o Drosophila Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar como dissecar os discos e cérebros imaginários antenais oculares da drosófila, carregando clones marcados com fluorescência geneticamente definidos e como processá-los para visualizar e quantificar as alterações na expressão gênica e a invasividade celular. Os procedimentos descritos podem ajudar a fornecer novos insights sobre o papel dos genes e do desenvolvimento epitelial, homeostase ou doença e a dissecar os mecanismos subjacentes à sua competição, proliferação compensatória ou corporação interclonal. A principal vantagem do estudo é que fornecemos um conjunto completo de protocolos adaptados para uma análise quantitativa e qualitativa aprofundada dos mosaicos genéticos da drosófila.

Geralmente, os indivíduos que trabalham com o modelo de drosófila lutam porque não conseguem reconhecer o disco imaginal antenal do olho do outro disco imaginário. Para facilitar o reconhecimento de clones de disco imaginário com antena ocular com marcadores fluorescentes dentro do corpo da larva, recomenda-se realizar as dissecções iniciais sob um microscópio fluorescente. A análise em mosaico com um marcador celular repressível ou MARCM permite a geração de adesivos clonais geneticamente definidos em um contexto fenotipicamente selvagem.

Um FLP acionado por um promotor sem olhos catalisa a recombinação entre dois elementos FRT flanqueando um de parada marcado com um gene amarelo. Após a replicação do DNA, o FLP catalisa a troca das cromátides não irmãs entre os cromossomos homólogos, gerando cromátides irmãs. Um carregando o alelo do tipo selvagem e o repressor Gal80 e o outro o mutante.

Na mitose, eles segregam para produzir duas células-filhas, sendo uma mutante homozigótica e a outra do tipo selvagem. A perda do repressor Gal80 permite a expressão de GFP no mutante, enquanto as células do tipo selvagem permanecem negativas para GFP. Para começar o experimento, colha larvas de mosaico esguichando PBS na garrafa de mosca para cobrir a superfície do alimento.

Em seguida, amoleça a camada superior com uma espátula e despeje a pasta de alimentos contendo larvas em uma placa de Petri. Escolha delicadamente as larvas e transfira-as para um prato de embriões cheio de PBS. Colete pelo menos 20 larvas para imunomarcação e 80 larvas para quantificação da invasividade do tumor.

Lave as larvas com PBS para remover todos os restos de comida. Usando um microscópio estéreo fluorescente com ampliação de 8:16x, identifique e descarte todas as larvas de leopardo, que são aquelas que exibem pontos positivos aleatórios de GFP em todo o corpo. Coloque o prato contendo as larvas restantes em PBS no gelo até a dissecação.

Para dissecar o disco imaginal antenal do olho sob o microscópio estéreo, use um par de pinças e agarre suavemente a larva em aproximadamente 2/3 do comprimento do corpo posterior à cabeça. Com o segundo par de pinças, agarre os ganchos da boca das larvas e puxe-os para longe do corpo. Usando fórceps, desembarace os ganchos da boca da cutícula sobreposta e do tecido estranho, como as glândulas salivares e o corpo adiposo.

Alternativamente, para preparar o complexo cerebral do disco olho-antena, mantendo o cordão nervoso ventral intacto, use uma pinça para cortar uma larva no meio do corpo. Descarte a metade posterior. Segure a metade anterior do corpo larval com as pontas de um par de pinças e, em seguida, vire a larva do avesso, empurrando os ganchos da boca para dentro com a ponta do segundo par e rolando a cutícula sobre ela com o primeiro par de pinças.

Remova cuidadosamente todo o tecido estranho, incluindo o intestino, o corpo adiposo e as glândulas salivares. Puxe suavemente os ganchos da boca para longe da cutícula. Libere o complexo cerebral do disco olho-antenal preso aos ganchos da boca, cortando as projeções axonais que se estendem do cordão nervoso ventral aos músculos e à epiderme.

Para transferir o tecido, primeiro reveste uma ponta de micropipeta P20 pipetando as carcaças restantes do corpo para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, use a mesma ponta para transferir o tecido dissecado. Para transferir complexos cerebrais de disco antenatório ocular maiores, pré-corte a ponta P20 para ampliar a abertura. Fixe as amostras em 400 microlitros de fixador de 4% PFA por 25 minutos em temperatura ambiente durante a nutação.

Em seguida, remova o fixador e lave as amostras com PBST três vezes por 10 minutos com nutação. Em seguida, substitua o PBST por 500 microlitros de solução de coloração DAPI e nutato por 15 minutos no escuro. Lave o lenço uma vez por 10 minutos com PBST.

Para completar a dissecção, use uma pipeta de um mililitro para transferir o tecido de volta para um prato de vidro cheio de PBS. O uso de dois pares de pinças separa os cérebros a serem usados para quantificação da invasividade dos discos antenais oculares, cortando as hastes ópticas. Liberte os discos antenais oculares prendendo-os dos ganchos bucais.

Coloque uma gota do meio de montagem em uma lâmina abdutiva e, usando uma pinça, distribua o líquido em uma camada fina. Para quantificar a invasividade, coloque pelo menos 80 cérebros intactos fixos para cada genótipo em uma única lâmina. Endireite e posicione o tecido conforme desejado.

Toque suavemente uma borda de uma lamínula no meio e abaixe-a lentamente com a ajuda de uma pinça para evitar a criação de bolhas. Use um lenço de laboratório para absorver o excesso de meio de montagem nas bordas. O tecido agora pode ser examinado usando imagens confocais.

Peça a uma parte neutra para anonimizar os slides para que a pontuação seja imparcial. E ter lâminas avaliadas independentemente por pelo menos dois pesquisadores. Divulgue os genótipos somente após a conclusão da pontuação.

Avalie o grau de malignidade sob um microscópio estéreo fluorescente equipado com um conjunto de filtros GFP. Usando um marcador rotular cérebros que já foram visualizados para evitar a contagem dupla. Imagens confocais fluorescentes mostram cérebros dissecados de larvas portadoras de tumores clonais malignos marcados com GFP mutante RAS V12 corados com DAPI.

Os painéis representam os quatro graus diferentes de invasividade do tumor. A quantificação imparcial revelou que a inibição da sinalização JNK e RAS V12 rabiscado em um clone suprimiu a invasividade do tumor. Nos discos antenais oculares de controle, o repórter TRE-DsRED sensível a JNK rotula apenas uma faixa estreita de células que vão da antena à parte do olho.

Em contraste, a atividade do TRE-DsRED foi marcadamente aumentada nos tumores clonais malignos positivos para GFP. No dia 8, as células tumorais cresceram demais nos discos antenais do olho e se espalharam para o cordão nervoso ventral. As células tumorais invasoras também mostraram aumento da ativação de JNK em comparação com o tecido circundante.

Enquanto o bloqueio de JNK reduziu claramente a atividade de TRE-DsRED nos clones tumorais, o aumento da intensidade do laser revelou um aumento nas células epiteliais vizinhas aos clones. Além disso, um repórter de hemolectina delta DsRED mostrou que, em contraste com alguns aglomerados de hemócitos encontrados nas reentrâncias do epitélio ocular-antenal de controle, hemócitos acumulados na antena ocular e no tecido cerebral composto por tumores malignos. Após a inibição de JNK, o número de células imunes associadas diminuiu drasticamente.

A invasividade tumoral aumentada, a atividade JNK e a infiltração de hemócitos foram acompanhadas por uma regulação positiva significativa de MMP1 mNRA, conforme determinado por QRTPCR usando RNA total isolado de discos antenais oculares em mosaico dissecados. Uma vez dominado, mais de 60 pares de discos oculares e cérebros podem ser dissecados em 30 minutos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de gerar um número suficiente de larvas dos genótipos desejados.

Seja rápido, mas preciso, ao dissecar para manter as amostras destinadas ao isolamento de RNA livres de RNS. Após o procedimento de dissecção, o western blot pode ser usado como uma alternativa à imunocoloração para avaliar as mudanças na expressão de proteínas entre diferentes genótipos. A criação de mosaicos genéticos e a análise deles com os procedimentos descritos permitem a pesquisa sobre mutações letais e sobre os mecanismos da corporação oncogênica e Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar tecidos em mosaico do disco antenal do olho e cérebros de larvas de terceiro ínstar e como processá-los para imunocoloração, visualização de transgênicos e atividade de porta, extração de RNA e quantificação da invasividade.

Lembre-se de que o PFA, bem como o fenol-clorofórmio e o DAPI, são altamente tóxicos e que precauções como o uso de luvas e roupas de proteção devem sempre ser tomadas ao trabalhar com esses agentes.