Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

O objetivo geral deste procedimento é quantificar eventos de tráfego vesicular na via endocítica de células vivas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do tráfego vesicular, como a forma pela qual mutações ou alterações na expressão proteica afetam as taxas e a eficiência dos eventos de tráfego. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a quantificação direta do tráfego endocítico em células vivas mediante a medição da intensidade de proteínas de carga marcadas com fluorescência.

Após preparar as soluções e o meio de acordo com o protocolo descrito no texto, inocular duas a três colônias de células de levedura em cinco mililitros de meio YNB, sem nutrientes adicionais para manutenção da seleção de plasmídeo. Crescer os cultivos a 30 graus Celsius com agitação por 16 a 24 horas. Aproximadamente três horas antes da aquisição de imagens, medir a DO 600 de cada cultura de overnight.

Em seguida, prepare diluições de cinco mililitros com uma DO 600 de 0,35 a 0,4 em meio YNB, sem nutrientes adicionais para manutenção do plasmídeo, e cultive a 30 graus Celsius com agitação durante três horas. Durante a incubação, pré-equipe a câmara ambiental do microscópio ou o estágio aquecido a 30 graus Celsius. Após preparar uma lâmina de oito poços de vidro tratada com câmara para imagem conforme o protocolo descrito no texto, adicione 200 microlitros de meio YNB sem nutrientes adicionais para seleção do plasmídeo a cada poço.

Quando as culturas estiverem prontas, transfira um mililitro para um tubo de microcentrífuga e faça a pelagem das células a 8.000 RPM por dois minutos. Em seguida, remova 975 microlitros do sobrenadante. Re-suspenda o pellet celular no sobrenadante remanescente.

Em seguida, adicione 2,5 µL da suspensão celular no centro de cada poço da placa de oito poços. Pipete para cima e para baixo para dispersar as células e deixe as células sedimentarem por cinco a 10 minutos. Coloque a lâmina com câmara em um microscópio de fluorescência invertido equilibrado a 30 graus Celsius.

Em seguida, utilize iluminação em campo claro para localizar um campo de células. Adicione 50 microlitros de meio YNB pré-aquecido contendo 100 microgramas por mililitro de metionina aos 200 microlitros de meio no poço, obtendo uma concentração final de metionina de 20 microgramas por mililitro. Deixe as células equilibrarem por dois minutos antes de iniciar a aquisição de imagens.

Em seguida, imediatamente antes da aquisição de imagens, ajuste o microscópio ao plano focal desejado. Adquira imagens de GFP em campo claro ou DIC em intervalos de 5 minutos, durante 45 a 60 minutos. Utilize parâmetros de aquisição idênticos para todas as imagens dentro de uma série temporal.

Consulte o protocolo em texto para obter detalhes adicionais. Quantifique a intensidade de fluorescência de células individuais em cada ponto temporal e expresse os valores como uma porcentagem da intensidade inicial da primeira imagem. Após exportar as imagens de acordo com o protocolo em texto no ImageJ, abra os arquivos no menu arquivo usando a opção Abrir.

Utilize a imagem de fluorescência para quantificação e a imagem de campo claro ou DIC como referência para identificar a localização das células. Exclua células mortas, caso estejam presentes, que aparecem mais escuras do que as células vivas quando visualizadas por DIC e autofluorescem no canal GFP. Para imagens com fundo irregular, no menu Processar, escolha o algoritmo de subtração de fundo e selecione a configuração padrão.

Uma vez que as imagens tenham sido adquiridas, é importante realizar a subtração do fundo antes de prosseguir com o procedimento de quantificação. Esta etapa é particularmente importante porque o sinal de fundo poderia, de outra forma, mascarar ou atenuar as diferenças entre as amostras. Utilizando a ferramenta de seleção manual, contorne uma célula, certificando-se de incluir toda a célula, mas com a menor área possível fora dela.

Em seguida, no menu Analisar, utilize a função definir medidas para medir a área, a densidade integrada e o valor médio de cinza. Abra o Gerenciador de ROI clicando em Analisar, depois em Ferramentas. Na janela do Gerenciador de ROI, clique no botão Adicionar para inserir a região destacada como uma nova ROI.

Repita o contorno e a coleta de medidas para as demais células da imagem, excluindo quaisquer células mortas ou células que toquem a borda da imagem. Salve as ROI selecionadas como um arquivo zip clicando no botão medir, o qual exibirá os valores medidos em uma nova janela. Em seguida, clique no botão mais e exporte todas as medidas para uma planilha ou software de análise estatística.

Inocule duas a três colônias de células de levedura e 0,5 mililitros de meio YNB, sem nutrientes adicionais para manutenção da seleção de plasmídeo. Incube as células em rotação a 30 graus Celsius por 16 a 24 horas. Adicione um mililitro de meio YNB sem nutrientes adicionais para manutenção de plasmídeo e cultive por mais três horas.

Em seguida, transfira um mililitro de células para cada um de dois tubos cónicos de cinco mililitros com fundo redondo. Então, adicione 0,25 mililitros de meio YNB Met ao primeiro tubo e 0,25 mililitros de meio YNB contendo 100 microgramas por mililitro de metionina ao segundo tubo, para uma concentração final de 20 microgramas por mililitro. Para um grande número de amostras, adicione a metionina em etapas escalonadas para acomodar o tempo necessário para a análise dos dados.

Nosso citômetro de fluxo pode medir até 40 amostras por corrida. Adicionamos metionina em lotes. Oito amostras a cada cinco minutos.

Isso garante que todas as amostras sejam medidas entre 45 e 50 minutos após a adição de metionina. Incube as células por 45 minutos. Em seguida, analise as células por citometria de fluxo, selecionando o espalhamento para a frente ou FS como medida do tamanho celular e mapeando uma intensidade de fluorescência em fluxo proveniente de um filtro FITC como medida da internalização de carga.

Durante a incubação de 45 minutos, use os botões deslizantes para ajustar a voltagem dos canais FS e FITC a fim de otimizar a detecção na faixa de tamanho e intensidade de fluorescência das células de levedura utilizadas. Meça o FS e a intensidade de fluorescência de 10.000 células de cada condição. Usando a configuração de alta vazão, gere um gráfico de dispersão de FS versus intensidade de fluorescência clicando em adicionar gráfico.

Em seguida, selecione FITC para o eixo x e FS para o eixo y e represente graficamente 1000 pontos. Utilizando a função de delimitação e a condição de tipo selvagem Met, defina uma porta vertical de modo que aproximadamente 5% das células mais brilhantes fiquem à direita da porta. Utilize essa delimitação para todas as outras condições do experimento.

Como mostrado aqui, a microscopia com lapso de tempo de células foi realizada em intervalos de cinco minutos na ausência ou presença de metionina para monitorar a internalização de Mup1 marcado com GFP ou flúor e alterações na fluorescência. Conforme esperado, Mup1 marcado com GFP e flúor permaneceu na membrana plasmática na ausência de metionina. Em contraste, células analisadas na presença de metionina mostraram esgotamento progressivo do sinal fluorescente na superfície celular, compatível com a internalização da carga.

No entanto, a cinética da fluorescência perdida na presença de metionina foi retardada nas células Mup1 GFP em comparação com as células pHlourin Mup1. Esses gráficos de dispersão comparam a intensidade de fluorescência de células selvagens ou de quatro células delta ENTH1 na presença ou ausência de metionina após a aplicação de um gate vertical. 4% das células selvagens com metionina foram contidas no lado direito do gate, correspondente às células mais brilhantes da população, enquanto 65% das células selvagens não tratadas foram contidas no gate.

Em contraste, as quatro células delta ENTH1 não mostraram diferença na distribuição de células brilhantes versus fracas, o que é consistente com um defeito na endocitose. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a quatro horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de escalonar os horários de início ao realizar experimentos simultâneos, de modo que os dados do ponto final possam ser coletados após o mesmo tempo de tratamento para todas as amostras.

Após este procedimento, outros métodos, como telas genéticas florais, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como quais fatores novos contribuem para o tráfego vesicular. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área do tráfego vesicular explorarem aspectos da atrofia de endossomos, bem como uma via recém-descoberta, independente de clatrina e ácida, em leveduras em brotamento. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar cargas do tipo florentina para quantificar eventos endocíticos em células vivas.