β-galactosidase, foi deslocada contra o antigénio alvo β-galactosidase usando o visor e panning método descrito no protocolo. scFv 1-4 foi isolado depois de um ciclo de mutagénese e deslizamento, e exibiu maior afinidade de ligação para a p-galactosidase do que scFv13 (Figura 7A) e um nível mais elevado de solubilidade citoplasmático (Figura 7B). Uma nova biblioteca, com base em 4/1 de scFv, foi feito usando propensa a erros de PCR, e panning desta biblioteca de segunda geração contraβ-galactosidase foi feito utilizando uma modificação do protocolo descrito. O panning contra β-galactosidase para a segunda fase da evolução foi feito na presença de purificada, solúvel scFv 14 como um concorrente para melhorar a probabilidade de isolar clones com maior afinidade do que scFv 1-4. Após esta segunda rodada de mutagênese e panning, scFv 2-1 e 2-3 scFv foram isolados usando a triagem secundária baseada em ELISA. Estes scFvs não só exibiu maior afinidade de ligação para β-galactosidase que scFv13, mas também exibiu uma melhor ligação do que o clone primeira rodada scFv 1-4. scFv 2-1 exibiram β-galactosidase de ligação comparável à do scFv13.R4 (Figura 7A). scFv 2-3 também mostra um aumento adicional na solubilidade em comparação com o scFv citoplasmática 14, com destaque para a engenharia simultânea de solubilidade e de ligação ao antigénio. Uma vez que a afinidade e a expressão solúvel dos scFvs são rastreados para simultaneamente, é possível que um scFv seleccionados foi modsolubilidade rar, mas de alta versa ligação ou vice. Por exemplo, o scFv tem 2-1 expressão solúvel scFv menor do que 3/2, mas apresenta maior afinidade de ligação para p-galactosidase. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" /> Figura 7. alvo de ligação e expressão citoplasmática de scFv variantes isolado usando o visor interior da membrana. ScFv (A) foram expressas no citoplasma da E. coli (por exemplo., sem a sequência de sinal ssTorA) com uma hexa-histidina (6 × His) tag e purificado usando ácido spin-colunas de níquel-nitrilotriacético. A ligação dos scFvs purificados a p-galactosidase foi medida com um ensaio ELISA. scFv purificadas foram carregadas em placas de ELISA revestidas com β-galactosidase, e os scFvs ligados foram detectados com um anticorpo anti-His 6 ×. Os dados são uma média de seis replicados, e a barra de erro mostra o erro padrão da média.(B) As fracções solúveis e insolúveis dos lisados celulares a partir de células que expressam scFvs citoplasmaticamente foram analisados por Western blot sondada com um anticorpo anti-His 6 ×. A concentração total de proteína foi utilizada para normalizar o carregamento das amostras. Reproduzido (A) e adaptado (B) a partir da referência 19 com permissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Fornecemos um método para rastrear simultaneamente uma biblioteca de fragmentos de anticorpos quanto à afinidade de ligação e solubilidade citoplasmática usando a via de translocação de arginina dupla de Escherichia coli, que possui um mecanismo de controle de qualidade inerente para dobramento de proteínas intracelulares, para exibir os fragmentos de anticorpos na membrana interna.

Exibição Inner-membrana bacteriana para o rastreio de uma biblioteca de anticorpo Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

O objetivo geral deste procedimento é aproveitar o controle de qualidade da dobragem da via de translocação de arginina dupla para projetar a ligação de fragmentos de anticorpos e sua dobragem intracelular em uma única etapa, o que terá aplicações na engenharia de anticorpos para funcionamento intracelular. Este método pode ajudar a superar desafios importantes no campo da engenharia de anticorpos, como a dificuldade em projetar anticorpos para dobrar e funcionar adequadamente em ambientes citoplasmáticos redutores. Apenas os anticorpos que se dobram bem no citoplasma são exibidos e analisados quanto à ligação.Oferece uma vantagem em relação à exibição em levedura e fago, que dependem de vias secretórias para a exibição. As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento de doenças neurodegenerativas, câncer e infecções virais, pois essas doenças envolvem patogênese intracelular que poderia ser alvo de anticorpos. A demonstração visual deste método é essencial, pois compreender como gerar e trabalhar com esferoplastos é desafiador.Após fundir a biblioteca de scFv à sequência sinal ssTorA e cultivá-la a 37 graus Celsius com agitação por três horas, permita a expressão da bibli游戏副本 de scFv a 20 graus Celsius e 225 rpm durante a noite, por 15 a 22 horas. Após a incubação, use um espectrofotômetro para medir a densidade óptica a 600 nanômetros. Em seguida, centrifugue o volume calculado de cultura induzida em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro a 12.000 × g e temperatura ambiente por cinco minutos.Remova o sobrenadante e utilize 100 microlitros de tampão de fracionamento gelado ou fB para ressuspender os pellets. Em seguida, centrifugue as amostras a 12.000 × g e temperatura ambiente por um minuto. Após a remoção do sobrenadante, utilize 350 microlitros de fB gelado suplementado com 3,5 microlitros de lisozima a 10 miligramas por mililitro para ressuspender os pellets.Em seguida, enquanto vórtex agita lentamente os tubos, adicione gota a gota 700 microlitros de EDTA 1 milimolar e, então, incube os tubos em um rotador de tubos à temperatura ambiente por 20 minutos para misturar as amostras. Remova os tubos do rotador. Adicione 50 microlitros de MgCl2 0,5 molar gelado a cada tubo e incube-os no gelo por 10 minutos.Em seguida, centrifugue as amostras a 11.000 × g e quatro graus Celsius por 10 minutos. Agora, com uma micropipeta e uma ponteira de um mililitro, aspire lentamente uma porção do pellet. Depois, segurando o tubo em um ângulo com a abertura diretamente acima de um novo tubo de 1,5 mililitro, levante lentamente a ponteira da pipeta para fora do sobrenadante e deslize o pellet para o novo tubo.Após remover o sobrenatante em excesso, use um mililitro de PBS gelado para ressuspender os esferoplastos. Os esferoplastos devem ser completamente ressuspendidos antes da etapa de panning, pois scFvs não ligantes presentes em agregados resultarão em falsos positivos no panning. Após biotinilar o antígeno-alvo de acordo com o protocolo descrito, ressuspenda as microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina no frasco original.Em seguida, transfira de sete a dez vezes 10 à nona potência de microesferas para um tubo de 1,5 mililitro. Coloque o tubo com microesferas no suporte magnético durante dois minutos para reunir as microesferas na lateral do tubo e, com pipeta, remova cuidadosamente o sobrenadante. Retire o tubo do ímã e use PBS para ressuspender as microesferas sem formar bolhas.Em seguida, retorne o tubo ao ímã e remova o tampão antes de lavar as microesferas mais duas vezes com PBS. Adicione um mililitro de lisado contendo o antígeno biotinilado às microesferas e incube em temperatura ambiente por 30 minutos sob rotação suave. Após a incubação, use PBS com 1% de BSA para lavar as microesferas cinco vezes.Em seguida, use PBS com 1% de BSA para ressuspender as esferas. Para triar a biblioteca de scFv, comece adicionando quatro vezes 10 à nona potência de esferoplastos e oito vezes 10 à oitava potência de esferas a um tubo estéril de 15 mililitros. Adicione PBS 1x com 1% de BSA para ajustar o volume total a quatro mililitros.Em seguida, alíquotas da solução em quatro tubos de 1,5 mililitro, contendo um mililitro cada, e incubar as reações a quatro graus Celsius com rotação suave durante cinco horas. Para preparar os esferoplastos ligados às microesferas para PCR, colocar os tubos da reação de panning no ímã por três minutos. Remover o sobrenatante e lavar as microesferas com PBS 1x contendo 1% de BSA quatro vezes, como anteriormente.Em seguida, utilize 25 microlitros de ddH2O por tubo para ressuspender as microesferas. Conforme descrito no protocolo textual, realize a PCR de plasmídeo completo para amplificar os genes de scFvs ligados às microesferas e, em seguida, recircularize o plasmídeo a partir do produto da PCR. Transforme toda a reação em células MC4100 equalizadas de acordo com o protocolo textual.Para identificar clones utilizando ELISA, descongele um tubo da subbiblioteca selecionada e plaque em placas de ágar LB. Adicione 200 microlitros de LB com 20 microgramas por mililitro de cloranfenicolol em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços com fundo redondo. Com a ponta de uma pipeta, retire uma colônia individual da placa de ágar.Em seguida, coloque a ponteira no primeiro poço da placa de 96 poços e agite suavemente para inocular. Continue inoculando uma colônia em cada poço. Incube a 37 graus Celsius por 20 a 24 horas em um agitador para microplacas.Após preparar uma solução de revestimento com o antígeno-alvo de acordo com o protocolo descrito no texto, adicione 50 microlitros da solução a cada poço de uma placa ELISA de poliestireno transparente com ligação elevada de 96 poços. Incube as placas a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, replique as colônias das placas de cultura de 96 poços em placas de ágar de acordo com o protocolo descrito no texto.Em seguida, retire a solução de revestimento das placas de ELISA e adicione 100 microlitros da solução bloqueadora preparada conforme o protocolo descrito no texto a cada poço. Incube à temperatura ambiente por pelo menos duas horas ou a quatro graus Celsius durante a noite. Adicione 20 microlitros de um detergente concentrado para lise celular a cada poço da placa de cultura de fundo redondo e incube a placa de cultura em um agitador de microplaca à temperatura ambiente por 15 a 20 minutos.Esvazie a solução bloqueadora das placas de ELISA e lave as cavidades quatro vezes com 200 microlitros de tampão de lavagem preparado conforme o protocolo descrito no texto. Após remover a última lavagem, transfira 50 microlitros de cada cavidade da placa de lisado celular para a cavidade correspondente da placa de ELISA. Incube as placas à temperatura ambiente por uma a duas horas.Prossiga com a remoção das amostras da placa de ELISA e lave as cavidades quatro vezes. Em seguida, prepare a solução de anticorpo para detecção de scFvs de acordo com o protocolo descrito no texto. Adicione 50 microlitros da solução de anticorpo a cada cavidade e incube por uma a duas horas à temperatura ambiente.Lave as placas de ELISA quatro vezes com tampão de lavagem antes de adicionar 200 microlitros por poço de substrato de HRP preparado de acordo com o protocolo do fabricante. Incube as placas em repouso, à temperatura ambiente e no escuro, por 30 a 60 minutos. Para interromper a reação, adicione 50 microlitros de H2SO4 3 M a cada poço e pipete suavemente para misturar a solução.Por fim, meça a absorbância utilizando um leitor de placas a 492 nanômetros. Neste experimento, os anticorpos scFv scFv13 e scFv13.R4 foram fundidos à sequência nativa de ssTorA ou a uma versão modificada de ssTorA que não é reconhecida pela via de translocação de arginina gêmea, também chamada de via Tat. ScFv.O R4 dobra bem e é expresso na membrana interna quando fundido ao ssTorA nativo. O ScFv13 não dobra adequadamente e não é exibido na membrana interna, independentemente do peptídeo sinal Tat ao qual é fundido. Esses resultados demonstram que somente proteínas que contêm o peptídeo sinal Tat e são corretamente dobradas no citoplasma são exibidas na membrana interna, permitindo que a via Tat funcione como uma triagem para o dobramento intracelular.Neste experimento, uma biblioteca de PCR com erros baseada em scFv13, que possui baixo nível de afinidade de ligação para beta-galactosidase, foi submetida à seleção contra beta-gal. O scFv 1-4 foi isolado e exibiu maior afinidade de ligação para beta-gal do que o scFv13, bem como um nível mais elevado de solubilidade citoplasmática. Utilizando o scFv 1-4 como competidor contra a biblioteca de segunda geração de scFv 1-4, os scFv 2-1 e 2-3 foram isolados e demonstraram afinidades de ligação ainda maiores para beta-gal do que o scFv13 1-4, destacando a engenharia simultânea de solubilidade e ligação ao antígeno.Após este procedimento, outros métodos, como ELISA utilizando lisado purificado, podem ser realizados para verificar a especificidade do antígeno e determinar a afinidade de ligação das linhagens isoladas. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como triar um anticorpo para verificar sua ligação a um antígeno de interesse, utilizando a via Tat para exibir essa biblioteca e o panning com microesferas magnéticas para enriquecer e isolar ligantes do antígeno. Não se esqueça de que trabalhar com ácido sulfúrico pode ser extremamente perigoso e o uso de equipamento de proteção individual adequado é necessário.

bacterial-inner-membrane-display-for-screening-library-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um método é descrito com acompanhamento visual para a realização escaláveis, selecções de alto rendimento de bibliotecas combinatórias de anticorpos sintéticos exibidos em fagos contra centenas de antigénios simultaneamente. Usando esta abordagem paralela, isolámos fragmentos de anticorpos que exibem uma elevada afinidade e especificidade para diversos antígenos que são funcionais em imunoensaios convencionais.

Selecção de alta Scalable Rendimento de bibliotecas de anticorpos em fagos sintética exibida-

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para a descoberta dos reagentes de afinidade do peptide, uma alternativa robusta para anticorpos. O método de classificação semi-automatizadas aqui simplificou biopanning para diminuir a ocorrência de falsos positivos. Aqui ilustramos o processo de pensamento e técnicas aplicadas na avaliação de candidatos e minimizando a análise a jusante.

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

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Aqui, apresentamos um protocolo para tela extracelular da proteína microarrays para identificação de interações ligante-receptor romance em alta taxa de transferência. Também descrevemos um método para realçar a deteção de interações da proteína-proteína transiente usando complexos proteína-Microconta.

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O método de BSelex para identificar e recuperar anticorpos antígeno-específicos individuais das pilhas mononucleares do sangue periférico humano combina a citometria do fluxo com o único PCR da pilha e a clonagem.

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Criando sistemas de dimerização de proteínas quimicamente induzidas altamente específicos pela seleção de fagos de uma biblioteca de anticorpos de domínio único combinatorial

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