Name: Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Aprenda a quantificar eventos de tráfego vesicular endocítico em células vivas de levedura usando pHluorin e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar mutações e alterações na expressão proteica.

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Gostaríamos de agradecer a Gero Miesenböck e Tim Ryan por compartilharem o cDNA de pHluorina usado para gerar reagentes neste estudo, Nathan Wright, Joanna Poprawski e Lydia Nyasae pela excelente assistência técnica, membros do laboratório de Wendland por discussões úteis e Michael McCaffery e Erin Pryce do Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) por aconselhamento e assistência com microscopia e citometria de fluxo. Este trabalho foi apoiado por doações do National Institutes of Health (para BW, GM60979) e da National Science Foundation (para BW, MCB 1024818). K.W. foi apoiado em parte por uma bolsa de treinamento do National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. foi apoiado por fundos de desenvolvimento do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade de Duquesne e da bolsa CAREER da National Science Foundation 553143.

<ol><li>Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+for+association+of+receptors%2C+adaptors%2C+and+actin+during+endocytic+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization.</a> Cell. 115 (4), 475-487 (2003).</li>
<li>Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+design+for+the+clathrin-+and+actin-mediated+endocytosis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery.</a> Cell. 123 (2), 305-320 (2005).</li>
<li>Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+yeast+for+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis.</a> Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).</li>
<li>Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Precision+Survey+of+the+Molecular+Dynamics+of+Mammalian+Clathrin-Mediated+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis.</a> PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).</li>
<li>Hansen, C. G., Nichols, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis.</a> J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).</li>
<li>Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+proteins+are+delivered+to+recycling+endosomes+via+a+distinct+cdc42-regulated%2C+clathrin-independent+pinocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway.</a> Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).</li>
<li>Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aluminum+fluoride+stimulates+surface+protrusions+in+cells+overexpressing+the+ARF6+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase.</a> J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).</li>
<li>Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+a+novel+clathrin-independent+endocytic+pathway+in+yeast+that+depends+on+Rho1+and+formin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin.</a> J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).</li>
<li>Prosser, D. C., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+roles+for+yeast+Rho1+and+mammalian+RhoA+GTPases+in+clathrin-independent+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Small+GTPases%22%5BJournal%5D)">Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis.</a> Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).</li>
<li>Kohno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bni1p+implicated+in+cytoskeletal+control+is+a+putative+target+of+Rho1p+small+GTP+binding+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).</li>
<li>Evangelista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Yeast+Formin+Linking+Cdc42p+and+the+Actin+Cytoskeleton+During+Polarized+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis.</a> Science. 276 (5309), 118-122 (1997).</li>
<li>Kübler, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+fimbrin+are+required+for+the+internalization+step+of+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast.</a> EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).</li>
<li>Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Related+Ubiquitin-Ligase+Adaptors+Regulate+Endocytosis+and+Protein+Turnover+at+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface.</a> Cell. 135 (4), 714-725 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-like+proteins+mediate+ubiquitination+and+endocytosis+of+the+yeast+metal+transporter+Smf1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1.</a> EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).</li>
<li>Nikko, E., Pelham, H. R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin-Mediated+Endocytosis+of+Yeast+Plasma+Membrane+Transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters.</a> Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).</li>
<li>O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Deoxyglucose+impairs+Saccharomyces+cerevisiae+growth+by+stimulating+Snf1-regulated+and+%CE%B1-arrestin-mediated+trafficking+of+hexose+transporters+1+and+3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3.</a> Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).</li>
<li>O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calcineurin-dependent+switch+controls+the+trafficking+function+of+%CE%B1-arrestin+Aly1%2FArt6%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6.</a> J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).</li>
<li>Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B1-Arrestins+participate+in+cargo+selection+for+both+clathrin-independent+and+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis.</a> J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).</li>
<li>Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+2+receptors+and+detergent-resistant+membrane+domains+define+a+clathrin-independent+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway.</a> Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).</li>
<li>Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+endocytosis+with+cytoplasmic+pHluorin+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras.</a> Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).</li>
<li>Bokman, S. H., Ward, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaturation+of+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Renaturation of green-fluorescent protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+pHluorins+for+Optical+Measurements+of+Presynaptic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity.</a> Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+sorting+into+the+multivesicular+body+pathway+requires+the+function+of+a+conserved+endosomal+protein+sorting+complex%5BTitle%5D)+AND+%22ESCRT-I.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex.</a> ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).</li>
<li>Longtine, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+modules+for+versatile+and+economical+PCR-based+gene+deletion+and+modification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Curr+Prot+Mol+Biol%22">Curr Prot Mol Biol</a>. , John Wiley & Sons. New York. (1991).</li>
<li>Urbanowski, J. L., Piper, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+sorts+proteins+into+the+intralumenal+degradative+compartment+of+the+late-endosome%2Fvacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole.</a> Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).</li>
<li>Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Dynamics+of+Clathrin+and+Its+Adaptor-Dependent+Recruitment+to+the+Actin-Based+Endocytic+Machinery+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast.</a> Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).</li>
<li>Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+Epsin%2FYap180+adaptors+and+the+scaffolds+Ede1%2FPan1+is+required+for+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis.</a> Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).</li>
<li>Aguilar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsin+N-terminal+homology+domains+perform+an+essential+function+regulating+Cdc42+through+binding+Cdc42+GTPase-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).</li>
<li>Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+methionine+uptake+in+Saccharomyces+cerevisiae+reveals+a+new+family+of+amino+acid+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases.</a> J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).</li>
<li>Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescence-activated+cell+sorter-based+screen+for+yeast+endocytosis+mutants+identifies+a+yeast+homologue+of+mammalian+eps15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15.</a> J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).</li>
<li>Alvaro, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Alpha-Arrestins+Negatively+Regulate+Saccharomyces+cerevisiae+Pheromone+Response+by+Down-Modulating+the+G-Protein-Coupled+Receptor+Ste2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2.</a> Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).</li>
<li>Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Induced+Ubiquitylation+and+Endocytosis+of+Yeast+Amino+Acid+Permeases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases.</a> Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).</li>
<li>Becuwe, M., Léon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+control+of+transporter+endocytosis+and+recycling+by+the+arrestin-related+protein+Rod1+and+the+ubiquitin+ligase+Rsp5%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endosomal+Sorting+Complex+ESCRT-II+Mediates+the+Assembly+and+Architecture+of+ESCRT-III+Helices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices.</a> Cell. 151 (2), 356-371 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+Isoform-Selective+Vps21%2FRab5+Signaling+at+Endolysosomal+Organelles+by+Msb3%2FGyp3%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3.</a> Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).</li>
<li>Nickerson, D. P., Merz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUCID%3A+A+Quantitative+Assay+of+ESCRT-Mediated+Cargo+Sorting+into+Multivesicular+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies.</a> Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).</li>
<li>Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endocytosis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Yeast endocytosis assays.</a> Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).</li>
<li>Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+uracil+permease%2C+a+polytopic+yeast+plasma+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein.</a> Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).</li>
<li>Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Function+of+the+Endocytic+Scaffold+Protein+Pan1p+Depends+on+Multiple+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains.</a> Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).</li>
<li>Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+dynamics+of+receptor-mediated+endocytic+trafficking+in+budding+yeast+revealed+by+using+fluorescent+alpha-factor+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Aplicações de pHluorin para quantificação de eventos de endocitose em células de levedura faz uso de cargas transmembranares em que o marcador fluorescente está fundido com a cauda citoplasmática da proteína (Figura 1A). Para os ensaios aqui descritos, as cargas são fluorescentes brilhantemente quando a etiqueta pHluorin é exposta a ambientes neutros, mas tornar-se temperada, quando a etiqueta encontra pHluorin condições ácidas. Assim, uma carga endocítica pHluorin-etiquetado é facilmente detectada na f...

tráfico vesicular desempenha um papel importante na manutenção e função identidade organelo em células eucariotas, e é um mecanismo fundamental para a regulação da composição de proteína e membrana de compartimentos celulares individuais. Na membrana plasmática, a fusão de vesículas exocíticos proporciona novas proteínas e membranas à superfície da célula, ao passo que as vesículas gerados através de endocitose remover membrana e proteínas a partir da superfície para a reciclagem ou o direccionamento para o lisossoma subsequente. Assim, é importante para a endocitose a absorção de nutrientes e para as respostas para o ambiente extracelular. A exocitose e endocitose são equilibradas para regular a área de superfície da membrana de plasma, e para permitir a rotatividade de proteínas danificadas. Os estudos em células de levedura e de mamífero ter identificado um grande número de proteínas envolvidos em endocitose, bem como a múltiplas vias de endocitose que promovem a internalização de cargas específicas ou que agem em resposta a uma variedade de encondições tações. A via mais bem estudado é endocitose mediada por clatrina (CME), em que a proteína clatrina e acessórios citosólico em montar uma estrutura de revestimento para estabilizar a vesícula endocítica nascente. Experiências no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae produziram informações importantes sobre a dinâmica ea ordem de recrutamento para muitas proteínas de endocitose 1-3. Notavelmente, a maquinaria CME é altamente conservada ao longo da evolução de tal modo que a maioria das proteínas relacionadas com o CME em levedura tem ortólogos humanos; Assim, a brotação levedura tem sido uma ferramenta importante para a compreensão dos mecanismos de endocitose que são conservados em eucariotas superiores. Por exemplo, estudos utilizando levedura de germinação determinado que a formação e maturação de estruturas CME (referidas manchas de actina como corticais em levedura) envolve o recrutamento sequencial de muitas proteínas, começando com clatrina e proteínas adaptadoras de ligação de carga, seguido de recrutamento de acessório endocítica adicional proteínas,activação da polimerização de actina Arp2 / 3-mediada, e recrutamento de proteínas envolvidas em 1,2 vesícula cisão. Recrutamento de proteínas para máquinas CME cortical manchas de actina é um processo altamente ordenada e estereotipada, e a ordem exacta do recrutamento para muitas proteínas foi estabelecida com respeito a outros componentes da maquinaria de CME. Importante, estudos mais recentes confirmaram uma ordem semelhante de recrutamento de proteínas CME em depressões revestidas de clatrina-4 em células de mamífero. Além CME, muitos tipos de células possuem um ou mais endocítica (CIE) vias independentes de clatrina que se baseiam em mecanismos alternativos para promover a formação de vesículas e internalização da membrana do plasma de 5-7. Em leveduras, que recentemente identificaram um caminho CIE que utiliza a pequena GTPase Rho1 e sua ativação guanina fator de troca de nucleotídeos (GEF), Rom1 8,9. Rho1 activa o formin Bni1 para promover a polimerização da actina 10,11, o que é necessário para esta forma de endocitose independente de clatrina em levedura 12. Além disso, a família α-arrestina de proteínas recrutar o ubiquitina ligase Rsp5 para promover ubiquitination carga e internalização posterior pelo CME 13-17, e também promover a internalização de carga pela via CIE, possivelmente através de interacção directa com proteínas envolvidas no CIE 18. Uma variedade de vias CIE também existe nas células dos mamíferos, incluindo as vias independentes de clatrina e fagocíticas que dependem do ortólogo Rho1, RhoA 9,19. O papel de RhoA em CIE de mamífero é mal compreendida; Assim, os estudos em levedura de brotamento pode fornecer insights mecanicistas adicionais que são aplicáveis ​​a CIE mamíferos. quantificação precisa dos acontecimentos de endocitose pode fornecer informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas na regulação endocitose, e pode revelar os efeitos das mutações no internalização carga ou progressioN através da via endocítica. Para este efeito, métodos bioquímicos podem ser utilizados para monitorar a absorção do ligando ou para medir as taxas de degradação de proteínas de carga de endocitose. Em células vivas, a fusão da proteína verde fluorescente (GFP) e suas variantes para cargas de interesse permite a visualização direta de transporte de carga. No entanto, cargas GFP são de uso limitado para a quantificação de endocitose porque GFP é resistente à degradação no lisossoma (ou vacúolo em levedura). Além disso, a GFP fluorescente é apenas parcialmente sensível a mudanças no pH, e permanece detectável dentro do vacúolo lúmen 20,21. Consequentemente, a fluorescência do marcador GFP persistir no vacúolo longo após o restante da carga foi degradada, e quantificação baseado em células inteiras de intensidade de carga podem ser imprecisas devido à fluorescência da GFP longo prazo no vacúolo. A fim de ultrapassar os inconvenientes da fluorescência de GFP vacuolar, que anteriormente feito uso de pH supereclipticluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que fluoresce intensamente a pH neutro, mas perde fluorescência em ambientes ácidos, tais como o lúmen do vacúolo / lisossomo 20,22,23. Colocação de uma etiqueta pHluorin na cauda citoplasmática de cargas de endocitose permite a visualização das cargas na membrana plasmática e em endossomas precoces, onde a etiqueta pHluorin permanece exposta ao citoplasma (Figura 1A). Já endossomos maduros, o complexo endossomal triagem necessária para embalagens de transporte (ESCRT) máquinas cargas localizadas de superfície em vesículas que brotam no lúmen do endossomo, gerando corpos multivesiculares (MVBs) 24. Para cargas que foram incorporados em vesículas internas MVB, a tag pHluorin faces para o lúmen das vesículas. MVB vesículas internas são acidificada; Assim, cargas pHluorin-tag perder sua fluorescência no início endossomas à medida que amadurecem em MVBs 20. fusão subsequente da MVB com o vacúolo oferece o conteúdo MVB luminaispara a degradação, tags e pHluorin permanecem extinta no ambiente ácido do lúmen do vacúolo. Este artigo fornece descrições detalhadas dos ensaios de endocitose quantitativos usando cargas com marcas pHluorin citoplasmáticos em levedura. As estirpes que expressam cargas pHluorin-tag podem ser utilizados em ensaios cinéticos e / ou ponto de extremidade, em função das propriedades e o comportamento de tráfico da carga específica. Além disso, algumas cargas pHluorin-tag são passíveis de métodos de análise de alto rendimento, incluindo citometria de fluxo. Importante, a tag pHluorin é um instrumento versátil para estudar eventos de endocitose nas células vivas, permitindo a quantificação de endocitose e comparação da função endocítica no tipo selvagem e estirpes mutantes.

<table><tbody><tr><td>Adenina</td><td>Sigma</td><td>A8626-25G</td><td>Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque</td></tr><tr><td>Bacto-ágar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>Uso para preparação de mídia de placa</td></tr><tr><td>BD Difco Yeast Nitrogen Base (sem aminoácidos)</td> <td>BD</td><td>291920</td><td>Uso para preparação de mídia líquida e de placa</td></tr><tr><td>Concanavalina A</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td>Uso para revestimento de câmara slides</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher</td><td>BP350-1</td><td>Uso para preparação de meios líquidos e em placas</td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Fisher</td><td>BP382-100</td><td>Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Acros</td><td>125121000</td><td>Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque</td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Fisher</td><td>BP386-100</td><td>Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque</td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque</td></tr><tr><td>L-Triptofano</td><td>Fisher</td><td>BP395-100</td><td>Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque</td></tr><tr><td>L-Tirosina</td><td>Acros</td><td>140641000</td><td>Uso para preparação de mistura de aminoácidos</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8 poços)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>Uso para ensaios cinéticos e finais de internalização de Mup1-pHluorin</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Uso para preparação de mistura de aminoácidos e solução estoque</td></tr><tr><td>Microscópio invertido Axiovert 200</td><td>Carl Zeiss</td><td>Custom Build</td><td></td></tr><tr><td>100X/1.4 Plan-Apochromat Lente Objetiva de Imersão em Óleo Carl</td><td>Zeiss A objetiva Carl Zeiss</td><td></td><td>deve ser 100X, 1.4NA ou superior</td></tr><tr><td>Sensicam</td><td>Cooke Corporation</td><td></td><td>A câmera deve ter faixa dinâmica de 12 bits ou superior</td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q Fonte de iluminação</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Slidebook 5</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ National</td><td>Institutes of Health</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

aplicações de phluorin para quantitative, kinetic e de alta capacidade: análise de endocitose em brotamento yeast

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

A proteína fluorescente verde (GFP) e suas variantes são ferramentas amplamente utilizado para estudar a localização de proteínas e na dinâmica de eventos, tais como a remodelação do citoesqueleto e tráfico vesicular em células vivas. Metodologias quantitativas utilizando fusões quiméricas GFP foram desenvolvidos para muitas aplicações; No entanto, a GFP é um tanto resistente à proteólise, assim, a sua fluorescência persistir no lisossoma / vacúolo, o que pode dificultar a quantificação de tráfico de carga na via endocítica. Um método alternativo para a quantificação de endocitose e pós-endocíticas eventos de tráfico faz uso de superecliptic pHluorin, uma variante sensível ao pH da GFP que é extinta em ambientes ácidos. fusão quimérica de pHluorin à cauda citoplasmática de transmembrana de carga proteínas resulta em um amortecimento de fluorescência após a incorporação da carga em corpos multivesiculares (MVBs) e entrega para o lúmen lisossoma / vacúolo. Assim, extinção da fluorescência vacuolar facilita quantificatião de endocitose e eventos precoces na via endocítica. Este artigo descreve métodos que utilizam cargas pHluorin-marcadas para quantificação de endocitose via microscopia de fluorescência, bem como ensaios de base populacional utilizando citometria de fluxo.

Localização de estado estacionário e quantificação da proteína carga endocítica constitutivamente internalizado Ste3 Para demonstrar que as cargas pHluorin-tag pode ser utilizada para a quantificação de endocitose em células vivas, a localização de GFP quimérico e fusões pHluorin com a cauda citoplasmática de terminal-C de Ste3, o receptor de feromonas do factor A em levedura, foram comparados. Ste3 é um recep...

A quantificação precisa dos eventos de tráfego vesicular geralmente fornece informações importantes sobre os papéis de proteínas específicas e os efeitos das mutações. Este artigo apresenta métodos para o uso da pHluorina supereclíptica, uma variante de GFP sensível ao pH, como ferramenta para quantificação de eventos endocíticos em células vivas usando microscopia de fluorescência quantitativa e citometria de fluxo.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar eventos de tráfego vesicular na via endocítica de células vivas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do tráfego vesicular, como a forma pela qual mutações ou alterações na expressão proteica afetam as taxas e a eficiência dos eventos de tráfego. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a quantificação direta do tráfego endocítico em células vivas mediante a medição da intensidade de proteínas de carga marcadas com fluorescência.Após preparar as soluções e o meio de acordo com o protocolo descrito no texto, inocular duas a três colônias de células de levedura em cinco mililitros de meio YNB, sem nutrientes adicionais para manutenção da seleção de plasmídeo. Crescer os cultivos a 30 graus Celsius com agitação por 16 a 24 horas. Aproximadamente três horas antes da aquisição de imagens, medir a DO 600 de cada cultura de overnight.Em seguida, prepare diluições de cinco mililitros com uma DO 600 de 0,35 a 0,4 em meio YNB, sem nutrientes adicionais para manutenção do plasmídeo, e cultive a 30 graus Celsius com agitação durante três horas. Durante a incubação, pré-equipe a câmara ambiental do microscópio ou o estágio aquecido a 30 graus Celsius. Após preparar uma lâmina de oito poços de vidro tratada com câmara para imagem conforme o protocolo descrito no texto, adicione 200 microlitros de meio YNB sem nutrientes adicionais para seleção do plasmídeo a cada poço.Quando as culturas estiverem prontas, transfira um mililitro para um tubo de microcentrífuga e faça a pelagem das células a 8.000 RPM por dois minutos. Em seguida, remova 975 microlitros do sobrenadante. Re-suspenda o pellet celular no sobrenadante remanescente.Em seguida, adicione 2,5 µL da suspensão celular no centro de cada poço da placa de oito poços. Pipete para cima e para baixo para dispersar as células e deixe as células sedimentarem por cinco a 10 minutos. Coloque a lâmina com câmara em um microscópio de fluorescência invertido equilibrado a 30 graus Celsius.Em seguida, utilize iluminação em campo claro para localizar um campo de células. Adicione 50 microlitros de meio YNB pré-aquecido contendo 100 microgramas por mililitro de metionina aos 200 microlitros de meio no poço, obtendo uma concentração final de metionina de 20 microgramas por mililitro. Deixe as células equilibrarem por dois minutos antes de iniciar a aquisição de imagens.Em seguida, imediatamente antes da aquisição de imagens, ajuste o microscópio ao plano focal desejado. Adquira imagens de GFP em campo claro ou DIC em intervalos de 5 minutos, durante 45 a 60 minutos. Utilize parâmetros de aquisição idênticos para todas as imagens dentro de uma série temporal.Consulte o protocolo em texto para obter detalhes adicionais. Quantifique a intensidade de fluorescência de células individuais em cada ponto temporal e expresse os valores como uma porcentagem da intensidade inicial da primeira imagem. Após exportar as imagens de acordo com o protocolo em texto no ImageJ, abra os arquivos no menu arquivo usando a opção Abrir.Utilize a imagem de fluorescência para quantificação e a imagem de campo claro ou DIC como referência para identificar a localização das células. Exclua células mortas, caso estejam presentes, que aparecem mais escuras do que as células vivas quando visualizadas por DIC e autofluorescem no canal GFP. Para imagens com fundo irregular, no menu Processar, escolha o algoritmo de subtração de fundo e selecione a configuração padrão.Uma vez que as imagens tenham sido adquiridas, é importante realizar a subtração do fundo antes de prosseguir com o procedimento de quantificação. Esta etapa é particularmente importante porque o sinal de fundo poderia, de outra forma, mascarar ou atenuar as diferenças entre as amostras. Utilizando a ferramenta de seleção manual, contorne uma célula, certificando-se de incluir toda a célula, mas com a menor área possível fora dela.Em seguida, no menu Analisar, utilize a função definir medidas para medir a área, a densidade integrada e o valor médio de cinza. Abra o Gerenciador de ROI clicando em Analisar, depois em Ferramentas. Na janela do Gerenciador de ROI, clique no botão Adicionar para inserir a região destacada como uma nova ROI.Repita o contorno e a coleta de medidas para as demais células da imagem, excluindo quaisquer células mortas ou células que toquem a borda da imagem. Salve as ROI selecionadas como um arquivo zip clicando no botão medir, o qual exibirá os valores medidos em uma nova janela. Em seguida, clique no botão mais e exporte todas as medidas para uma planilha ou software de análise estatística.Inocule duas a três colônias de células de levedura e 0,5 mililitros de meio YNB, sem nutrientes adicionais para manutenção da seleção de plasmídeo. Incube as células em rotação a 30 graus Celsius por 16 a 24 horas. Adicione um mililitro de meio YNB sem nutrientes adicionais para manutenção de plasmídeo e cultive por mais três horas.Em seguida, transfira um mililitro de células para cada um de dois tubos cónicos de cinco mililitros com fundo redondo. Então, adicione 0,25 mililitros de meio YNB Met ao primeiro tubo e 0,25 mililitros de meio YNB contendo 100 microgramas por mililitro de metionina ao segundo tubo, para uma concentração final de 20 microgramas por mililitro. Para um grande número de amostras, adicione a metionina em etapas escalonadas para acomodar o tempo necessário para a análise dos dados.Nosso citômetro de fluxo pode medir até 40 amostras por corrida. Adicionamos metionina em lotes. Oito amostras a cada cinco minutos.Isso garante que todas as amostras sejam medidas entre 45 e 50 minutos após a adição de metionina. Incube as células por 45 minutos. Em seguida, analise as células por citometria de fluxo, selecionando o espalhamento para a frente ou FS como medida do tamanho celular e mapeando uma intensidade de fluorescência em fluxo proveniente de um filtro FITC como medida da internalização de carga.Durante a incubação de 45 minutos, use os botões deslizantes para ajustar a voltagem dos canais FS e FITC a fim de otimizar a detecção na faixa de tamanho e intensidade de fluorescência das células de levedura utilizadas. Meça o FS e a intensidade de fluorescência de 10.000 células de cada condição. Usando a configuração de alta vazão, gere um gráfico de dispersão de FS versus intensidade de fluorescência clicando em adicionar gráfico.Em seguida, selecione FITC para o eixo x e FS para o eixo y e represente graficamente 1000 pontos. Utilizando a função de delimitação e a condição de tipo selvagem Met, defina uma porta vertical de modo que aproximadamente 5% das células mais brilhantes fiquem à direita da porta. Utilize essa delimitação para todas as outras condições do experimento.Como mostrado aqui, a microscopia com lapso de tempo de células foi realizada em intervalos de cinco minutos na ausência ou presença de metionina para monitorar a internalização de Mup1 marcado com GFP ou flúor e alterações na fluorescência. Conforme esperado, Mup1 marcado com GFP e flúor permaneceu na membrana plasmática na ausência de metionina. Em contraste, células analisadas na presença de metionina mostraram esgotamento progressivo do sinal fluorescente na superfície celular, compatível com a internalização da carga.No entanto, a cinética da fluorescência perdida na presença de metionina foi retardada nas células Mup1 GFP em comparação com as células pHlourin Mup1. Esses gráficos de dispersão comparam a intensidade de fluorescência de células selvagens ou de quatro células delta ENTH1 na presença ou ausência de metionina após a aplicação de um gate vertical. 4% das células selvagens com metionina foram contidas no lado direito do gate, correspondente às células mais brilhantes da população, enquanto 65% das células selvagens não tratadas foram contidas no gate.Em contraste, as quatro células delta ENTH1 não mostraram diferença na distribuição de células brilhantes versus fracas, o que é consistente com um defeito na endocitose. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de escalonar os horários de início ao realizar experimentos simultâneos, de modo que os dados do ponto final possam ser coletados após o mesmo tempo de tratamento para todas as amostras.Após este procedimento, outros métodos, como telas genéticas florais, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais fatores novos contribuem para o tráfego vesicular. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área do tráfego vesicular explorarem aspectos da atrofia de endossomos, bem como uma via recém-descoberta, independente de clatrina e ácida, em leveduras em brotamento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar cargas do tipo florentina para quantificar eventos endocíticos em células vivas.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em...

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

Aqui apresentamos um protocolo para quantificar a fagocitose de partículas fluorescentes por linhagem celular de macrófagos aderentes usando um método fluorométrico. Este método facilita uma quantificação de alto rendimento da internalização de partículas, bem como a polimerização de actina resultante.

Técnica High Throughput Fluorometric de Avaliação da macrófago fagocitose e actina Polimerização

Rotular o domínio extracelular de uma proteína de membrana com um fluoróforo sensível ao pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite a localização subcelular, expressão, e o tráfico de ser determinado. proteínas imagiologia SEP-rotulado com microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRFM) permite a quantificação dos níveis da proteína na membrana do RE e periférico plasma.

Utilizando Receptores pHluorin-tag para monitorar subcelular Localização e Tráfico

Budding levedura é um modelo vantajoso para o estudo da dinâmica dos microtúbulos in vivo, devido às suas poderosas da genética e a simplicidade do seu citoesqueleto de microtúbulos. O protocolo a seguir descreve como transformar e cultura de células de levedura, adquirir imagens de microscopia confocal, e quantitativamente analisar a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura viva.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Efferocytosis, a remoção fagocitária das células apoptóticas, é necessário para manter a homeostase e é facilitado por receptores e vias de sinalização que permitem o reconhecimento, a duração e internalização de pilhas apoptotic. Neste documento, apresentamos um protocolo de microscopia de fluorescência para a quantificação dos efferocytosis e a atividade das vias de sinalização de efferocytic.

Quantificação de Efferocytosis por microscopia de fluorescência de célula única

A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

Este protocolo detalha dois métodos de parada do ciclo celular de levedura e liberação opcional, e elabora o uso de microscopia de fluorescência para estudar processos dependentes do ciclo celular em S. cerevisiae.

Manipulação e Análise de Processos Dependentes do Ciclo Celular em Leveduras de Brotamento

Aprenda a quantificar eventos de tráfego vesicular endocítico em células vivas de levedura usando pHluorin e microscopia de fluorescência. Este método permite analisar mutações e alterações na expressão proteica.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

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