A esporulação eficiente dos Saccharomyces cerevisiae Num Multiwell Format 96

O objetivo geral deste protocolo é esporular a levedura de brotamento de forma eficiente em um formato de 96 poços. Embora muitas telas em grande escala tenham sido realizadas na levedura em brotamento, estudos de alto rendimento que analisam a meiose e a esporulação foram limitados. A técnica descrita neste vídeo tem a vantagem de esporular a levedura de forma eficiente e econômica em um formato de 96 poços compatível com triagem de alto rendimento.

Tive a ideia desse método porque queria usar uma biblioteca de plasmídeo de dois mícrons lado a lado para rastrear supressores de alta cópia de um mutante que não conseguia formar esporos refratários. Inicialmente, minhas eficiências de esporulação eram ruins no formato de 96 poços. Descobri que isso se devia à aeração inadequada.

Comece este procedimento descongelando a cepa de levedura SK1 em uma placa de extrato de levedura, peptona, glicerol ou YPG. Use um bastão estéril para raspar uma pequena quantidade de células do frasco do freezer contendo o estoque de glicerol e espalhe-o em uma placa YPG. Cultive o fermento por 12 a 16 horas a 30 graus Celsius.

Em seguida, listre o fermento da placa YPG em uma placa de peptona dextrose de extrato de levedura, ou YPD, para cólon único. Cultive o fermento na placa YPD por 24 a 48 horas a 30 graus Celsius. Após 24 a 48 horas de crescimento em meio sólido YPD, inicie uma cultura YPD de 25 mililitros usando uma única colônia da placa YPD.

Cultive esta cultura durante a noite em uma incubadora de agitação de 30 graus Celsius a 220 RPM até que as células atinjam um OD600 de 4,0 a 7,0. No dia seguinte, use uma quantidade adequada de células da cultura YPD para iniciar uma cultura de 125 mililitros em acetato de peptona de extrato de levedura, ou YPA, com um OD600 de 0,1. Cultive a cultura em uma incubadora com agitação de 30 graus Celsius a 220 RPM até que o OD600 esteja entre 1,3 e 1,5.

Transfira a cultura para tubos de centrífuga e gire a 1800X G em uma centrífuga de mesa por cinco minutos para pellet as células. Lave as células uma vez com um volume de 0,5 volume de água deionizada autoclavada estéril. Gire novamente e descarte a água.

Ressuspenda as células em um volume 1X de meio de esporulação. Para preparar células de diferentes genótipos, as células de estoques congelados descongelados em uma placa multipoços 96 são primeiro transferidas para o meio sólido YPG. Acenda um frogger de 96 pinos e resfrie-o momentaneamente em uma placa de meio sólido antes de tocá-lo nas colônias de levedura.

Cultive o fermento durante a noite a 30 graus Celsius. No dia seguinte, transferir as células do meio sólido YPG para o meio sólido YPD ou seletivo, dependendo do genótipo da estirpe. YPD é usado nesta demonstração.

Cultive a levedura a 30 graus Celsius até que as colônias sejam formadas para cada cepa. Alíquota de 1,2 mililitros de meio líquido YPD em cada poço de uma placa de 96 poços de profundidade. Transfira as células do meio sólido para o meio líquido.

Cubra a placa com uma tampa de plástico de uma placa de Petri retangular e segure a tampa no lugar usando um pedaço de fita adesiva para restringir minimamente a circulação de ar. Cultive as células durante a noite em um agitador de 30 graus Celsius a 220 RPM. No dia seguinte, centrifugue a 1800X G por cinco minutos.

Despeje a mídia e adicione 500 microlitros de YPA a cada poço. E ressuspenda as células peletizadas. Cubra o prato com uma tampa de plástico presa por fita adesiva.

Cultive as células por 15 horas em uma incubadora de agitação de 30 graus Celsius a 220 RPM. Para fornecer aeração adequada para esporulação eficiente, adicione em cada poço de uma placa de 96 poços uma conta de vidro sólido estéril de três milímetros ou uma barra de agitação magnética estéril de cinco milímetros por dois milímetros. Se todas as células forem do mesmo genótipo, aliquat 500 microlitros de células mais meio em cada poço da placa de 96 multipoços.

Cubra o prato com uma tampa de plástico presa por fita adesiva. Se as células forem de genótipos diferentes, gire as células que estão em YPA a 1800X G por cinco minutos e despeje a mídia. Adicione 500 microlitros de meio de esporulação a cada poço.

E ressuspenda as células peletizadas no meio de esporulação. Cubra o prato com uma tampa de plástico presa por fita adesiva. Se estiver usando contas de vidro, coloque as amostras em uma incubadora agitada a 30 graus Celsius e agite a 220 RPM para esporulação.

Se estiver usando barras de agitação magnéticas, coloque as amostras em uma placa de agitação dentro de uma incubadora a 30 graus Celsius para esporulação. A velocidade exata de agitação para as barras magnéticas não é muito importante, desde que todas as barras estejam se movendo energeticamente e a cultura seja arejada. 36 horas depois, recupere as amostras para monitorar a progressão por esporulação.

Retire seis microlitros de células de cada cultura esporulante e adicione a 24 microlitros de meio de esporulação em uma placa de lamínula de 96 poços. Deixe as células assentarem por cinco minutos antes de examiná-las usando um microscópio invertido. Uma esporulação representativa de duas cepas diferentes é mostrada nessas imagens de células visualizadas usando uma objetiva de 63X em um microscópio invertido.

As tétrades refratárias, indicadas pelas pontas das setas, podem ser vistas na cultura do tipo selvagem. Mas não na cultura que contém as células de deleção smk1 deficientes em esporulação. Foram feitas comparações entre as eficiências de esporulação de células esporuladas em placas de múltiplos poços e células esporuladas usando volumes maiores em frascos.

O uso de placas de múltiplos poços não alcançou a alta eficiência observada rotineiramente quando se utiliza o protocolo mais típico de esporulação em frascos. A esporulação em placas de vários poços com aeração adequada pode atingir eficiências de esporulação suficientes superiores a 50% com os melhores resultados obtidos usando uma barra de agitação de cinco milímetros. No entanto, dado o alto custo das pequenas barras de agitação, as eficiências obtidas com o uso de esferas de vidro são comparáveis.

Embora as barras de agitação de cinco e sete milímetros se encaixem no poço de uma placa de 96 poços múltiplos, o uso de uma barra de agitação de sete milímetros resultou em baixa eficiência de esporulação. A barra de agitação de sete milímetros em um poço tende a interagir com uma barra de agitação em um poço adjacente. Evitando que as barras se mexam adequadamente e proporcionando aeração adequada à cultura.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como esporular com eficiência as células de levedura em cultura líquida no formato de 96 poços. Uma vez dominado, esse processo pode ser concluído em seis dias, se feito corretamente. Este procedimento pode ser usado para rastrear diferentes cepas mutantes, plasmídeos ou inibidores de moléculas pequenas quanto ao seu efeito na meiose e esporulação.

Após seu desenvolvimento, essa técnica foi utilizada para estudar a regulação do ciclo celular meiótico e como a citocinese e a meiose são acopladas na esporulação em Saccharomyces cerevisiae.