Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

O objetivo geral deste procedimento é quantificar os eventos de tráfego vesicular na via endocítica das células vivas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do tráfego vesicular, como como a mutação ou as mudanças na expressão da proteína afetam as taxas e a eficiência dos eventos de tráfego. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a quantificação direta do tráfego endocítico e das células vivas, medindo a intensidade das proteínas de carga marcadas com fluorescência.

Após preparar as soluções e os meios de acordo com o protocolo de texto, inocular duas a três colônias de células de levedura em cinco mililitros de meio YNB, carentes de nutrientes adicionais para manter a seleção de plasmídeos. Cultive as culturas a 30 graus Celsius com agitação por 16 a 24 horas. Aproximadamente três horas antes da imagem, meça o OD 600 de cada cultura noturna.

Em seguida, prepare diluições de cinco mililitros em um OD 600 de 0,35 a 0,4 em meio YNB, sem nutrientes adicionais para manutenção do plasmídeo e cresça a 30 graus Celsius com agitação por três horas. Durante a incubação, pré-equilibre a câmara ambiental do microscópio ou o estágio aquecido a 30 graus Celsius. Depois de preparar um pote de vidro de oito poços tratado com lata e uma lâmina de câmara para imagens de acordo com o protocolo de texto, adicione 200 microlitros de meio YNB sem nutrientes adicionais para seleção de plasma a cada poço.

Quando as culturas estiverem prontas, transfira um mililitro para um tubo de microgeladeira e pelete as células a 8.000 RPM por dois minutos. Em seguida, remova 975 microlitros do sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular no sobrenadante restante.

Em seguida, coloque 2,5 microlitros da suspensão celular no centro de cada poço da placa de oito poços. Pipete para cima e para baixo para dispersar as células e permitir que as células assentem por cinco a 10 minutos. Coloque a lâmina da câmara em um microscópio de fluorescência invertido equilibrado a 30 graus Celsius.

Em seguida, use a iluminação de campo brilhante para localizar um campo de células. Adicione 50 microlitros de meio YNB pré-aquecido contendo 100 microgramas por mililitro de metionina aos 200 microlitros de meio no poço para obter uma concentração final de metionina de 20 microgramas por mililitro. Deixe as células se equilibrarem por dois minutos antes de iniciar a imagem.

Então, imediatamente antes da imagem, ajuste o microscópio para o plano focal desejado. Adquira GFP em imagens de campo claro ou DIC em intervalos de 5 minutos por 45 a 60 minutos. Usando parâmetros de aquisição idênticos para todas as imagens dentro de uma série temporal.

Consulte o protocolo de texto para obter detalhes adicionais. Quantifique a intensidade de fluorescência de células individuais em cada ponto de tempo e expresse os valores como uma porcentagem da intensidade inicial da primeira imagem. Depois de exportar imagens de acordo com o protocolo de texto na imagem j, abra os arquivos no menu de arquivos usando a opção Abrir.

Use a imagem de fluorescência para quantificação e a imagem de campo claro ou DIC como referência para identificar a localização das células. Exclua as células mortas presentes que parecem mais escuras do que as células vivas quando vistas por DIC e autofluorescem sob o canal GFP. Para imagens com fundo irregular no menu Processo, escolha o algoritmo de subtração de fundo e escolha a configuração padrão.

Uma vez adquiridas as imagens, é importante realizar a subtração do fundo antes de prosseguir com o procedimento de quantificação. Esta etapa é particularmente importante porque o sinal de fundo pode mascarar ou amortecer as diferenças entre as amostras. Usando a ferramenta de seleção à mão livre, contorne uma célula, certificando-se de incluir a célula inteira, mas o mínimo possível de área fora da célula.

Em seguida, no menu Analisar, use a função de conjunto de medidas para medir a área, a densidade integrada e o valor médio de cinza. Abra o ROI Manager clicando em Analisar e, em seguida, em Ferramentas. Na janela Gerenciador de ROI, clique no botão Adicionar para inserir a região realçada como um novo ROI.

Repita o contorno e a medição para as células restantes na imagem, excluindo quaisquer células mortas ou células que toquem a borda da imagem. Salve os ROIs selecionados como arquivo zip clicando no botão de medição que exibirá os valores medidos em uma nova janela. Em seguida, clique no botão mais e exporte todas as medições para uma planilha ou software de análise estatística.

Inocular duas a três colônias de células de levedura e 0,5 mililitros de meio YNB, sem nutrientes adicionais para manter a seleção de plasmídeos. Cultive células em um tambor de rolos a 30 graus Celsius por 16 a 24 horas. Adicione um mililitro de meio YNB sem nutrientes adicionais para manutenção do plasmídeo e cresça por mais três horas.

Em seguida, transfira um mililitro de células para cada um dos dois tubos de fundo redondo de cinco mililitros. Em seguida, adicione 0,25 mililitros de meio YNB Met ao primeiro tubo e 0,25 mililitros de meio YNB contendo 100 microgramas por mililitro de metionina ao segundo tubo para uma concentração final de 20 microgramas por mililitro. Para um grande número de amostras, escalone a adição de metionina para acomodar o tempo para análise de fatos.

Nosso citômetro de fluxo pode medir até 40 amostras por corrida. Adicionamos metionina em lotes. Oito amostras a cada cinco minutos.

Isso garante que todas as amostras sejam medidas entre 45 e 50 minutos após a adição de metionina. Incube as células por 45 minutos. Em seguida, analise as células por citometria de fluxo, selecionando dispersão direta ou FS como uma medida do tamanho da célula e mapeie uma intensidade de fluorescência de fluxo de um filtro FITC como uma medida de internalização de carga.

Durante a incubação de 45 minutos, use os botões deslizantes para ajustar a tensão dos canais FS e FITC para otimizar a detecção da faixa de tamanho e intensidade de fluorescência das células de levedura que estão sendo usadas. Meça a intensidade de fluorescência e FS para 10.000 células de cada condição. Usando a configuração de alta taxa de fluxo, gere um gráfico de dispersão de FS em relação à intensidade de fluorescência clicando em adicionar gráfico.

Em seguida, selecione FITC para o eixo x e FS para o eixo y e represente graficamente 1000 pontos. Usando a função de porta e a condição Met do tipo selvagem, atribua uma porta vertical de modo que aproximadamente 5% das células mais brilhantes caiam à direita da porta. Use esse gating para todas as outras condições no experimento.

Como mostrado aqui, a imagem de lapso de tempo das células foi realizada em intervalos de cinco minutos na ausência ou presença de metionina para monitorar a internalização de GFP ou Mup1 marcada com flúor e alterações na fluorescência. Como esperado, GFP e Mup1 marcado com flúor permaneceram na membrana plasmática na ausência de metionina. Em contraste, as células fotografadas na presença de metionina mostraram depleção progressiva do sinal fluorescente da superfície celular consistente com a internalização da carga.

No entanto, a cinética de fluorescência perdida na presença de metionina foi atrasada nas células Mup1 GFP em comparação com as células pHlourin Mup1. Esses gráficos de dispersão comparam a intensidade de fluorescência de células ENTH1 do tipo selvagem ou quatro células delta ENTH1 na presença ou ausência de metionina após a aplicação de uma porta vertical. 4% das células Met do tipo selvagem estavam contidas no lado direito do portão, correspondendo às células mais brilhantes da população, enquanto 65% das células do tipo selvagem não tratadas estavam contidas no portão.

Em contraste, as quatro células delta ENTH1 não mostraram diferença na distribuição de células brilhantes versus fracas, consistente com um defeito na endocitose. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a quatro horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de escalonar os horários de início da realização de experimentos simultâneos, para que os dados do ponto final possam ser coletados após o mesmo tempo de tratamento para todas as amostras.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como telas genéticas florais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais novos fatores contribuem para o tráfego vesicular. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do tráfego vesicular explorarem aspectos do atrito de endossomos, bem como uma via ácida e independente de clatrina recém-descoberta em leveduras em brotamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar cargas do tipo florent para quantificar eventos endocíticos em células vivas.